Protocol
1. Åtgärder för att utföra på dagen före analys
- Plocka L4 scen maskar till färskt nematod tillväxtmedium (NGM) plattor ympade med en matta av OP50 E. coli, och kultur dem vid 20 CO / N. Varje analys tillstånd kräver 10 maskar; plocka ett överskott av maskar för att tillåta O / N förlust av maskar.
- Endast analys djur som är första dagen vuxna; många mutanter växer med en lägre hastighet än vildtypen. Justera tidpunkten för plockning för stammar som har försenad utveckling, så att alla djur som testats är första dagen vuxna.
2. Åtgärder för att utföra på dagen för analysen
- Förberedelser för analysen:
- Utför analyser på standard unseeded 60 x 15 mm NGM plattor. Torka alla plattorna som ska användas vid 37 C under 2 timmar, med lock off. För varje experimentell studie, använd fyra torkade NGM plattor; Dessa kommer att vara 0 mm och 400 mm etanolanalysplattor och deras medföljande Acklimatisering plattor.
NOTERA:Användningen av NGM plattor är viktigt här; skillnader i sammansättningen av plattorna, i synnerhet deras osmolaritet, kan starkt påverka dossvaret av etanol på beteende, beror detta på, åtminstone delvis, på förändringar i mängden etanol ackumulerats av djuren 20. NGM agar är 160 mOsm. - Efter torkning väger var och en av de unseeded NGM plattor som skall användas i analysen och notera vikten. Bestäm volymen av mediet i plattorna baserade på vikten av en tom tallrik. För att approximera omvandlingen av vikten av agar till volymen, antar att media väger lika mycket som en lika stor volym vatten.
OBS: Våra mest konsekventa resultat har hittats med NGM media som har torkad tillräckligt att ett original 10 ml volym har en post-torkvolymen mellan 8,3-8,9 ml. Ett alternativ till 2 h torktid är att torka tills plattorna når detta volymområde för att redovisa skillnader i inkubatorer. - Smält 4 koppar ringar (innerdiameter 1.6 cm) in i ytan av var och en av plattorna för att fungera som inhägnader för de olika genotyper eller behandlingsgrupper om worms.Grasp varje ring med pincett, och värme i en flamma (en stark flamma från en Bunsen-brännare fungerar bra) för ungefär 3 sek. Placera omedelbart ringen på en tallrik medan du fortfarande håller ringen med pincett för att förhindra den från "hoppa".
- Se till att ringen vilar plant mot ytan av ägarn genom att trycka ner försiktigt med pincetten vid flera punkter på ringen. När du placerar ringen, vara noga med att lämna utrymme för ytterligare tre ringar.
- Smält de tre extra kopparringar in i ytan av plattan, var noga med att placera dem så nära varandra som möjligt, så att alla fyra kommer att vara i synfältet för kameran.
OBS: Att göra en god tätning med agar är viktigt att hålla maskarna i ringarna under analysen. Ringar som hoppar runt på plattan är osannolikt att göra rätt tätning med agar ochfår ärr agar, vilket gör att maskar att gräva och stör visualisera maskarna. - För varje analysplatta förbereda en medföljande "acklimatisering" platta, som bör torkas och oympade och kommer att få någon etanol. Placera fyra kopparringar på dessa plattor.
- Märk botten av plattorna bredvid varje ring med snäckstam som skall användas i ringen, var noga med att inte skriva i synfältet för själva ringen. Matcha etiketterna på analysplattan med dess medföljande acklimatisering platta.
- Beräkna mängden 100% etanol för att lägga till varje analysplatta så att den slutliga koncentrationen är 0 mM eller 400 mM etanol (vikt till volym). För varje experiment (n = 1), kommer det att finnas en 0 mM och en 400 mM etanol platta; Acklimatisering plattor inte får etanol. Tillsätt etanol, pipettering den runt plattans yta. Använd laboratoriefilm att täta plattan och låt det utjämna på bänken topp under 2 timmar.
- När 1,5 h har förflutit, börjar acklimatiseringen steget av analysen, steg 2.2.
- Utför analyser på standard unseeded 60 x 15 mm NGM plattor. Torka alla plattorna som ska användas vid 37 C under 2 timmar, med lock off. För varje experimentell studie, använd fyra torkade NGM plattor; Dessa kommer att vara 0 mm och 400 mm etanolanalysplattor och deras medföljande Acklimatisering plattor.
- Utför rörelseanalys: Analysplattor
- Överför försiktigt 10 maskar i varje experimentgrupp till centrum av en kopparring på acklimatisering plattan. Ta bort någon mat som är synlig på agar vid denna punkt genom att skrapa försiktigt med masken plocka. Variera ordningen i vilken de experimentella grupperna sätts på plattorna över experimentella studier så att samma stammar inte sätta på plattorna i samma ordning i studierna.
OBS: Målet är att överföra djuren till plattan med minimala mängder mat, för om mat på acklimatisering plattan överförs till analysplattan maskarna kommer aggregera runt maten och effekten av läkemedlet på locomotion kommer att skymmas. - Var noga med att inte bryta ytan av agar med pick, eftersom detta gör att maskarna att gräva och kommer att störa analysen. Inkubera maskar vid RT under 30 min.
- Se till att det finns ett lämpligt intervall mellan initieringar för varje platta. En erfaren försöksledaren kan flytta 40 djur, 10 / ring för 4 ringar i <1,5 min, men något intervall upp till 2 min är acceptabelt. Den standardanalys har filmer inspelning vid 10-12 min och 30-32 min av exponering för både 0 mm och 400 mm etanol.
- Initiera acklimatisering plåten för 0 mM exponeringen och acklimatisering plattan för 400 mM exponeringen ca 2 min och 30 sek isär för att möjliggöra sparande av den första filmfilen innan den andra filmen måste börja.
- Efter 30-minuters acklimatiseringsperiod, överföra maskar från acklimatiseringen plattorna till analysplattorna. Överför maskarna till analysplattorna (0 mm eller 400 mM etanol) i samma ordning som de läggs till acklimatisering plattan, hålla reda på timingen mellan kompletteringar av varje platta. Förslut plattan med laboratoriefilm för att minimera förlust av etanol till förångning.
- Usyns en skoprörelse med en tunn-edged tillplattad snäck pick att samla maskar ovanpå den tillplattade plocka. Utför överföringen av maskar från oympade acklimatisering plattan till analysplattan utan användning av bakterier, som vanligtvis används vid överföring av maskar, eftersom det hjälper att limma masken till pick.
OBS: Den hastighet med vilken djuren överförs i detta steg är mycket viktigt eftersom de första maskarna på plattan kommer att utsättas för etanol längre än de senaste maskar läggs till plattan, och tidigare tidpunkter kan visa några tidsberoende effekter. Detta är den främsta orsaken till roterande vilka påfrestningar placeras på en platta först över experimentella replikat.
- Överför försiktigt 10 maskar i varje experimentgrupp till centrum av en kopparring på acklimatisering plattan. Ta bort någon mat som är synlig på agar vid denna punkt genom att skrapa försiktigt med masken plocka. Variera ordningen i vilken de experimentella grupperna sätts på plattorna över experimentella studier så att samma stammar inte sätta på plattorna i samma ordning i studierna.
- Utför Locomotion analys: Filmning
- Använd ett mikroskop / kamera kombination som möjliggör samtidig avbildning av samtliga fyra ringar i synfältet (ca 42x42 mm 2 kvadrat), såsom en 0,5x mikroskopobjektiv, 0,8x förstoring och en kamera med en 2048x2048 7,481; m pixel CCD.
- Använd jämn belysning över synfältet, vilket underlättar objektigenkänning på intensitetströskeln steget (se nedan). En 3 "x3" bakgrundsbelysning fungerar bra.
- Bild maskar på en tallrik placerad media uppåt (lock nedåt), vilket genererar kontrast som går förlorad när du använder bakgrundsbelysningen jämfört med en traditionell mikroskop överförd ljuskälla.
- Förbered bildanalys programvara för att fånga tidsförlopp filmer av de rörliga maskar. Ställ programvaran för att fånga 12-bitars gråskalebilder varje 1 sek, som en 2-min (120 ram) film. För att minska storleken på utdatafilen, och ändå behålla tillräckligt bildupplösning, använd en 2x2 binning läge för att fånga 1024x1024 pixel bilder.
- Spela in filmer. Börja spela in ett 120-frame-film av den första plattan (0 mM etanol) 10 min efter sista maskar placerades på denna platta. Spara filmfil.
- Notera den andra plattan (400 mM etanol). Upprepa processen förbåda plattorna börjar 30 minuter efter de sista maskar placerades på den första plattan (0 mM etanol) för att fånga de 30-32 min tidpunkterna för varje exponering.
OBS: Låt tillräcklig tid för att spara bildfilerna efter varje fångst session innan inspelning av nästa platta som ska analyseras. - För framtiden genom heltäckande arkiverade filmer och att låta dessa filmer som ska öppnas och analyseras av andra public domain öppen källkod imaging program, såsom ImageJ 28, konvertera en kopia av varje film till 8-bitars 256 gråskala TIFF-filer.
OBS: Bilden analysprogram beskrivs här använder ett eget filformat.
- Analys av filmer med hjälp ImagePro programvara.
- När fångas, analysera filmer med hjälp av Image-Pro Plus mjukvara eller motsvarande.
OBS: En mängd andra objektspårning programvara är tillgänglig som har använts för att framgångsrikt spåra flera C. elegans på en gång 29 och en sådanprogramvara rimligen ersätta den som beskrivs här som identifieringsobjekt stegen bygger på liknande principer. Den beskrivna metoden avser Image-Pro Plus programversioner 6,0-6,3 och 7.0, nyare versioner av Image-Pro Plus programvara kan ha små skillnader. - Analysera filmer i 2-min (120 ram) segment. Först, använda ett filter på bilderna för att platta till bakgrunden och öka kontrasten för masken objekt. Välj filtret på följande sätt: Meny> Process> Filter> Enhancement> Platta: Parametrar: Bakgrund = Mörk; Feature Bredd = 20 Pix.
- Åter spara filmerna efter filtreringssteget men alltid behålla den ursprungliga filmen i sin ofiltrerad formen.
- Analysera locomotionen av djur i varje ring separat med en cirkulär region av intresse (ROI) som är placerad och dimensionerad för att överlappa med kopparringen. Identifiera och spåra maskarna med Meny> Åtgärd> Spår Objekt ... kommandot; Detta tar upp Tracking Data Tabell fönster. Knappen Tracking Alternativ tillåter vissa spår som ska undantas och begränsa eventuella experimentella artefakter.
- Under fliken Auto Tracking, använd följande parametrar: Spår Parametrar: Velocity gräns (sökradie) = 400 nm / ram, Acceleration gräns = Auto, Minsta totala spårlängd = 400 nm, Dominerande rörelse type = kaotisk; Objekt i spår parametrar: Tillåt partiella spår = yes, Min längd = 21 bildrutor, Spårning förutsägelse djup = 1 bildruta.
- För att initiera spårningsprocessen, klicka på Hitta alla spår automatiskt fungerar knappen för att få upp greven / storlek alternativ i dialogrutan och Tracking dialogrutan. Välj Manuell alternativet för Intensitet områdesval i greven / Size dialogrutan som ger den viktiga tröskeln steg som använder gråskala intensitet masken pixlar för att markera en mask objekt för analys och att ignorera de lättare bakgrundspixlar.
- Justera intensiteten tröskeln sliders (en för att ställa in den övre gränsen, en för att ställa den nedre gränsen) för att skapa en inkluderande sortiment som belyser alla mörka föremål. Ett urval av 0-1,500 på en skala från 0-4,095 är en bra utgångspunkt för finare avstämning.
- Applicera en storlek filter för att utesluta objekt som är större och mindre än en enda mask objekt, såsom kopparringen och eventuellt skräp på plattorna. Ställ två storleksparametrar för att göra detta som täcker storlekar för enskilda maskar i en mängd olika ställningar med Measure> Välj Mätningar menyalternativet på greven / storlek alternativ i dialogrutan. (Area range: 28,000-120,000 um 2 och Skalskydd sortiment: 600-2,500 um).
- Om en mutant stam är betydligt mindre eller större än andra djur på plattan som ska analyseras, bredda filterinställningarna för objektigenkänning för att rymma olika storlekar av stammarna först innan spåra djur så att inställningarna inte behöver ändras mid-analys.
- Slutför spårningsprocessen genom att klicka på Fortsätt i Tracking dialogrutan. Jämför visuellt utgångs spår med utvecklingen av varje mask i filmen för att se till att varje mask representeras om det inte finns ett giltigt skäl för att utesluta det baserat på de automatiska inställningarna filter. Manuellt ta bort låtar som producerades genom närvaron av bekräftade icke-snäckobjekt som uppfyllde storleksfilterkriterier.
- Använd programvaran för att beräkna hastigheten för varje mask mellan varje bildruta (kilometerskatt för tyngdpunkten för ett objekt per 1 sek mellan ramar) och visa den genomsnittliga hastigheten för varje spår och medelhastigheten över alla spår för befolkningen av maskar i kopparring. Tänk på detta sista genomsnitt att vara n = 1 i termer av experimentella studier. Exportera data till ett kalkylprogram för statistiska analyser och dataarkivering.
- När data har registrerats för första ringen på plattan, flytta ROI till nästa ring ochupprepa spårningsprocessen, utan att ändra någon av parametrarna.
- Beräkna relativ hastighet rörelsedelsfas genom:
- Relativ hastighet (%) = behandlad (400 mM) hastighet / obehandlade (0 mM) hastighet x 100.
OBS: Olika genetiska manipulationer förändrar ofta den basala rörelsehastigheten av djur. För att bestämma effekten av etanol på rörelsefart av djur och för att kunna jämföra dessa effekter på olika genotyper eller villkor, beräkna en relativ hastighet.
- När fångas, analysera filmer med hjälp av Image-Pro Plus mjukvara eller motsvarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa uppgifter (Figur 1) från flera olika genotyper och deras parade kontroller presenteras 8,24; data specifikt valt att belysa skillnader i de analyserade djuren. Graden av effekt vid 10 min av exponering anses den initiala känsligheten av en stam, vilken visas på vänster axlarna i Figur 1B-G. Mutanta stammar med en relativ hastighet som är större än kontrollen vid 10 minuter anses vara etanolresistenta (figur 1F, G), medan mutanta stammar med en relativ hastighet som är lägre än kontrollen anses vara överkänslig för etanol (figur 1D, E). Rätt axlar i figur 1 visar graden av återvinning av hastigheten mellan 10- och 30-min tidsperioder. Detta representerar ett mått på graden av utveckling av akut funktionell tolerans (AFT) och beräknas som den relativa hastigheten vid 10 minuter subtraheras från den relativa speed på 30 min. Stammar med större återvinningsvärden bedöms ha en snabbare utvecklingstakt av AFT jämfört med kontrolldjur (Figur 1D, F) och stammar med lägre återvinningsvärden än kontrolldjuren anses ha lägre utvecklings AFT (Figur 1C , E). Observera att den uppmätta AFT för SBP1 (ep79) (Figur 1G) är riktningen mot en negativ återhämtning men var inte statistiskt skilt från vildtypen pga stor varians (p = 0,08 för jämförelse mot N2 återhämtning). Tub-1 kodar en RUND homolog ; BBS-1 kodar för en homolog till mänsklig BBS1; läppar-7 kodar för en triacylglycerol lipas; fett-1 kodar en omega-3-fettsyra-acyl-desaturas, fett-3 kodar för ett delta-6-fettsyradesaturas; sbp-1 kodar för en homolog till humant Sterol Regulatory Element bindande proteiner (SREBPs).
Det finns flera viktiga kännetecken föruppgifter att notera: Först N2 (vildtyp) kontrolldata skiljer mellan experiment; Detta kommer sannolikt att bero på miljöfaktorer som är svåra att kontrollera, till exempel absolut vatteninnehåll eller saltkoncentration av torkade media och temperatur i laboratoriet. Typiskt nedtrycker 400 mM exogen etanol hastighet N2 till cirka 30% av de obehandlade kontrollerna; Men den absoluta graden av depression varierar från experiment till experiment. Vidare, medan cirka 12% återvinning av rörelsehastighet över 30 min i N2 är vanligtvis förväntas, här igen siffrorna varierar. Viktigt medan de absoluta nivåerna av känslighet och AFT uppvisar dag till dag variation, jämförelserna mellan genotyper eller villkor i allmänhet inte skiljer sig åt. Det vill säga, vildtyp och en mutant kommer alltid att ha likartade effekter i förhållande till varandra; om en mutant orsakar en minskning i AFT relativt vildtyp, kommer denna minskning skala med mängden AFT demonstreras av vildtyp. Detta belyservikten av utför parade kontroller på samma plattor samtidigt för stammar eller villkor som jämförs.
För det andra, de fenotyper av initial känslighet och AFT är genetiskt separera. Observera att första känslighet och akut funktionell tolerans kan variera tillsammans eller separat; exempel har inkluderats av en mängd olika fenotyper i vilken initial känslighet och AFT skiljer självständigt. En förändring i en av de fenotyper förutsäger inte en förändring i den andra fenotypen och inte heller förutsäga riktningen på ändringen av den andra fenotypen (antingen ökad eller minskad respons på etanol).
Figur 1. Första etanolkänslighet och graden av utveckling av akut funktionell tolerans (AFT) är separerbara beteendemässiga reaktioner. (A) Sammanfattande tabell förriktning effekter av mutationer i de namngivna gener på nivån av inledande känslighet för etanol och graden av utveckling av AFT, båda är i jämförelse med kontrollerna vildtyp (N2 i varje fall). (B-G) Akuta locomotion svar till 400 mM exogen etanol värderas till 10-12 min och 30-32 min av kontinuerlig etanolexponering. Relativa hastigheter (% av obehandlat hastighet) visas på vänster axel. Graderna återhämtning i hastighet visas på rätt axlarna och representerar ett mått på graden av AFT under denna 20-minuters intervall. Antalet försök jämfört är följande: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. Statistiskt signifikanta jämförelser (parade t-tester) visas: *, p <0,05; ** P <0,01. 8,24 De data som presenteras i denna figur är modifierade från 8,24. Pleasa klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den enkla neurobiologi och genetiska verktyg tillgängliga i C. elegans gör masken en utmärkt modell där för att studera de molekylära grunderna för effekterna av etanol på beteende. Här beskriver vi en analys som har använts för att identifiera flera molekylära och miljömässiga mediatorer av den akuta beteendegensvar till etanol 8,10,20,24,25. Denna metod tillåter differentiering och samtidig behandling med två olika etanolsvarsbeteende fenotyper, initial känslighet och utvecklingen av akut funktionell tolerans, som tillsammans modelkomposit fenotypen av nivån på respons hos däggdjur. Samma analys kan enkelt anpassas för att studera andra farmakologiska medel och därigenom drar fördel av den samtidiga testningen av ett flertal stammar i bedömningen av de beteendeeffekter av andra läkemedel.
Den 10-12 min tidsfönster ger en användbar tidpunkt att mäta initial känsligheten hos en stam till ethanol. Analys av effekterna av 400 mM etanol över första 10 min av exponeringen visar hastighetseffekter börjar i den andra minuten av exponering, men ett stabilt tillstånd av effekt inte uppnås förrän den sjunde minuten av etanol exponering 20. På grund av denna tidsberoende effekt på rörelsehastighet, kommer den ordning i vilken särskilda påfrestningar placeras på plattan vara viktigt för alla hastighetsmätningar före den åttonde eller nionde minut (förutsatt att det tar mindre än 2 minuter att placera alla maskar på etanolplattan). Vid dessa tidigare tidpunkter vissa maskar kommer att påverkas mer av etanol bara för att de placerades på plattan tidigare. Trots en stabil initiala effekten av etanol uppnås genom den sjunde minuten, rekommenderas att den ordning i vilken stammar placeras på plåtar varieras över upprepade försök att minimera någon systematisk effekt över stammar på grund av denna tidsberoende effekten av etanol och den tid som krävs för att flytta maskar till plate.
Specifika parametrar valdes i spårningsobjekt åtgärder för att minimera bias från maskar som upprepade gånger kolliderar med kopparringen eller med andra maskar. Objektet storlek filtersteg bör eliminera alla objekt från spårning som är större än en enda mask, inklusive två röra maskar. Om en mask vidrör en annan mask eller kopparringen då spåret slutar och det inte längre bör erkännas som en giltig föremål medan det förblir i kontakt. När masken tappar kontakten med det andra objektet, det blir ett nytt objekt och initierar ett nytt spår. Om spåret som gjorts av en mask är mindre än 20 sek i längd, då det automatiskt utesluts genom att definiera en minsta banlängd av 21 ramar. Detta filter förhindrar förekomster av en mask framåt in i ett annat objekt (mask eller ring), backning och sedan gå fram emot att röra det objektet igen, som korta anfall av snabba omsvängningar kan snedvrida totala medelhastighet av befolkningen av djur. Med hjälp av dessa inställningar, jagt är möjligt och inte ovanligt att en enda mask att bidra mer än ett spår som är större än 20 sekunder i längd (men mindre än 99 sekunder) till den totala genomsnittet. Inställningarna kan ändras så att varje mask bidrar endast ett enda spår genom att göra den minsta spårlängd 61 sek (av totalt 120 sek), men empirisk observation fastställt att denna elimineras ett stort antal spår och det konstaterades att långsammare maskar som kolliderat med andra maskar mindre ofta skulle vara överrepresenterade. Alternativt kan nya spår underkännas för att börja efter den första bildrutan i filmen men sedan maskar som kolliderar tidigt i 2-minutersperiod tas bort från analysen och användbara data skulle gå förlorade. Slutligen kan användningen av 10 maskar per kopparring är en god kompromiss mellan att ha flera representativa spår bidrar till en genomsnittlig och problemet med alltför många snäck kollisioner.
Denna beteendeanalys har flera viktigafördelar för studier av etanolresponsbeteenden i maskar. Samtidig testning av flera genotyper på samma platta är möjligt med hjälp av koppar "inhägnader." Denna innovation har flera olika fördelar. Först, i denna analys, styrtillstånd eller stam testas alltid på samma platta samtidigt som den experimentella tillstånd eller stam, och endast djur testas samtidigt är direkt jämförbara. Detta är av särskild betydelse, eftersom beteendemässiga analyser påverkas ofta av miljön, och dag-till-dag variation i beteendereaktioner kan öka bruset i analysen och minskar förmågan att detektera signaler. Den sida-vid-sida jämförelse av experimentella grupper i identiska betingelser väsentligen minskar effekten av dag-till-dag miljövariation, vilket är en stor fördel med detta tillvägagångssätt. För det andra, användningen av koppar inhägnader innehåller djur i synfältet, som tillåter locomotionen analyser som skall utföras i enbsence av mat. När berövas mat, maskar gå snabbt och tenderar att sprida på jakt efter bakterier; utan ringarna, skulle maskar lämna synfältet under analysen. Dessutom är larven repelleras av koppar och tenderar att stanna närmare mitten av ringarna, vilket gör dem lätta att visualisera. Det faktum att maskarna snabbt flytta i dessa analysbetingelser ökar väsentligen upplösning för att detektera depressiva effekterna av etanol; när maskarna rör sig långsamt, hastigheterna når golvet i förmåga att upptäcka dem tidigare. Observera att koppar är giftigt för maskar; medan ringarna inte verkar påverka akuta reaktioner till etanol analyseras i detta protokoll, förlängt inkubation av djur i ringarna (över flera timmar) rekommenderas inte. För det tredje, med denna experimentell design, kan en enda analys bedöma beteendemässiga reaktioner på upp till fyra olika experimentella grupper. Därför, den tid det tar att ackumulera statist meningsfull data minskas. I additipå, eftersom en enda digital film görs, minskar denna minnesutrymmesbehov för långsiktig lagring av primärdata. Slutligen, i varje experiment, är beteendet hos 10 individuella djur i varje försöksgrupp undersöktes. Hastigheterna för dessa 10 individer i genomsnitt för att generera en sammansatt hastighet för en enda analys, så att n = 1 prov. Denna utjämning av beteendet hos många djur minskar ytterligare variation i dessa känsliga beteendeanalyser, och ytterligare ökar upplösningen för att upptäcka subtila effekter på etanolsvars beteenden.
Det finns begränsningar i de metoder som beskrivs här, av vilka gäller för beteende analyser av eventuella muterade djur. En betydande begränsning till detta tillvägagångssätt är att muterade maskar som har mycket kraftigt reducerade basala hastigheter, på grund av dålig koordination eller nära förlamning, kan identifieras som falskt positivt för resistens mot effekterna av etanol eftersom deras uppmätta hastigheten sjunker till ett värde thpå är under tröskelvärdet för noggrann detektering för en viss avbildning setup. Eftersom de flesta spårning objekt program använder en centroid (masscentrum) som den position från vilken man mäter avståndet reste mellan ramar, kan en stationär mask som flyttar sitt huvud fortfarande genererar en förskjutning i position tyngd och att skift kan upptäckas såsom rörelse. Därför är en mask måste rör sig snabbare än vad som orsakas av subtila förändringar i kroppshållning för att mäta som sant locomotion. Maskar som utsätts för etanol är inte förlamad, men de är mycket okoordinerade, så med maskar som redan har ett underskott i locomotion är det möjligt att etanol exponering minskar sina hastigheter under denna tekniska golveffekt. Öka tiden mellan ramar så att större förändringar i kroppsposition skulle kunna skiljas från subtila förskjutningar i centroid positionen inte lösa detta problem, om tiden mellan ramar förlängs betydligt mer än 1 sekund blir det svårare för object spårningsprogram för att säkerställa att samma mask bidrar till ett spår i stället för ett spår hoppning mellan nära men inte vidrör maskar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dessa studier har finansierats med bidrag från National Institutes of Health, Institutet för alkoholism och alkoholmissbruk: R01AA016837 (JCB) och P20AA017828 (AGD och JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Schuckit, M. A.
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
- Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
- Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
- Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
- Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
- Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
- Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
- Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
- Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
- Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
- Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
- Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
- Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
- Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
- Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
- Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
- Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
- Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
- Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
- Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).
