Introduction
小鼠是依赖于嗅觉用于导航新环境，寻找食物，用于识别其它个人，和性行为1-3。重要的是，研究人员建立实验动物是否不管理涉及食品，社会交往，或意在引起从鼠标的响应任何气味行为测试前的嗅觉功能感。嗅觉缺失或无法不同的气味区分，可能会导致在各种行为范例误报或底片，所以其它类型的行为测试之前，执行一个鼠标的检测和辨别气味的能力应该建立。
嗅觉习惯/ dishabituation试验是在20世纪80年代4首先描述。测试已适应于由Drs小鼠使用。穆押嗯和杰奎琳·克劳利5。这是一种简单而廉价的测试，允许调查者ESTAblish一个鼠标可以检测和气味区分。除了测试嗅觉，该测试允许研究者观察小鼠的一般行为，应在测试方案的早期完成。关于鼠标的运动定性观察，焦虑的迹象，活动水平，并回应社会对气味的食物的气味可能预示着在测试可能进行的新领域。
在该试验中，浸入各种气味棉签呈现给小鼠三次在一排。与每个重复介绍的气味，将鼠标，观察者向棉棒，花费更少的时间与每个随后呈现调查它。当一个新的气味呈现，dishabituation发生，并且一个典型的鼠标会花费更多的时间来调查拭子，这表明它可在当前和以前的气味5区分。此测试被施用给一只小鼠在一时间，并包括45分钟ACClimation期间随后测试45分钟。
虽然这个测试很容易进行可能被用于调查有关鼠标的嗅觉系统的复杂问题。嗅觉的其他流行的测试，如掩埋食品测试，简单地建立嗅觉缺失的存在或不存在。然而，嗅觉辨别和习惯测试允许研究者确定鼠标不仅具有检测气味，但不同的气味之间可以区分的能力。习惯和dishabituation的格局已被用于建立新的突变体6,7气味区分。在一个令人惊讶的研究，Fadool及其同事利用气味的复杂混合物，表明小鼠基因靶向删除的Kv1.3通道都“的嗅觉超级”，可以区分非常相似的气味比正常老鼠更8。
当检查了新的基因敲除小鼠模型是有用的establis^ h的正常行为存在基本的感官任务。当早期的测试方案完成后，气味辨别和习惯测试给出了一个调查员有机会观察到任何异常行为。这些观察结果可以防止在随后的测试假阳性或阴性结果归因于混淆的突变体的特征。研究人员继续调查社会行为，需要验证基本的嗅觉功能变得越来越重要。除了检查嗅觉在突变系，这种测试可用于解决特定的问题，例如一个药物治疗是否特异性增加动物的响应社会刺激气味，或者如果它们的反应增大到所有刺激气味。
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Protocol
在以下实验中使用的成年雄性小鼠产生并容纳在贝勒大学在22℃的环境温度下，用14小时光照和10小时黑暗（20：00至6:00小时）昼夜周期。给予小鼠随意获得食物和水。所有的程序给小鼠均符合的护理和使用实验动物和动物卫生协议指引全国学院是经贝勒大学动物护理和使用委员会。小鼠在上午晚些时候/下午早些时候进行测试。对于研究者下的所有程序，应戴手套，以消除异味，防止污染。
1.准备非社会的气味
- 测试中的每一天准备新鲜的非社会的气味。
注：研究者应使用手套，准备气味。- 填3离心管，用10毫升的水每。
- 吸取100μl的香蕉提取物的入15ml＆＃160;锥形管和100μl的杏仁提取物的成第二的15毫升锥形管中以1：100稀释。
注意：第三15ml试管将仅含有水。
2.制备社会的气味
- 准备在上午的测试会出现新的社会气味。从还没有被清理为至少三天，并包含小鼠相等数目两个保持得到社会的气味。获得从性别相同的测试受试者的小鼠社会气味。
注意：这些是要被存储在RT，并应在4-6小时用于维持强烈的和一致的气味。- 确定有多少社会气味棉签需要创建：每只小鼠被测试将看到来自社会的气味1，和三个三拭子从社会的气味2。
- 通过在一个肮脏的笼子底部擦拭棉签以Z字形方式编制社会的气味。抖掉多余的被褥抱住一角。
- 商店棉签在大玻璃罐子的盖子或盖上封口膜烧杯。指定一个容器社会气味1和第二社会的气味2。
- 保持气味源网箱实验测试室外面。
3.驯化测试鼠标
- 戴上手套并称重小鼠进行测试并单独放置在一个干净的笼子，顶部的线盖和水瓶除去。
- 让鼠标适应新的笼子45分钟在一个房间以外的检测室。确保有没有在房间里不寻常的气味或噪音。
- 由于测试需要约45分钟，通过将鼠标旁边的错开时间驯化要测试到一个干净的笼子测试当前鼠标前适应的权利。
4.编写的测试室
- 将新鲜的棉签，实验室带，包含社会气味拭子瓶，n的管上社会的气味，微量，两个定时器和一个废液瓶在试验室的盖子。
- 确保考场是合理的自由气味，大声喧哗，明亮的光线。不要穿带香味的古龙水或洗液。
注意：观察者不应该在测试期间口香糖或糖果，并应尽量限制其暴露在强烈气味的食物。
5.测试程序
- 把鼠标驯化它在笼中带入考场，并放置在柜台上笼的高度舒适的观看，同时就位。
- 呈现每个气味3次连续，每次2分钟。使用显示顺序，可在表1中找到。
- 吸移管将50μl加臭剂的气味的被测试到棉棒的前端和重新盖上的气味源。提起笼子的顶部电线插入棉签的无味，木制的一端插入水瓶开盘，推着克通过从金属丝顶端的下侧的长度。避免接触棉签任何东西，包括手指，使异味污染是可以避免的。
- 继续通过水的瓶口画棉签直到大约1英寸的棉花年末下垂入笼。加盖棉签使用实验室磁带笼边的木结束。
注意：小心不要让盖子回落到笼子，造成一个响亮的噪声会干扰测试鼠标。 - 立即开始2分钟时间。用一个定时器时间2分钟演讲。记录花了2分钟，试验期间嗅气味的累计时间。使用单独的秒表计数动物的嗅探行为。主动嗅探定义为当动物的鼻子是面向棉签用它的鼻子〜2 cm或接近尖。
- 在完成每次试验后，抬高电线盖并通过联合国向下拉动取出棉签盖子derside（这避免了气味的污染防止棉尖端接触到导线）。密封在500毫升的废液瓶的使用棉签。
- 准备并插入下棉签，并开始计时。让每一个试验间隔约之间1分钟。继续直到每个气味已被提出的三次连续，对于每次2分钟。
- 一旦鼠标已经完成了所有的试验，清空含有用棉签在一个垃圾桶试验室可以在外面的废液瓶。返回鼠标它的笼子。
6.分析
- 用于使用双向ANOVA，然后进行Newman-Keuls检验或类似的事后检验，以确定显著习惯（更短的时间嗅探连续相同的气味），并且dishabitutation（更多时间嗅探一个新闻），每个组每气味条件分析数据。
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Representative Results
以下描述的方案，结果是使用10个成人（90-120日龄）的雄性C57BL / 6J小鼠和八个雄性FVB混合背景品系（50-70日龄）记录。测试如下进行多天的单一研究者。图形上的每个点代表花费调查气味的平均时间。
当第一次引入的棉签浸渍在水，小鼠花费了大量的时间调查这个新物体（ 图1：前三个数据点）。随着每个连续的演讲，更少的时间花在调查棉签，表示习惯。当一个新的气味被引入，存在时间上扬花费调查拭子，表明小鼠可以在新的气味和前一个（ 图1：杏仁数据点）之间进行区分。再次，随着每次连续介绍，更少的时间花在调查气味。小鼠显示出显著ðecrease时间嗅水的棉签在三项试验F（2,18）= 3.8，P <0.05。它们显示了类似的模式时反复呈现的杏仁味F（2,18）= 3.6，P <0.05。到了第三的气味，他们仍然习惯展示，而是由这个试验的动物达到坪效（ 图1：香蕉数据点）。地板效应是当行为是如此之低，的能力来衡量任何较低是不可靠的行为。与香蕉气味F（2,18）= 2.5，P <0.1时提出他们不显示在以上三项试验的变化。但是，双向ANOVA用于气味的所有9演示显示一段时间F（8.72）= 3.8，P <0.001一个显著效果。
习惯和歧视的相同的图案可以看出随着社会的气味，与非社会的气味。然而，小鼠花费更多的时间调查社会气味（ 图2）。有一个时间显著减少花费嗅探吨他的社会气味时，所有6个试验合并F（2,18）= 6.1，P <0.01。然而，有在第一三个试验F（2,18）= 3.0，p值= 0.076边际效应。这表明有一些习惯，但没有嗅探第一社会异味时有统计学显著量减少。有一个显著减少在时间的动物的社会气味的第二呈现期间调查了社会气味F（2,18）= 6.1，P <0.01的量。
我们反复在男性FVB混合背景品系的方法。当第一次引入的棉签浸渍在水，小鼠花费了大量的时间调查这个新物体（ 图3：前三个数据点）。随着每个连续的演讲，更少的时间花在调查棉签，表示习惯。当一个新的气味被引入，存在时间上扬花费调查拭子，表明小鼠可以在新的气味一个区分次前一个（ 图3：杏仁数据点）。再次，随着每次连续介绍，更少的时间花在调查气味。的小鼠显示在时间上显著下降嗅探水棉签在三个试验F（2,14）= 13.3，P <0.001。它们显示了类似的模式时，反复呈现的杏仁味F（2,14）= 12.7，P <0.001。在该菌株中仍有跨越三个试验一个显著差异。由第三气味它们仍然表现出习惯（ 图3：香蕉数据点），但由于地面效应与香蕉气味F（2,14）= 3.04，第6页，当他们没有显示在三个试验的变化= 0.08。但是，双向ANOVA用于气味的所有9演示显示一段时间F（8,56）= 9.6，P <0.001一个显著效果。
习惯和歧视的相同的图案中没有发现与社会的气味，与非社会的气味。没有一个显著减少花费的时间嗅气味的社会，当所有6项研究合并F（5,35）= 0.16，P = 0.97。这些数据表明，小鼠不，观察者的两个社会气味重复介绍。
图1：平均花费的时间调查非社会的气味对雄性C57BL / 6J小鼠中的每个数据点代表平均值时间的动物花费调查特定非社会的气味。误差条代表平均值的标准误差。星号（*）表示一个显著差异，其中该组被显示习惯（P <0.05）。
图2：平均花费的时间调查社会气味为雄性C57BL / 6J小鼠中的每个数据点代表平均值时间的动物SPEN牛逼调查特定的社会气味。误差条代表平均值的标准误差。星号（*）表示一个显著差异，其中该组被显示习惯（P <0.05）。
图3：平均花费的时间调查非社会的气味对雄性FVB混合背景品系每个数据点代表平均时间的动物花费调查特定非社会的气味。误差条代表平均值的标准误差。星号（*）表示一个显著差异，其中该组被显示习惯（P <0.05）。
图4：平均花费的时间研究社会的气味男性FVB混合背景品系每个数据点represen。TS的平均时间花在动物调查特定的社会气味。误差条代表平均值的标准误差。
| 气味 |
| 水 |
| 水 |
| 水 |
| 杏仁 |
| 杏仁 |
| 杏仁 |
| 香蕉 |
| 香蕉 |
| 陌生的社会气味1 |
| 陌生的社会气味1 |
| 陌生的社会气味1 |
| 陌生的社会气味2 |
| 陌生的社会气味2 |
| 陌生的社会气味2 |
表1
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Discussion
本文提供的结果是最优的小鼠。小鼠表现出一种新的气味了强烈的反响，然后迅速，观察者。之一，在该方法中的关键步骤是气味的制备。调查人员需要采取非常谨慎，以彼此隔离的气味，以防止污染。另一个重要方面是棉签的呈现。研究者需要解决的棉签的最佳位置，以便鼠标可以调查尖，但不撕裂的尖端。测试的一个重要组成部分是气味的选择。我们提出了三个非社会的气味，但它不会是很难有额外的气味。一个需要注意的是要选择气味是从另一个明显的不同。一个可以观察到“地板效应”，如果类似的气味依次呈现。此外，小鼠可以开始于太多新颖气味呈现时，以减少它们的响应。如果调查要包括一个dditional气味，那么他/她可能要包括测试附加天。这需要大约一小时，以测试各小鼠。此外，应该包括他们作为实验条件前解决在对照组小鼠气味的选择。
嗅觉习惯/ dishabituation是一个重要的测试研究社会行为时包括。三个室社会行为测试通常用于检查小鼠的社会行为的赤字。此测试包括其中实验动物研究了一种新的物体和一个新的小鼠它们置于一杯在室的不同端的条件。该测试还可以包括在这里了一种新的鼠标被放置在一个杯子，另一鼠标（鼠标熟悉）被划归其他杯子的条件。调查人员随后检查了实验老鼠是否能区分两者。因为嗅觉是主要的感觉模式小鼠用于识别其他老鼠9-11，嗅觉障碍可能影响他们对这个任务的能力。嗅觉受损可能会导致数据的误解。例如，实验者可能会发现鼠标不能花更多的时间与新的小鼠相比，熟悉的鼠标。这似乎表明社会赤字或受损的社会记忆的小鼠的证据进行测试。然而，更简单的解释可能是，动物不能正常检测所述动物。
嗅觉习惯/ dishabituation试验已经澄清自闭症的小鼠模型是有用的。一个经常使用的小鼠自闭症模型是BTBR T + TF / J（BTBR）小鼠品系。这是一个近交系具有很强的表面效度孤独症的三大核心行为特征。然而，关注的是他们的社会行为赤字是否是由于受损的嗅觉系统。杨和他的同事研究了通过使用HABITŪ的BTBR菌株是否嗅觉受损通货膨胀/ dishabituation测试12。他们用的水，杏仁气味，气味香蕉三个介绍他们的非社会的气味。然后，他们使用129 / SvlmJ和B6小鼠品系准备了一个社会的气味。该BTBR应变显示习惯和dishabituation到非社会的气味。该小鼠表现出居住的第一个社会气味，但并没有表现出dishabituation到第二次社会气味。一种可能性是，它们不一定能不同的社会气味之间进行区分。当两个社会刺激呈现这可能损害他们的能力在社会行为试验。这是一个重要的考虑探索孤独症的不同小鼠模型时，可能提供新的见解是什么改变在这些小鼠。
习惯和dishabituation是学习基本的非关联机制。这些学习原则已被证明在许多类型的复杂和简单的生物13,14。但是，这些机制学习已经很少在研究嗅觉鼠标行为，但这个系统是非常重要的措施，因为行为测试更大的电池的一部分。这个试验是便宜的设置和运行，需要仅一天的测试，和几个小鼠可以在一天之内进行试验。该试验的主要目的是研究嗅觉功能。从测试结果可以帮助减少社会行为测试和其他测试，其中包括一种气味成分误解。
在审查中的任何任务鼠标行为有多种考虑。小鼠的品系，动物的性别，和一天中的时间是需要被检查的所有因素。如果研究者使用的混合菌株则有可能是在气味的调查行为更多的变化。我们提出了从混合FVB应变数据。它们在非社会的气味测试中表现良好（ 图3）。虽然，他们调查了社会对气味的高量的Ô˚F的时候，他们并没有表现出习惯化社会的气味（ 图4）反复演示。老鼠可能需要经历更多的试验来证实习惯。我们已经提供了这应该是对于大多数菌株有用的一般方法。然而，检查任何菌株的首次的行为，当上述的因素应该加以考虑。通过检查对照动物的表现的研究者可能需要调整所选择的气味，所述气味呈现的次数，照明条件，每天进行测试的时间，和动物的性别。这适用于任何其他小鼠的行为，应该在这种类型的测试加以考虑。这里已包括气味，他们很容易可供购买。如果研究者关注的是，他们不使用纯气味那么他们可能会考虑从Sigma-Aldrich公司订购。他们有超过1600的芳香原料的数据库。这将允许研究者使用纯气味，但成本可能禁止一些实验室。
还有一些测试条件下，实验者可以考虑。在许多测试将动物驯化室，将在被测试。在这个协议中，我们驯化实验动物在一个房间里，并在其它测试它。这将导致一些觉醒的时候搬到新的房间。我们执行的程序这种方式，因为如果所有的小鼠都装在同一个房间作为测试小鼠然后所有小鼠将暴露于小说的气味。有两个选项，实验者可以考虑。首先是我们上面描述的东西。另一种是对动物移动到房间先让它适应房间然后开始进行测试。测试完成后，然后具有下一个动物放置在房间然后使其适应。这是可能的，但会几乎在实验的时间增加一倍。我们使用的选择是只在实验中移动测试动物试验室。这将导致在升ESS测试时间。有一个在测试效率和关注新奇诱导觉醒的平衡。实验者应确定哪些是最适合他们的实验。
其中，该协议中，一个人的分数的行为实时，它已成为日益流行的研究与摄像头动物的行为，记录他们的行为。有几个优点使用动物行为的视频记录。其中之一是，一个人的研究者在房间可能影响鼠标行为。事实上，一项研究发现，具有男性实验者可以影响小鼠的疼痛敏感性正在测试15。另一个值得关注的是，结果是只能从一个研究者。通过使用视频录制多个观察者能够得分的行为。那么可以衡量可靠的得分是观察员，这将导致更一致的测量之间。一个其它的优点是，在视频帧的速度可以减少，并且可亲韦迪行为的更准确的测量。利用摄像机可以很容易地引入到该方法中。安装程序将取决于实验室的空间配置。使用照相机的缺点是计分时间将显著增加。需要两个或更多的观察员得分的行为将增加生产所需的结果的时间。这会增加劳动负担到实验室和在某些情况下可能是过高如果筛选许多基因敲除系。另一个缺点是，一个以上的照相机可能是需要的。相机将在固定的位置。如果鼠标调查中的异味，禁止观察者看到的动物的方法，然后在试验可能需要被消除。这是用较少的个人谁可以很容易地通过调整他们的视线调节动物的看法值得关注。然而，在该协议中描述的方法可以很容易地进行调整，以包括视频记录没有显著改变到我们说明的协议里伯。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Allentown | Standard mouse cage | |
| Wire lid | Allentown | BCU Mouse WBL 2500 | |
| Bedding | Harlan | 7090 Sani-Chips | |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | 6” wooden handle |
| Banana extract | McCormick | ||
| Almond extract | McCormick | ||
| Laboratory tape | VWR | 89098-062 | |
| Stop watch | VWR | 62374-000 | |
| Nitrile gloves | VWR | 82026 | |
| Timing device | VWR | 61161-350 | |
| 15 ml conical tubes | VWR | 89003-294 | |
| 2 L beakers | Pyrex | 1003 | |
| Parafilm | Parafilm | PM-992 | 4” x 250’ |
| 1 L bottle with cap | VWR | 89000-240 |
References
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