Abstract
Теломер дисфункция, вызванных потерей целостности генома и его сигнализации, связанных повреждения ДНК и КПП ответов хорошо зарекомендовавшие себя драйвера, которые вызывают тканей дегенерации в процессе старения. Рак, с заболеваемость значительно увеличивается с возрастом, характеризуется короткими длинами теломер и высокой активности теломеразы. Для изучения роли теломер дисфункции и теломеразы реактивации в процессе старения и рака, протокол показывает, как создать два мышиный индуцибельную теломеразы стучать в аллелей 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ) -inducible ТРЕТ-рецептора эстрогена (mTERT-ER) и Lox -Stopper-Lox ТРЕТ (LSL-mTERT). Протокол описывает процедуры, чтобы вызвать теломер дисфункции и активировать активность теломеразы в mTERT-ER и LSL-mTERT мышей в естественных условиях. Представительные данные показывают, что реактивация теломеразы может смягчить тканей дегенеративные фенотипы, вызванные теломер дисфункции. В Ordэ для определения влияния теломеразы реактивации на туморогенеза, мы получили простаты модель опухоли G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L и тимуса модель Т-клеточная лимфома G4 Банкоматы - / - mTERT ER / ER , Представительные данные показывают, что теломеразы реактивации фоне нестабильности генома, вызванной теломер дисфункции может значительно улучшить образование опухолей. Протокол также описывает процедуры, используемые для изоляции нервных стволовых клеток (НСК) с mTERT-ER и LSL-mTERT мышей и активировать активность теломеразы в НСК в пробирке. Представительные данные показывают, что реактивация теломеразы может увеличить возможность самообновления и нейрогенез в пробирке. Наконец, протокол описывает процедуры для выполнения теломер (FISH флуоресценции в гибридизация) как на FFPE мыши (фиксированные формалином и Parafплавник для встраиваемых систем) ткани мозга и метафазных хромосом культивируемых клеток.
Introduction
Теломераза представляет собой фермент, ответственный за поддержание теломер. Эти повторяющиеся последовательности на концах хромосом, которые защищают их целостность. Основные компоненты теломеразы холофермента являются обратной транскриптазы каталитической субъединицей (трет) и РНК-субъединицы (TERC), который служит в качестве шаблона для добавления теломерных повторов 1,2. В то время как правило, подавляется в дифференцированных соматических клеток теломераза обладает надежной активностью и играет важную роль в зародышевых клетках, раковых клеток и стволовых клеток.
mTERC и mTERT нокаут мышей обеспечивают большой в естественных условиях модельных систем для изучения функции теломеразы в обеих стволовых клеток и рака. MTERC и mTERT нокаут мышей (G1) не показывают каких-либо очевидных фенотипы в результате длительного резерва теломер у мышей 3. Тем не менее, последовательно скрещивания mTERC и mTERT мышах до конца поколения (G5-G6) в результатепрогрессивная эрозия теломер и в конечном итоге вызвало серьезные дегенерации высоко пролиферирующих тканях, 4. В конце поколения (G5-G6) mTERC - / - мышей бесплодны из-за высоких ставок апоптоза в истощения клеток семенников и зародышей. G5-G6 mTERC - / - мышей также демонстрируют дегенеративные фенотипы в сильно пролиферирующих тканях, в том числе костного мозга, кишечника и кожи из-за высоких темпов апоптоза и дефектной способности к самообновлению в ткани стебля / отсеков клеток-предшественников 4. Гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге поздней генерации mTERC - / - мышей потери экспозиция пролиферативного потенциала, нарушена Capability самообновление, усиливается апоптоз и, в конечном счете, функционально истощение 5,6. Кроме того, постепенно увеличивался апоптотических тел в кишечных крипт наблюдались в каждом последующем поколении G1-G6 mTERC - / - мышей 7,8. Tон вредное воздействие неблагополучных теломер, кажется, не должно быть ограничено высокими тканей оборота, так как и пролиферации взрослых стволовых нервных клеток в пробирке и нейрогенеза в естественных условиях были тяжелыми нарушениями в конце поколения (G4-G5) mTERC - / - мышей 9 , Роль теломеразы в стволовых клетках подкрепляется выводами, содержащимися в редкой человеческой генетическое заболевание дискератоз врожденной (DKC), которая в некоторых отношениях напоминает преждевременное старение 10,11. DKC вызывается мутациями в Terc, трет, и гены, которые кодируют dyskerin, основной теломеразы подразделения, и другие dyskerin белков, ассоциированных с 12. В среднем, теломеры у пациентов DKC короче, чем 99% от возраста из контрольной группы. Основным заболеваемость болезни происходит из-за апластическая анемия, которая вызвана дефектным поддержания кроветворных стволовых клеток. Другие аспекты заболевания, такие как устного лейкоплакии, дистрофия ногтей, психические retardatiна, яичек атрофии и легочных осложнений все предлагают нарушениями функции тканей стволовых клеток и клеток-предшественников 10, находки в хорошем согласии с тех, кто в конце поколения теломеразы нокаутом мышей. Пациенты DKC склонны к МДС и имеют повышенную распространенность злокачественных слизистой новообразований. Таким образом, дефицит теломеразы в человеческих пациентов повторяет недостатки функций стволовых клеток и опухоли предрасположенности, которые наблюдаются в теломераза мышей с поздней генерации.
Короткие теломеры и высокая активность теломеразы являются отличительными чертами рака. Как нормальные или предраковые клетки делятся, низкие или отсутствуют результаты активности теломеразы в конечном итоге эрозии теломер и активации клеточного контрольно-пропускных пунктов, аналогичных тем, спровоцированный двухцепочечной ДНК-брейков (ДР) 13. Как классических ДР, теломер дисфункция индуцирует р53 и связанного клеточные ответы, такие как старение и / или apoptosiš 14,15. По мутационной инактивации р53, сотовый езда на велосипеде и выживаемость клеток увеличены в клетках с теломер дисфункции, которая обеспечивает про-канцерогенными механизм мутатора характеризуется транслокаций и региональных амплификации и делеции 16,17. В то же время, по-прежнему теломер дисфункции и связанного угрожающие хромосомной нестабильности (даже в р53 нулевых клеток), по всей видимости ограничивают полную злокачественную прогрессию таких раковых заболеваний. Например, в конце поколения G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Арфа - / - мышей показали значительно снижает частоту лимфомы по сравнению с Ink4a / Арф нулевых мышей из-за теломер истощение. В другом исследовании, более продвинутые аденоматозных поражения в G4 mTERT - / - мин мыши APC были очень подавлен по сравнению с мин мышей APC из-за значительного торможения роста и апоптоза 18,19.Наблюдение, что теломеры дисфункции, вызванной геномной нестабильности ингибирует прогрессирование опухоли запрашивает предположение, что активация теломеразы может позволить злокачественную прогрессию частично подавлении геномной нестабильности до уровня, совместимого с жизнеспособности раковых клеток и / или нейтрализации p53-зависимые или Независимые механизмы КПП.
Для того чтобы изучить, может ли теломеразы реактивации остановить или даже обратный старения стволовых клеток, и может ли теломеразы реактивации способствовать туморогенез на фоне нестабильности генома, мы получили два индуцируемые мышиных аллели теломеразы. Первый 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ) -inducible ТРЕТ-рецептора эстрогена (mTERT-ER) слияние стучать в аллеля. При отсутствии 4-ОНТ, Мыши, гомозиготные по mTERT-ER (ER обозначены mTERT / ER) являются активность теломеразы дефицитных и поддерживать одни и те же цитогенетических и клеточные фенотипы, как и обычные mTERT или мTERC нокаут модель. По 4-OHT лечения, активность белка TERT-ER могут быть восстановлены до уровня, сравнимого с родным TERT белка 20, 21. Вторая аллель роман индуцибельный ТРЕТ стучать в аллеля, содержащего интронных LoxP-Пробка-LoxP кассету (LSL- mTERT); на Cre-опосредованного иссечение LSL, mTERT повторно выразил в рамках механизмов управления 22 эндогенная экспрессия.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все действия, описанные в этом протоколе были одобрены UT MD Anderson онкологическом центре.
1. Генерация mTERT-ER аллеля
- Представьте стучать в ориентации вектора, содержащего ERT2-LBD (лиганд-связывающий домен) вверх по течению и в рамке с геномной последовательности mTERT (Эксон 1 через интрона 2) и жидкий кислород - ПГК - Neo - Lox фрагмент (рис 1А) в ЭС клеток мыши с электропорации.
- Культура ЭС клеток в неомицина на 6-10 дней. Выбор неомицин-устойчивых клонов и расширяться в 48-луночных планшетах. Извлечение геномной ДНК с использованием коммерческого набора и подтвердить нокаут в аллеля Саузерн-блот.
- Вводите два ES линий с более чем 95% нормальных кариотипов в C57BL / 6 бластоцист с комплектом Микроманипуляция под инвертированным микроскопом. Имплантат бластоцисты в матку суррогатной матери 23. Mate в химеры высокого класса мужчины (70-90%), чтобы C57BL / 6-Фемужчины.
- Подтвердите генотипирование гетерозиготных mTERT-ERneo животных южной пятно.
- Mate гетерозиготном mTERT-ERneo животных и EIIa-CRE животных, чтобы удалить NeoR кассету. Mate гетерозиготных животных C57BL / 6 животных, по крайней мере, три раза, и еще в том классе гетерозиготных mTERT-ER животных для получения гомозиготности.
2. Генерация LSL-mTERT аллеля
- Представьте стук-за ориентации вектора, содержащего LoxP - тройной Пробка - Neo - LoxP фрагмент и последовательность геномной mTERT (между экзона 1 и интрона 2, рис 1б) в ЭС клетках мыши с электропорации 23.
- Культура ЭС клеток в неомицина на 6-10 дней. Выбор неомицин-устойчивых клонов и расширяться в 48-луночных планшетах. Извлечение геномной ДНК с использованием коммерческого набора и подтвердите стук-аллелей по южной блот 23.
- ИнджеКТ две ES линии с более чем 95% нормальных кариотипов в C57BL / 6 бластоцист с Микроманипуляция комплект под инвертированным микроскопом. Имплантат бластоцисты в матку суррогатной матери 23. Mate в химеры высокого класса мужчины (70-90%), чтобы C57BL / 6 женщин.
- Подтвердите генотипирование гетерозиготных LSL-mTERT животных южной пятно.
- Mate гетерозиготных животных C57BL / 6 животных, по крайней мере, три раза, и далее между породы, гетерозиготные LSL-mTERT животные генерировать гомозиготности.
3. Возобновление теломеразы в mTERT-ER и LSL-mTERT мышей в естественных условиях
Для mTERT-ER
- Стерилизовать все хирургические инструменты перед инъекцией.
- Обезболить мышей с изофлуран камере (4% для индукции, 2% для поддержания) в 50% (объем / объем) кислорода / 50% (объем / объем) закиси азота газовой смеси. Или обезболить мышей с кетамином ксилазин смеси (100 мг / кг массы тела + 10 мг / кг массы тела).
- После глубокого анестезии достигается, удалить анестезированных животных от индукции камеры, и держать голову внутри трубки, подключенного к камере изофлуран (2%).
- Pinch ножек мышей, чтобы животное глубоко под наркозом. Поместить мазь на оба глаза, чтобы предотвратить глаз от высыхания. Протрите заднюю часть мышей с повидон-йода.
- Вводите медленно выдел 4-OHT осадок с точностью троакара (10 г) под кожу спины и нажмите на пеллетах всю дорогу до средней линии между двумя плечами.
- Печать разрез с ранением клипа наложения и контролировать мышей для выхода из наркоза. Снимите зажимы 10 дней спустя. Справочная тепла не нужно, потому что процедура закончена в ближайшее время.
- Период лечения с 4-OHT гранулы должны быть оптимизированы в соответствии с целью исследования.
Для LSL-mTERT
<ол>4. Выделение нейронных стволовых клеток и реактивации теломеразы в пробирке
- Мышей умерщвляли с диоксидом углерода и мозги удаляют. Следуйте протокол коммерчески доступного нервной ткани диссоциации наборе как на производителя.
- Ресуспендируют лиофилизированный порошок во флаконе раствора меченого 4 с 1 мл клеточной культуральной среды для решения 4. Не вихрь. Это решение должно быть аликвоты и хранили при -20 ° С для последующего использования.
- Предварительного нагрева смесь при 37 ° С в течение 15 мин перед использованием.
- Сделать смеси ферментов 1: Решение 1 (50 мкл) и раствор 2 (1900 мкл). Сделать смеси ферментов 2: Решение 3 (20 мкл) и раствор 4 (10 мкл).
- Подготовка 1950 мкл смеси ферментов 1 до 400 мг ткани и вихря. Предварительно нагреть смесь при 37 ° С в течение15 мин перед использованием.
- Выньте 1-дневные мозги мыши, и держать forebrains путем удаления обонятельных луковиц и мозжечка. Держите переднего мозга ткани в 1 мл холодной культуральной среде с удалением и в магазине в 4 ° C. Убедитесь в том, чтобы обработать нервной ткани в течение 1 часа.
- Определите вес ткани, чтобы убедиться, предел 400 мг в пищеварении не превышен. Поместите мозг на крышке 35 мм диаметр чашки Петри, и сокрушить мозг с помощью скальпеля.
- Использование пипетки 1 мл, добавьте 1 мл HBSS (без Ca / Mg) и пипетки части спины в 15 мл пробирку. Промыть HBSS (без Ca / Mg). Центрифуга при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и тщательно аспирата супернатант.
- Добавить 1950 мкл предварительно нагревают Смесь ферментов 1 (растворы 1 и 2) в до 400 мг ткани. Инкубируйте в 15 мл пробирку в течение 15 мин при 37 ° С, перемешивание путем переворачивания или встряхивания трубку каждые 5 мин.
- Подготовка 30 мкл смеси ферментов 2 за образец ткани, добавляя 20 & #956; л раствора 3 до 10 мкл раствора 4. Затем добавить в образце. Обратить осторожно, чтобы перемешать. Не вихрь.
- Разбить ткани механически, используя широкий наконечником, огневой полировкой пипетки Пастера с помощью пипетки вверх и вниз 10 раз медленнее. Избегайте образования пузырьков воздуха.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин, переворачивая пробирку каждые 3 мин.
- Повторите шаг 4,11 и шаг 4,12, если ткани больше, чем 200 мг.
- Применение клеточной суспензии в сито клеток 70 мкм, помещенной на 50 мл пробирку. Применение 10 мл PBS через клеточный фильтр. Отменить клеточный фильтр и суспензию клеток центрифуги при 300 г в течение 20 мин при комнатной температуре. Отберите надосадочной жидкости полностью.
- Ресуспендируют клеток с помощью стволовых клеток среды в необходимом объеме для дальнейшего применения.
- Для активации теломеразы в LSL-mTERT НСК, лечения клеток с 100 мкМ 4-ОНТ в течение двух дней. Для активации теломеразы в mTERT-ER НСК, сохранить клетки в культуральной среде с 100 мкМ 4-OHT.
5. теломер FISH
- Подготовьте метафазных хромосом из культивированных клеток.
- Для FFPE (фиксированные формалином и залитых парафином) срезах тканей, deparaffinize в ксилоле и увлажняет в этаноле серии на 5 минут каждый (100%, 90%, 70%, 50% этанол) и PBS в течение 5 мин.
- После исправления в метанол: уксусная кислота (3: 1) в течение 1-2 ч. Высушить в холодной серии этанола в течение 5 мин каждый (70%, 90%, 100% этаноле) и сухой воздух. Промыть в 1x PBS при 37 ° С в течение 5 мин.
- Денатурации хромосом в 4% формальдегиде при 37 ° С в течение 2 мин. Дегидрировать в холодной серии этанола 5 мин каждый (70%, 90%, 100% этанол) и сухой воздух.
- Применение от 12 до 25 мкл смеси для гибридизации ПНК с каждого слайда. (Гибридизации смесь: 70% формамид, 0.06x SSC, 0,2% БСА, 0,5 нг / мкл тРНК, 0,5 нг / мкл теломер или центромерные зонды)
- Печать покровное с резиновым клеем. После денатурации хромосомные Preps и срезы ткани на 80 ° С в течение 4 мв. гибридизуются при комнатной температуре или при 37 ° С в течение 2-4 ч во влажной камере.
- Вымойте при комнатной температуре буфером для промывки 2 х 15 мин. (Промывочный буфер: 70% формамид, 0.06x SSC, рН 7,2). Вымойте при комнатной температуре 3 х 5 мин с PBST. Counter-пятно слайды с DAPI или дальней красной флуоресценции для микроскопического исследования.
Representative Results
Эти стратегии для генерации мышиный mTERT-ER и LSL-mTERT домино в аллелей были описаны на фиг.1А и 1В. В частности, LoxP - тройной Пробка - Neo - LoxP фрагмент был вставлен между экзона 1 и экзона 2 mTERT локуса для получения LSL-mTERT аллеля. Для создания mTERT-ER аллель, домен ERT2-LBD в рамке с геном mTERT встраивали в N-конце экзона 1. Мы показали, что при теломеразы была временно возобновлена в теломеров дисфункции у мышей путем обработки их 4-ОНТ гранул для 4 недель, дегенеративные фенотип мог быть улучшены в различных органах, таких как мозг (фиг.2А) и семенников (фиг.2В). Для того, чтобы определить влияние теломеразы реактивации на клетки культивировали в пробирке, мы выделили нервные стволовые клетки (НСК) с конца поколение G4 LSL-mTERT и G4 mTERT-ER Мышей. Мы показали, что при теломеразы была возобновлена в теломер неблагополучных НСК, самообновление способность НСК значительно увеличивается (рис 3а), а в пробирке нейрогенеза также значительно повышена (рис 3B). Для того чтобы определить влияние на теломеразы реактивации опухолей в контексте теломер дисфункции, мы получили PB-Cre4 PTEN L / L р53 L / L LSL-mTERT л / л (модель опухоли простаты) и АТМ - / - mTERT ER / ER (тимуса Т-клеток модель лимфома) когорты поздней генерации. Когда теломераза была возобновлена по тамоксифена у этих мышей с инъекцией (рис 4а) или 4-ОНТ гранул в течение 8 недель (рис 4б), канцерогенез значительно активизировалось в обеих простаты модели опухоли (рис 4а) и тимуса Т-клеточная лимфома модели (
Рисунок 1: () mTERT-ER стучать в стратегии. ТВ, ориентированных вектор; WT дикого типа аллель; К.И., стучать в аллеля; LA, левая рука; РА, правая рука; Е1, экзон 1; E2, экзон 2; нео, ПГК промоутер управляемой неомицина ген устойчивости; ER, модифицированный рецептор эстрогена (ERT2) лиганд-связывающий домен; DT, dyphteria ген токсина. (B) LSL-mTERT стучать в стратегии. ТВ, ориентированных вектор; WT дикого типа аллель; К.И., стучать в аллеля; LA, левая рука; РА, правая рука; Е1, экзон 1; E2, экзон 2; нео, ПГК промоутер управляемой неомицина ген устойчивости; Пробки, три повторяющихся транскрипции последовательности останова; DT, dyphteria ген токсина.
Рисунок 2: Представитель данных, чтобы показать теломеразы реактивации улучшает дегенеративные фенотипы органов Характерные изображения мозга (слева). и яички (справа) G0 и G4 mTERT-ER мышей, получавших плацебо или 4-ОНТ в течение 4 недель. Масштабные полоски показывают 50 мкм. Повторная печать с разрешением от 20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3:. Репрезентативные данные, чтобы показать теломеразы реактивации улучшает самообновлению и нейрогенез нервных стволовых клеток в пробирке (А) Типичные изображения нейронной стволовых клетокы изолирован от G4 LSL-mTERT (верхняя панель) и G4 mTERT-ER (нижняя панель) растет в стволовых клеток среды, обработанной транспортного средства или 4-ОНТ. (Б) Типичные изображения пробирке нейрогенеза в (+) Tuj1 нейронных стволовых клеток, выделенных из G4 mTERT-ER культивировали в среде для дифференцировки (с 1% FBS) обрабатывали транспортного средства или 4-ОНТ. Масштабные полоски показывают 100 мкм.
Рисунок 4:. Характерные данных, чтобы показать теломеразы реактивации улучшает образование опухолей на фоне нестабильности генома () Типичные изображения опухолей предстательной железы расчлененный от G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, И G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L лечение тамоксифеном. Повторная печать с разрешением от 22. (B) Типичные изображения тимуса Т-клеточных лимфом расчлененный от G0 атм - / - mTERT + / ER, G4 Банкоматы - / - mTERT ER / ER обрабатывали носителем, и G4 Банкоматы - / - mTERT ER / ER обрабатывали 4- OHt в течение 8 недель. Масштабные полоски указывают на 1 см.
Рисунок 5: Типичные изображения теломерной и центромерного рыбы на FFPE мыши мозговой ткани и метафазы (вставка). Красный цвет указывает на ДНК, зеленый цвет означает, окрашивание теломер и голубой указывает CEntromere окрашивание. Масштабные полоски указывают на 1 мм.
Discussion
Здесь мы сообщаем зарождения двух индуцибельных аллелей мышиный теломеразы и как активировать теломеразы в естественных условиях и в пробирке. Важным шагом для возобновления mTERT-ER деятельности является сохранение непрерывного концентрации тамоксифена, так что мы решили использовать 4-ОНТ времени выпуска окатышей производимых Innovative Research Америки. Гранулы держать выпуская 4OHT на стационарном уровне в крови 1 нг / мл в течение до 60 дней. В предыдущем исследовании мы показали, что восстановление активности теломеразы с этой стратегией смог улучшить дегенеративные фенотипы, такие как стволовых клеток истощения, обесценения ответов повреждение тканей и полиорганной недостаточности в различных органах, что были вызваны теломер дисфункции G4 mTERT ER / ER мышей 20.
Кроме изучения функции теломеразы в старении, эти два индуцируемые аллели теломеразы также может быть использован для изучения рака. Предыдущие исследования принялиПреимущество этих аллелей изучить роль теломер истощение и теломеразы реактивации в формировании геномов и влияют на биологию Т-клеток тимуса лимфома 21 и рака простаты 22. Эти два исследования показали, что теломеры дисфункция в конце поколения G4 атм - / - mTERT ER / ER и G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L мышей обеспечивает механизм заправки приобретение начале мутагенных событий инициирование опухоли, но предотвращения прогрессирования полностью злокачественных опухолей. При теломеразной была возобновлена в контексте теломеры дисфункция-индуцированной геномной нестабильности, повреждение ДНК, контрольные точки и безудержной хромосомной нестабильности были подавлены, что позволило полностью прогрессирование злокачественных опухолей с новыми биологическими свойствами, такими как костных метастазов рака предстательной железы и 21 мозга инфильтрации thymiС лимфома 21. Подобные явления наблюдались и в других видах рака, включая рак толстой кишки и поджелудочной железы (личные связи с DRS. Haoqiang Ин, Адам Бутин и Рональд DePinho).
Поскольку TERT-ER протеин может быть легко переключаться между включением и выключением состояний в зависимости от того, животных обрабатывают тамоксифен или транспортного средства, модели опухоли, генерируемые mTERT-ER аллеля может быть использована для проверки анти-теломеразы терапии. В предыдущем исследовании, опухоли генерируется в G4 атм - / - mTERT ER / ER животные были выпущены из 4-ОНТ; при истощении теломеразы, опухоли в конечном счете сократился из-за восстановления теломер дисфункции, вызванной контрольно-пропускных пунктов 21. Тем не менее, некоторые из опухолей, полученных сопротивление в ответ на теломеразы исчезновение путем активации альтернативного удлинения теломер механизма (ALT). Дальнейшая характеристика этих Alt + устойчивых опухолей показали, что тэй есть отклоняющееся транскрипцию генов, участвующих в митохондриальной биологии и окислительного защиты, включая мастер-регулятором синтеза митохондриальных и окислительного обороны PGC-1β. Нокдаун PGC-1β или SOD2 (другой регулятора окислительного обороны) существенно устраняет ALT + опухолевые клетки, а держать теломеразы + опухолевые клетки остаются относительно нетронутыми 21.
Одним из ограничений этих двух нокаут-аллелей в том, что они могут позволить себе только реактивации теломеразы в эндогенной уровне, потому что они находятся в нативной локуса гена теломеразы. В большинстве злокачественных опухолей человека, теломераза на самом деле сверхэкспрессируется на гораздо более высоком уровне. В целях повышения уровня теломеразы, одну модификацию можно рассматривать это вставить mTERT-ER конструкцию с более сильным промотором, такие как PGK (фосфоглицераткиназы) промотора в Rosa26 локуса.
В заключение, эти два новые индуцибельные мышиные аллели теломеразы обеспечивают беспрецедентную ЖенеIC инструменты для изучения функции теломеразы в старении и тканевого гомеостаза, а также в опухолевой прогрессии, особенно в фоне предварительно приобретенного теломер дисфункции, вызванной геномной нестабильности. MTERT-ER аллель может быть также использован для изучения анти-теломеразы терапия путем скрещивания в другие мышиных моделях опухолей, подверженных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
| Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
| isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
| isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
| ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
| 4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
| Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
| Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
| wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
| clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| HBSS | Life technologies | 14025092 | |
| PBS | Life technologies | 10010023 | |
| xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
| methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
| acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
| ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
| formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
| PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
| PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
| 20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
| Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
| rubber cement | Walmart | Elmer's | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Bass, A. J., et al. Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet. 43, 964-968 (2011).
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Blasco, M. A., et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. 91, 25-34 (1997).
- Lee, H. W., et al. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature. 392, 569-574 (1998).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, 725-729 (2007).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing. Nature. 421, 643-648 (2003).
- Rudolph, K. L., et al. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell. 96, 701-712 (1999).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation. Nat Genet. 26, 85-88 (2000).
- Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131, 4059-4070 (2004).
- Savage, S. A., Alter, B. P.
- Armanios, M.
- Vulliamy, T., et al. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature. 413, 432-435 (2001).
- Harley, C. B., Harley, S. W.
- Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).
- Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell. 92, 401-413 (1998).
- Chin, L., et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis. Cell. 97, 527-538 (1999).
- Artandi, S. E., et al. Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice. Nature. 406, 641-645 (2000).
- Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet. 28, 155-159 (2001).
- Greenberg, R. A., et al. Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse. Cell. 97, 515-525 (1999).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice. Nature. 469, 102-106 (2011).
- Hu, J., et al. Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer. Cell. 148, 651-663 (2012).
- Ding, Z., et al. Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases. Cell. 148, 896-907 (2012).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
