Abstract
La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante inflamatoria del sistema nervioso central caracterizado por la formación de placa que contiene los oligodendrocitos perdidos, mielina, axones y neuronas. La remielinización es un mecanismo mediante el cual la reparación endógena nueva mielina se produce con posterioridad a la proliferación, el reclutamiento y la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos en oligodendrocitos formadoras de mielina, y es necesaria para proteger los axones de un daño mayor. Actualmente, todos los agentes terapéuticos para el tratamiento de la esclerosis múltiple dirigen el componente inmune aberrante de la enfermedad, que reducir las recaídas inflamatorias pero no a prevenir la progresión a la disminución neurológica irreversible. Por tanto, es imperativo que se desarrollen estrategias de remielinización de promoción de lo que puede retrasar la progresión de la enfermedad y quizás revertir los síntomas neurológicos. Existen varios modelos animales de desmielinización, incluyendo la encefalomielitis autoinmune experimental y curprizone; sin embargo, hay limitaciones en su uso para el estudio de la remielinización. Un enfoque más robusto es la inyección focal de toxinas en el sistema nervioso central, incluyendo la lisolecitina detergente en el cable de la materia blanca de la médula de los roedores. En este protocolo, se demuestra que el procedimiento quirúrgico que participan en la inyección de lisolecitina en la sustancia blanca ventral de los ratones es rápido, rentable, y no requiere materiales adicionales a los disponibles en el mercado. Este procedimiento es importante no sólo para el estudio de los acontecimientos normales que intervienen en el proceso de remielinización, sino también como una herramienta de pre-clínica para el cribado de candidatos terapéuticos de remielinización de promoción.
Introduction
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por infiltración de células inmunes y placas que contienen perdidas de mielina, oligodendrocitos, axones y neuronas. La mayoría de los pacientes tienen un curso de la enfermedad que consiste en recaídas inflamatorios acompañados de una amplia gama de síntomas neurológicos, seguido por períodos de remisión. Más de la mitad de estos pacientes finalmente la transición a una fase secundaria progresiva con recaídas aparentes sino declive neurológico permanente. Se cree que este deterioro progresivo es debido al daño axonal y la pérdida, contribuyó en parte por la desmielinización crónica. Estrategias para restaurar la mielina perdida son así considerados un enfoque prometedor tratamiento para retrasar la progresión de la enfermedad y quizás revertir los síntomas neurológicos.
La remielinización es una respuesta de reparación endógena en el SNC mediante el cual las nuevas vainas de mielina se generan a partir de células precursoras de oligodendrocitos reclutados(OPC) que se diferencian en oligodendrocitos formadoras de mielina. La remielinización se ha demostrado en modelos animales para ser bastante robusta 1-3, sin embargo, su eficacia disminuye con la edad de 4 años. De hecho, la remielinización se produce en los seres humanos a pesar de que es incompleta en la mayoría de los pacientes con EM 5. Todos los medicamentos disponibles en la actualidad para la EM apuntan sobre todo el componente inmune aberrante de la enfermedad y, si bien es efectivo en la reducción de las recaídas, que no se demore significativamente la progresión de la enfermedad. La próxima generación de estrategias terapéuticas para el tratamiento de la EM se integrará avances en la inmunomodulación con el aumento de la remielinización endógena con el fin de evitar que ambos recaídas y la progresión 6.
Un método para estudiar de- y la remielinización en el sistema nervioso central consiste en la inyección directa de la lisofosfatidilcolina detergente (lisolecitina) en la médula espinal de la materia blanca 1,3,7. Este procedimiento produce una demyelinat bien caracterizadoing lesión que consiste principalmente en macrófagos / infiltración y la activación microglial 8,9, astrogliosis reactiva, la perturbación de la homeostasis axonal / lesión axonal, y la proliferación de OPC y la migración 10. La lesión evoluciona previsiblemente durante el período de unas pocas semanas y, finalmente, es totalmente capaz de remielinizantes. Este método ha sido especialmente útil en el estudio de la coreografía de los eventos implicados en la despolarización y la remielinización. Además, se ha adoptado como una herramienta para la prueba pre-clínica de terapias candidatos para acelerar la reparación después de un insulto desmielinizante.
Protocol
NOTA: Los animales utilizados en este procedimiento se cuidaron de acuerdo con el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) directrices. Ética fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Calgary.
1. Prepare la jeringa para inyección
- Disolver lisolecitina a una solución al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se almacena a -20 ° C en pequeñas alícuotas (75 l). Descongelar un vial a RT.
NOTA: Si lisolecitina es sin disolver, sonicar el tubo en un limpiador ultrasónico (40 kHz) durante aproximadamente 30 min para formar una solución uniforme. - Maneje el capilar de vidrio previamente desmenuzado con extremo cuidado para evitar dañar la punta delicada. Aflojar la tuerca de una jeringa de inyección de 10 l e insertarlo en el extremo plano del capilar seguido de 2 casquillos, asegurándose de que los extremos de apareamiento de las férulas se alinean y el capilar esté alineado en el casquillo cónico (Figura 1). Enjuague la jeringa con isopropalcohol il y retire el émbolo. Una vez seco, el tornillo de la mano conjunto de la aguja firmemente en la jeringa de inyección.
- Coloque la aguja cubo metálico a la jeringa de cebado. Pierce un disco de goma con la aguja y deslice hacia abajo a la base. Llene la jeringa de cebado con lisolecitina. Presione suavemente la jeringa de cebado hasta que el líquido es visible en la punta de la aguja. Esto asegura burbujas de aire no se introducirán en la jeringa de inyección.
- Inserte la aguja cubo metálico de la jeringa de cebado en la jeringa de inyección. Haciendo un sello firme con el disco de goma, presione lentamente la jeringa de cebado hasta que el capilar se llena hasta la punta con la solución. Retire cuidadosamente la jeringa de cebado mientras que simultáneamente presionando para llenar el barril de la jeringa de inyección sin introducir burbujas de aire. Se inserta el émbolo en la jeringa de inyección y asegúrese de solución fluye desde la punta del capilar cuando el émbolo se presiona suavemente.
NOTA: Si las burbujas de aire son visibles en la tapaIllary o inyección de la jeringuilla, la preparación de la jeringa debe repetirse desde el principio. Fluido continuo en el aparato de inyección es fundamental para garantizar los volúmenes de inyección precisos. - Coloque la jeringa de inyección completado al brazo de un micromanipulador estereotáctica. Este aparato completado será capaz de inyectar 15 a 20 animales antes de necesitar ser recargado.
- Deseche la lisolecitina restante de la jeringa de cebado. Retirar y deprimir alcohol isopropílico varias veces, y separar la aguja cubo metálico. Espere varias horas para el alcohol isopropílico restante en la jeringa de cebado para evaporar antes de llenar de nuevo.
2. Prepare Animal de Procedimiento Quirúrgico
NOTA: Este procedimiento se describe para mujeres C57BL / 6 ratones, con edades entre 8-10 semanas.
- Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de ketamina (200 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) o por las regulaciones de cuidado animal institucionales. Plan para elanimales sea bajo anestesia durante aproximadamente 1 hora si se utiliza anestesia inyectable.
- Prueba de que el animal está profundamente anestesiado apretando firmemente el pie. Un animal de adecuadamente anestesiado no responderá a la pizca.
- El uso de máquinas de cortar, afeitarse un cm2 de área de 2-3 en la parte dorsal del animal, cerca de los oídos. Tenga cuidado de no dañar los oídos.
- Limpie el área con etanol al 70% aplicado a una gasa. Asegúrese de que todo el pelo recortado ha sido retirado de la zona. Desinfectar la zona con yodo.
- Aplique vaselina en los ojos para evitar que se seque durante todo el procedimiento.
- Mantenga el animal en una cámara de recuperación calienta hasta que esté listo para comenzar el procedimiento.
3. Lleve a cabo el procedimiento quirúrgico
NOTA: Asegúrese de que la técnica aséptica adecuada para todos los pasos del procedimiento. Esto incluye el uso adecuado de guantes, redecillas para el cabello, mascarillas y cortinas. Todas las herramientas deben ser esterilizados antes de entrar en contact con el animal.
- Mueva el animal a un marco estereotáxico, lado dorsal hasta, elevado en la sección media de toallas de papel plegadas a exagerar la curvatura de la columna vertebral. Fijar los brazos y la cola con cinta quirúrgica y asegurar la cabeza con una pinza diente. Barras estabilizadoras del oído no son necesarios para este procedimiento.
- Utilice un bisturí para realizar una incisión en la línea media 3 cm, comenzando justo debajo de las orejas y de corte en la dirección caudal.
- Localice la brecha entre los 2 grandes estructuras adiposas y utilizar unas pinzas finas en cada mano para tirar de ellos aparte. Spread retractores para abrir el campo quirúrgico.
- Bajo un microscopio quirúrgico, busque el proceso consecuencia destacada de la vértebra T2 (Nota: esta función es característico de la cepa C57BL / 6 mouse). Realice una disección roma con tijeras de primavera cerrados a través de la musculatura de revestimiento a visualizar mejor T2. Usando las pinzas, sentir por las superficies duras de T3 y T4 para confirmar la ubicación anatómica correcta.
- Usando tijeras de primavera, hacer cortes laterales poco profundas (2-3 mm de profundidad) del tejido conectivo entre T3 y T4. Debido a la separación natural entre las vértebras en la porción torácica superior de la columna vertebral ratón, una laminectomía no es necesario para revelar la médula espinal. Tenga en cuenta que un corte demasiado profundo perforará y dañar el cable.
NOTA: Un pequeño grado de sangrado es común durante esta etapa. Si esto ocurre, mantenga una lanza esponja en el área hasta que cese el sangrado (30-60 seg). - Visualizar la médula espinal. Se cubrió con una gruesa capa de duramadre visible si esta capa meníngea aún no se cortó mientras se expone el cable. Un vaso sanguíneo prominente corre caudal / rostral a través de la línea media aproximada de la médula espinal.
NOTA: Este vasculatura no se debe utilizar como un punto de referencia para la línea media. En cambio, una iluminación adecuada debe revelar los límites de materia gris-blanco que flanquean la columna dorsal, y éstos deben ser utilizados para estimar la línea media. - Si la duramadrepermanece intacto, hacer raspaduras laterales suaves con una aguja de metal G 32 hasta que se borra. El objetivo es eliminar la duramadre cuando no esté cortando las meninges subyacentes restantes, que no son tan gruesas y más difícil de ver.
NOTA: La liberación de líquido cefalorraquídeo indica una violación de la aracnoides y si bien esto puede ocurrir sin daños mecánicos a los tejidos, el líquido cefalorraquídeo acumulado debe ser eliminado con una lanza esponja para visualizar mejor la superficie del cordón. - Mueva la jeringa de inyección en su lugar y baje lentamente hasta que la punta del capilar apenas toca la médula espinal inmediatamente lateral de cada lado de la línea media. Bloquear el brazo en su lugar.
- Usa las mediciones graduales del brazo estereotáxica en la dirección Z para hacer una medición de la posición de línea de base. De esta lectura, restar 1,3 mm. Use un movimiento a la baja rápida y poco profunda para perforar el tejido y luego baje con cuidado el capilar hasta alcanzar la nueva medición. Opcional: Si lo desea,lesiones en la columna de la dorsal pueden ser producidos por el mismo movimiento de perforación en la línea media y una profundidad de 0,3 mm (véase la discusión para más información).
NOTA: Estos valores son específicos para inyectar entre T3 y T4. Si optar para realizar la inyección en cualquier otro lugar en la médula espinal, estos valores deben ser derivados de cualquier atlas de cerebro de ratón disponibles. - Utilice el micromanipulador para deprimir lisolecitina en la sustancia blanca de la médula espinal ventral. Hacer 1 rotación del micromanipulador cada 5 s durante 2 min, lo que resulta en un volumen final de 0,5 l. Deje el capilar en lugar de 2 minutos adicionales para evitar el reflujo de la solución, y luego retirar con cuidado el capilar.
- Ate una sola sutura en el tejido muscular / adiposo superposición de la columna vertebral. Utilice una sutura no interrumpida para cerrar la piel. Aplicar más yodo que el lugar de la incisión.
- Colocar el animal en una cámara de recuperación calienta hasta que se recupere, y luego volver a su jaula. Aplicar analgésicos post-operativamente según las regulaciones de cuidado de animales institucionales. Por lo general la atención postoperatoria adicional no es necesario ya que los animales son totalmente ambulatorio y capaz de auto-alimentación y la bebida tan pronto como la recuperación de la anestesia.
- Repita el procedimiento para los demás animales.
NOTA: Con el dominio, la operación se puede completar en 10-15 min por animal, en particular con la ayuda de una segunda persona atar las suturas. Lo mismo capilar de vidrio se puede utilizar durante aproximadamente 15 a 20 cirugías antes del consejo pierde filo y debe ser reemplazado. Cirugías de control pueden ser realizadas de forma idéntica como se describe, con una inyección de PBS en la médula espinal en lugar de lisolecitina. No se recomienda la limpieza de los capilares para su uso futuro.
4. Procesamiento de tejido y análisis
- Sacrificio de los animales con una sobredosis intraperitoneal de ketamina (500 mg / kg) y xilazina (25 mg / kg) en los puntos de tiempo deseados. Las lesiones generalmente evolucionan en el follmanera debido: 1-3 días, desmielinización activa; 3-7 días, el reclutamiento OPC; 7-10 días, la diferenciación de oligodendrocitos; 10-21 días, la remielinización activa 2,10,11.
- Para preparar tejido para histología, primero realizar una perfusión transcardial 12 con 20 ml de PBS RT seguido por 20 ml enfriado en hielo 4% de paraformaldehído en PBS. Para la preparación de resina tejido embebido para la sección semi o ultrafina, consulte el paso 4.9.
- Retire la médula espinal con unas tijeras de hueso curvadas para cortar a través de cada vértebra comenzando en el extremo cervical de la columna vertebral y de trabajo hasta el nivel torácica inferior. Fijar las médulas espinales O / N en paraformaldehído al 4% en PBS a 4 ° C. Cambiar las cuerdas a 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante al menos 72 h.
- Identificar el sitio de la inyección como una anormalidad en la superficie dorsal de la médula espinal. Corte un pedazo de 3 mm de tejido (con el sitio de la inyección en el centro) y alinear las piezas en criomoldes contienen temperatura óptima de corte (OCT) compound. Suspender la parte inferior de los criomoldes en una mezcla enfriada de 2-metilbutano y hielo seco hasta que el OCT es completamente congelado. Almacenar a -80 ° C hasta el momento de la sección.
- Sección la médula espinal en un criostato a una anchura de 20 micras en portaobjetos de microscopio y dejar secar al aire O / N antes de guardar las diapositivas a -20 ° C.
- Detectar localización de la lesión y el tamaño usando un cianina eriocromo mancha histológico de la mielina 13. Realice todos los pasos a TA. Diapositivas con aire seco durante 30 minutos. Colocar los portaobjetos en agente para 1 min seguido de rehidratación en soluciones de etanol graduado (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, agua) de compensación durante 1 min cada uno.
- Colocar los portaobjetos en eriocromo cianina solución durante 15 min, seguido de un lavado de 1 min con agua. Diferenciar en hidróxido de amonio 0,5% durante 10 s, seguido de un lavado de 1 min con agua. Deshidratar en soluciones graduales de etanol (orden inverso como se describe más arriba) durante 1 minuto cada uno, cubreobjetos con medio de montaje, y la imagen en un campo brillante microscope.
- Utilice inmunohistoquímica para visualizar los axones y mielina. Diapositivas con aire seco durante 30 minutos. Deshidratar con etanol graduada (agua, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) durante 2 min cada uno a temperatura ambiente, a continuación, invertir el orden de vuelta al agua. Este paso resulta en una mayor resolución de los anillos de mielina individuales 14.
- Bloquear interacciones no específicas de anticuerpos utilizando 10% de suero de cabra y 0,25% de Triton X-100 en PBS durante 60 min a TA. Diluir anticuerpos primarios (anti-ratón SMI312 1: 2000, de conejo anti-MBP 1: 1000) en PBS y se incuba en portaobjetos de O / N a 4 ° C.
- Lavar 5 veces durante 5 min con PBS a RT. Diluir anticuerpos secundarios (Alexa 488 anti-conejo 1: 500, Alexa 546 anti-ratón 1: 500) en PBS e incubar en los portaobjetos durante 60 min a TA. Lavar 5 veces durante 5 min con PBS a RT. Monte desliza con cubreobjetos utilizando gelvatol e imagen en un microscopio de fluorescencia.
- Utilice inmunohistoquímica para visualizar las células del linaje de oligodendrocitos. Siga el procedimiento para step 4.7, omitiendo la etapa de deshidratación / rehidratación, y el uso de 10% de suero de caballo en lugar de suero de cabra. Utilice las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: cabra anti-PDGFR 1: 100, ratón anti-CC1 1: 200, de conejo anti-Olig2 1: 200. Utilice las siguientes diluciones de anticuerpos secundarios: Alexa 488 anti-cabra 1: 500, Alexa 594 anti-ratón de 1: 500, Alexa 647 anti-conejo de 1: 500.
- Para preparar el tejido para la sección semi o ultra fino, primero realizar una perfusión transcardial 12 con 20 ml RT PBS seguido de 20 ml helada paraformaldehído al 4% / 1% de glutaraldehído en PBS. Retire la médula espinal, como se describe en el paso 4.3. Fijar O / N en paraformaldehído al 4% / glutaraldehído al 1% en PBS a 4 ° C.
- Identificar el sitio de inyección como se describe en el paso 4.4. Cortar una pieza de 1 mm de tejido que contiene el sitio de la inyección. Bloques adicionales 1 milímetros a cada lado de la lesión se pueden preparar así si se desea.
- En una campana de extracción, añadir 10 veces el volumen de 1% de tetróxido de osmio / 1,5% ferrocianuro potásico a cada bloque de hielodurante 60 minutos.
NOTA: tetróxido de osmio es una sustancia altamente tóxica y debe manejarse con extremo cuidado. Todos los materiales en contacto con tetróxido de osmio se deben colocar en aceite de maíz (dos veces el volumen como una solución de tetróxido de osmio) para la neutralización. - Lavar los cables 3 veces con 0,2 M de cacodilato durante 10 min a RT, descartando en aceite de maíz. Deshidratar con soluciones de etanol graduado (agua, 50%, 70%, 90%, 2 veces con 95%, 2 veces con 100%, 2 veces con óxido de propileno) durante 10 minutos a RT.
- Cables Insertar en resina como por las instrucciones del fabricante.
- Cortar los bloques en un ultramicrotomo y montar secciones Onto gotas de agua en el microscopio. Colocar los portaobjetos en una placa caliente (aproximadamente 50 ° C) hasta que se seque.
- Visualice mielina añadiendo unas gotas de 1% de azul de toluidina solución de bórax / 2% sobre los portaobjetos durante 10-15 segundos a 50 ° C. Enjuague con agua, seca y cubreobjetos con medio de montaje. Secciones de imagen en un microscopio de campo claro.
Representative Results
Inyección focal de lisolecitina en la materia blanca ventral produce una lesión desmielinizante discreta que es detectable a una distancia de aproximadamente 3 mm (Figura 2). La tinción inmunohistoquímica de núcleo de la lesión de la mielina (MBP) y los axones (SMI312) muestra axones que han sido despojados de la mielina a los 7 días (Figura 3). Por 14 días, muchos axones están rodeados por anillos MBP-positivas, lo que sugiere la ocurrencia de la remielinización. La tinción de las células del linaje de los oligodendrocitos (PDGFRa, Olig2, CC1), hay un aumento significativo tanto en el número total de células a los 14 días en comparación con los 7 días, así como la distribución de los oligodendrocitos maduros en comparación con los OPC (Figura 4) . Consistente con este hallazgo, delgadas secciones teñidas con azul de toluidina revelan la presencia de vainas de mielina finas a los 14 días que rara vez se detectan a los 7 días (Figura 5), indicando que estos i se remyelinatednternodes.
El procedimiento es altamente reproducible entre los animales. La variación se produce cuando la respiración pesada altera la posición fija del capilar esto no suele ser un problema con sedación adecuada. El daño a los axones parece ser mínima, excepto en el centro de la lesión, que ha sido descrito desde el primer uso del modelo 1. Creemos que se trata de una lesión mecánica del capilar de vidrio, ya que también es observable en PBS inyectado controles. Sin embargo, la variabilidad tiende a ser pequeña, y nosotros y otros usando un procedimiento similar haber detectado diferencias entre las condiciones experimentales con tan sólo 4 animales por grupo 15.
Figura 1. Asamblea de la jeringa de inyección. (A) La tuerca de la jeringa de inyección se enrosca en t él extremo plano del capilar de vidrio, seguido por el 2 casquillos de tal manera que su extremos de acoplamiento de enclavamiento. Una vez que el capilar está firmemente ajustada en el casquillo cónico, el conjunto se atornilla apretado con la mano sobre el extremo de la jeringa de inyección. (B) Pieza el centro de un disco de caucho con la aguja cubo metálico unido a la jeringa de cebado y deslice hacia abajo para la base. (C) Retirar lisolecitina solución en la jeringa de cebado. (D), presionar suavemente la jeringa de cebado hasta que la primera gota de lisolecitina es visible en la punta de la aguja. (E) Inserte la jeringa de cebado en el barril de la inyección jeringa, haciendo un sello firme con el disco de goma. Presione suavemente la solución hasta que se ejecuta al final del capilar. Retirar cuidadosamente la jeringa de cebado mientras se mantiene la presión sobre el émbolo para extraer la aguja cubo metálico sin introducir burbujas de aire en la jeringa de inyección.subir / 52679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representante lisolecitina lesión se tiñeron con eriocromo cianina. Las secciones seriadas (espaciados 400 m de distancia) de una lesión lisolecitina característica a los 14 días teñidas con eriocromo cianina para visualizar la mielina (azul). Tenga en cuenta que la desmielinización está restringida a la sustancia blanca ventral y que la lesión se extiende aproximadamente 3 mm en el / dirección rostral caudal. La barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los axones y mielina enel modelo de lisolecitina. (A) Un simulado (PBS) inyecta la médula espinal a los 7 días muestra axones sanos que están rodeados por anillos de mielina. (B) A lisolecitina lesión a los 7 días muestra axones denudado, así como la mielina degradado. (C) A los 14 días, una proporción de los axones (ejemplos marcados con puntas de flecha blanca) están asociados con la reaparición de los anillos de la mielina. La barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. células del linaje de oligodendrocitos en el modelo lisolecitina. (A, C) A los 7 días, existe una mayor representación de PDGFRa + OPC (barras blancas) con relación a + oligodendrocitos CC1 (barras magenta); los números dentro de las barras representan porcentajes. Olig2 se sondeó aconfirmar la tinción de las células de linaje de oligodendrocitos. (B, C) A los 14 días, hay un aumento significativo en el número total de células de linaje de oligodendrocitos en comparación con los 7 días (p <0,05, prueba t de dos colas, n = 4 por grupo ). También hay un aumento significativo en la distribución de los oligodendrocitos a las OPC a los 14 días en comparación con los 7 días (p <0,0001, prueba exacta de Fisher). La barra de escala = 10 micras. Cada campo se captura a un aumento original de 60X. Los valores son la media ± SD. * Significa p <0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. La remielinización en el modelo de lisolecitina. (A) Un azul de toluidina en sección transversal manchado sección de la materia blanca ventral Semithin en un healthy ratón muestra axones a través de una amplia gama de calibre con las respectivas grosor de mielina. (B) A los 7 días, la falta de vainas de mielina se observa adyacente a un área no afectada (parte inferior derecha). (C) A los 14 días, las vainas de mielina finas ( ejemplos marcados con puntas de flecha roja) aparecen a lo largo de la lesión, indicativo de segmentos remyelinated. La barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Un número de modelos animales se han desarrollado para estudiar MS, más reconocible el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). En EAE, roedores se inmunizan contra un fragmento de un péptido de mielina y se someten desarrollo de la lesión inflamatoria que se manifiesta en la parálisis ascendente. Si bien este modelo ha sido útil para las pruebas preclínicas de inmunomoduladores fármacos para la EM, no es ideal para el estudio de la remielinización por tres razones principales: En primer lugar, la localización de las lesiones inflamatorias es algo al azar, y la localización de las lesiones en el tratamiento de tejidos para semi o ultrafino secciones pueden ser un reto. La segunda es que la remielinización se produce durante un transcurso de tiempo específico, y la edad exacta de una lesión única EAE no puede ser conocida sin resonancia magnética no invasiva continua. El tercero es que la remielinización es un fenómeno que ocurre naturalmente en los roedores, y la evidencia de la remielinización después del tratamiento de drogas en EAE puede no ser un resultado primario de la droga, pero enStead un fenómeno secundario de reducir la inflamación.
Otro método común de producir desmielinización se consigue introduciendo el quelante cuprizone de cobre en la dieta. Esto da lugar a la desmielinización generalizada, más notablemente en el cuerpo calloso. Existen limitaciones en el estudio del cuerpo calloso como un sitio de remielinización por las siguientes razones: En primer lugar, los diámetros de los axones (y por lo tanto el grosor de mielina) son más pequeñas que otras regiones del SNC, y por lo tanto vainas finas remyelinated pueden ser indistinguibles de aquellos que nunca fueron desmielinizada. En segundo lugar, debido a que el cuerpo calloso ratón contiene> 70% de los axones no mielinizados 16, puede ser claro si un segmento remyelinated es cierto reparación de la mielina dañada o de novo síntesis de la mielina en el adulto, que se produce normalmente 17.
Es de nuestra creencia de que el mejor modelo para el estudio de la remielinización es la inyección directa de toxinas, ya sea lisolecitina, ethidbromuro io, u otros, en los pedúnculos cerebrales caudales 18 o la sustancia blanca de la médula espinal. La localización anterior se logra solamente por inyección estereotáctica 3-dimensión precisa, y se limita a los roedores más grandes (ratas) debido al pequeño tamaño de los pedúnculos cerebelosos. Esto excluye el recurso extenso de ratones transgénicos en el estudio de- y remielinización. La médula espinal, sin embargo, contiene muchas grandes tractos de sustancia blanca que son fácilmente accesibles quirúrgicamente. Los espacios entre las vértebras en el segmento torácico rostral permite la exposición de la médula espinal sin la necesidad de una laminectomía, que es un paso necesario en los procedimientos quirúrgicos torácicos caudales. Una ventaja de apuntar específicamente la sustancia blanca ventral es que los axones son uniformemente más grande que la materia blanca dorsal, por lo que la cuantificación de la remielinización una tarea similar a los desafíos asociados con el cuerpo calloso menos ambigua. Además, la sustancia blanca ventral hace un t mucho más grandeárea de diana para inyectar; varios cientos de micras lateralmente en la región dorsal colocarían el capilar fuera de la columna, mientras que la misma desviación ventralmente todavía produciría una lesión desmielinizante prominente. Algunos protocolos inyectan lisolecitina tanto en la dorsal y ventral columnas del mismo animal 19. Esto puede aumentar tanto la probabilidad de colocación capilar adecuado y el número de lesiones cuantificables en menos animales. Si bien los datos actuales presentados es 8-10 semanas de edad los animales en el momento de la operación, también hemos tenido éxito usando el mismo procedimiento en 8-10 meses de edad ratones, donde la remielinización se describe como siendo claramente más lento 4.
La cuantificación de la remielinización no es una tarea trivial. Un dogma central postula que los segmentos remyelinated son más cortos en longitud y más delgado que el promedio de sus homólogos sanos, y por lo tanto los cálculos proporción G (diámetro axón dividido por axón + diámetro de mielina) de la sección transversal semi osecciones r ultrafinas se han convertido en un procedimiento estándar. Sin embargo, se sabe que los segmentos remyelinated espesan con el tiempo 2 y un estudio reciente usando un reportero transgénica de oligodendrocitos remielinizantes sugiere que muchos entrenudos eventualmente se convierten en indistinguibles de control 20. Cuantificar el número de oligodendrocitos maduros dentro de la lesión es una forma indirecta de medir la reparación, como oligodendrocitos son capaces de hacer un gran número de entrenudos, y una proporción significativa de la remielinización-dependiendo del modelo utilizado, puede producirse a partir de células de Schwann 3. Por supuesto, la remielinización como se ha relacionado con la restauración de la conducción saltatoria 21, la métrica final de la reparación sería la recuperación funcional de los déficits neurológicos. Mientras que la remielinización se ha relacionado con la recuperación de la función en algunas especies 22,23, no se ha convertido en un procedimiento estándar en los estudios murinos lisolecitina. Esto es probablemente debido a la falta de observ manifiestadéficits capaces de lesiones dorsales o ventrales o bien, en comparación con los modelos de desmielinización más robustas como EAE e incluso cuprizone. Creemos que los déficits funcionales resultantes de lisolecitina inyección, y la recuperación posterior con la remielinización, sólo será observable mediante pruebas sensibles de funcionamiento sensoriomotor bien.
Una búsqueda de PubMed "remielinización", junto a cualquiera de los modelos animales mencionados anteriormente, aunque un enfoque metodológico brusco, muestra un menor número de resultados de búsqueda para lisolecitina (109) en comparación con EAE (188) y cuprizone (197). Si nuestro argumento de que lisolecitina desmielinización es el enfoque superior para el estudio de la remielinización, ¿por qué es el menos discutido? Tal vez una aprehensión para el uso de este método deriva de la creencia de dificultad técnica en la realización de la operación quirúrgica. En la actualidad, este procedimiento es rápido, rentable, y no es más difícil que la disección de tejidos de rutina, que requiere materiales que son todos commercialmente disponible. Es nuestra esperanza que este protocolo sea de utilidad para aquellos que deseen añadir esta potente modelo de su repertorio para el estudio del campo emocionante y expansión de reparación de la mielina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
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