Protocol
1. Pasos para realizar en el día antes del ensayo
- Recogida L4 etapa gusanos a medio de crecimiento fresco nematodo placas (NGM) sembradas con un césped de OP50 E. coli, y la cultura de ellos a 20 CO / N. Cada condición de ensayo requiere 10 gusanos; recoger un exceso de gusanos para permitir la O / N pérdida de gusanos.
- Sólo los animales de ensayo que son los adultos de primer día; muchos mutantes crecen a una velocidad más lenta que la de tipo salvaje. Ajuste el tiempo de la cosecha para las cepas que tienen retrasos en el desarrollo a fin de que todos los animales analizados adultos de primer día.
2. Los pasos para realizar en el día del ensayo
- Preparación para el ensayo:
- Realizar ensayos de 60 x 15 mm placas no cabezas de serie estándar NGM. Seque todas las planchas que se utilizarán a 37 ° C durante 2 horas, con tapas de descanso. Para cada ensayo experimental, utilizar cuatro NGM placas secas; Estos serán los 0 mM y mM placas de ensayo de etanol 400 y sus placas de aclimatación de acompañamiento.
NOTA:El uso de placas de NGM es importante en este caso; las diferencias en la composición de las placas, en particular, su osmolaridad, pueden afectar fuertemente la respuesta a la dosis de etanol en el comportamiento, esto es debido, al menos en parte, a los cambios en la cantidad de etanol acumulado por los animales 20. Agar NGM es de 160 mOsm. - Después del secado, pesa cada una de las placas de NGM cabezas de serie para ser utilizado en el ensayo y anotar el peso. Determinar el volumen de los medios en las placas basadas en el peso de una placa de vacío. Para aproximar la conversión de peso del agar al volumen, se supone que los medios de comunicación pesa lo mismo que un volumen igual de agua.
NOTA: Nuestros resultados más consistentes se han encontrado con los medios NGM que ha deshidratado suficientemente que un volumen original ml 10 tiene un volumen de post-secado entre 8.3 a 8.9 ml. Una alternativa para el tiempo de secado 2 hr es secar hasta que las placas llegan a este rango de volumen para tener en cuenta las diferencias en las incubadoras. - Derrita 4 anillos de cobre (diámetro interior de 1.6 cm) en la superficie de cada una de las placas para actuar como corrales para los diferentes genotipos o grupos de tratamiento de worms.Grasp cada anillo con fórceps, y el calor en una llama (una fuerte llama de un mechero Bunsen funciona bien) durante aproximadamente 3 seg. Inmediatamente coloque el anillo en un plato, mientras que mantiene el anillo con las pinzas para evitar que se 'salta'.
- Asegúrese de que el anillo descansa plana contra la superficie del agar presionando hacia abajo suavemente con las pinzas en varios puntos en el anillo. Al colocar el anillo, tenga cuidado de dejar espacio para un período adicional de tres anillos.
- Fundir los tres anillos adicionales de cobre en la superficie de la placa, teniendo cuidado de colocarlos lo más cerca posible, de manera que los cuatro estarán en el campo de visión de la cámara.
NOTA: Hacer un buen sello con el agar es esencial para mantener los gusanos en los anillos durante el ensayo. Los anillos que se saltan alrededor en la placa son poco probable que el sello correcto con el agar ypuede dejar cicatrices en el agar, que permite a los gusanos de madriguera e interfiere con la visualización de los gusanos. - Para cada placa de ensayo preparar un plato de acompañamiento "aclimatación", que debe ser seca y no cabeza de serie y no recibirán etanol. Coloque cuatro anillos de cobre en estas placas.
- Etiquetar el fondo de las placas junto a cada anillo con la cepa de gusano para ser utilizado en el anillo, teniendo cuidado de no escribir en el campo de visión del propio anillo. Coinciden con las etiquetas de la placa de ensayo con su placa de aclimatación acompaña.
- Calcular la cantidad de etanol 100% a añadir a cada placa de ensayo de manera que la concentración final es de 0 mM o 400 mM de etanol (peso a volumen). Para cada experimento (n = 1), habrá un 0 mM y una placa de etanol 400 mM; placas de aclimatación no reciben etanol. Añadir el etanol, el pipeteado de que alrededor de la superficie de la placa. Utilice película de laboratorio para sellar la placa y deje que se equilibre en la mesa de laboratorio durante 2 horas.
- Cuando ha transcurrido 1,5 horas, comenzar la etapa de aclimatación de ensayo, paso 2.2.
- Realizar ensayos de 60 x 15 mm placas no cabezas de serie estándar NGM. Seque todas las planchas que se utilizarán a 37 ° C durante 2 horas, con tapas de descanso. Para cada ensayo experimental, utilizar cuatro NGM placas secas; Estos serán los 0 mM y mM placas de ensayo de etanol 400 y sus placas de aclimatación de acompañamiento.
- Realizar el ensayo de locomoción: Las placas de ensayo
- Transferir cuidadosamente 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en la placa de aclimatación. Retire cualquier alimento que es visible en el agar en este punto, raspando suavemente con la selección gusano. Variar el orden en que los grupos experimentales se ponen en los platos entre los ensayos experimentales de modo que las mismas cepas no se ponen en los platos en el mismo orden entre los ensayos.
NOTA: El objetivo es transferir los animales a la placa con cantidades mínimas de alimentos, porque si comida en el plato de aclimatación se transfiere a la placa de ensayo de los gusanos se agregarán alrededor de la comida y el efecto de la droga sobre la locomoción será oscurecido. - Tenga cuidado de no romper la superficie del agar con la selección, ya que esto permitirá que los gusanos madriguera y interrumpirá el ensayo. Incubar los gusanos a ta durante 30 min.
- Asegúrese de que hay un intervalo adecuado entre las iniciaciones de cada placa. Un experimentador experimentado puede mover 40 animales, 10 / anillo de 4 anillos en <1,5 min, pero cualquier intervalo de hasta 2 minutos es aceptable. El ensayo estándar tiene la grabación de películas en 10-12 minutos y 30-32 minutos de exposición para ambos 0 mM y etanol 400 mM.
- Iniciar la placa de aclimatación para la exposición 0 mM y la placa de aclimatación para la exposición 400 mM aproximadamente 2 minutos y 30 segundos de separación para permitir el ahorro del primer archivo de la película antes de que debe comenzar la segunda película.
- Después de que el período de aclimatación de 30 min, la transferencia de los gusanos de las placas de aclimatación a las placas de ensayo. La transferencia de los gusanos a las placas de ensayo (0 mm o etanol 400 mM) en el mismo orden en que se añadieron a la placa de aclimatación, el seguimiento de la sincronización entre las terminaciones de cada placa. Sellar la placa con película de laboratorio para minimizar la pérdida de etanol a la vaporización.
- Use un movimiento de pala con un pico gusano delgado filo aplanado para recoger gusanos en la parte superior del pico aplanado. Realizar la transferencia de los gusanos de la placa de la aclimatación no cabeza de serie a la placa de ensayo y sin el uso de bacterias, que se utiliza comúnmente en la transferencia de los gusanos, ya que ayuda a pegar el gusano a la selección.
NOTA: La velocidad a la que los animales se transfieren en este paso es muy importante porque los primeros gusanos en la placa estarán expuestos a etanol más largo que los últimos gusanos añadieron a la placa, y los puntos de tiempo anteriores puede mostrar algunos efectos dependientes del tiempo. Esta es la principal razón para hacer girar las cepas se colocan en un plato de primera a través de repeticiones experimentales.
- Transferir cuidadosamente 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en la placa de aclimatación. Retire cualquier alimento que es visible en el agar en este punto, raspando suavemente con la selección gusano. Variar el orden en que los grupos experimentales se ponen en los platos entre los ensayos experimentales de modo que las mismas cepas no se ponen en los platos en el mismo orden entre los ensayos.
- Realizar Locomotion Ensayo: El rodaje
- Use una combinación microscopio / cámara que permite la formación de imágenes simultánea de los cuatro anillos en el campo de visión (42x42 cuadrados aproximadamente 2 mm), tal como un objetivo de microscopio 0,5x, 0,8x de aumento y una cámara con un 7,4 2048x204881; m CCD pixel.
- Utilice iluminación uniforme en todo el campo de visión, que ayuda en el reconocimiento de objetos en la etapa umbral de intensidad (véase más adelante). Una luz de fondo 3 "x3" funciona bien.
- Imagen de los gusanos en una placa colocada de lado los medios de comunicación hacia arriba (de la tapa hacia abajo), lo que genera el contraste que se pierde cuando se utiliza la luz de fondo en comparación con un microscopio tradicional fuente de luz.
- Preparar el software de análisis de imagen para capturar películas a intervalos de los gusanos en movimiento. Configure el software para capturar imágenes de 12 bits en escala de grises cada 1 seg, como a 2 min (120 marco) película. Para reducir el tamaño del archivo de salida, mientras que todavía conserva suficiente resolución de la imagen, usar un modo de binning 2x2 para capturar imágenes 1024x1024 píxeles.
- Grabe las películas. Comienza la grabación de una película 120-marco de la primera placa (etanol 0 mM) 10 min después de los últimos gusanos se colocaron en ese plato. Guarde el archivo de película.
- Registre la segunda placa (etanol 400 mM). Repita este proceso paraambas placas comenzando 30 minutos después de los últimos gusanos fueron colocados en la primera placa (etanol 0 mM) para capturar los puntos de tiempo de 30-32 min para cada exposición.
NOTA: Deje tiempo suficiente para guardar los archivos de imagen después de cada sesión de captura antes de iniciar la grabación de la próxima placa para ser analizados. - Para prueba de futuro de las películas archivados y permitir que estas películas sean abiertos y analizados por otros programas de software de imágenes de código abierto de dominio público, como ImageJ 28, convertir una copia de cada película a 8 bits 256 archivos TIFF de escala de grises.
NOTA: El software de análisis de imágenes se describe aquí utiliza un formato de archivo propietario.
- Análisis de películas usando software ImagePro.
- Una vez capturados, analizar las películas usando Plus software Image-Pro o su equivalente.
NOTA: una variedad de otros software de seguimiento de objeto está disponible que ha sido utilizado con éxito para rastrear múltiples C. elegans de una sola vez 29 y talessoftware razonablemente podría sustituir a la descrita aquí como los pasos de identificación de objetos se basan en principios similares. El método descrito se refiere a las versiones de Image-Pro Plus software 6,0-6,3 y 7.0, las versiones más recientes del software de Image-Pro Plus puede tener pequeñas diferencias. - Analizar películas en segmentos de 2 min (120 marco). En primer lugar, aplicar un filtro a las imágenes para aplanar el fondo y mejorar el contraste de los objetos de gusano. Seleccione el filtro de la siguiente manera: Menú> Proceso> Filtros> Accesorio> Acoplar: Parámetros: Antecedentes = oscuro; Característica Ancho = 20 Pix.
- Vuelva a guardar las películas después de la etapa de filtración, pero siempre conservará la película original en su forma sin filtrar.
- Analizar la locomoción de los animales en cada anillo por separado con una región circular de interés (ROI) que se coloca y dimensiona para solaparse con el anillo de cobre. Identificar y seguir a los gusanos con el Menú> Medida> Pista Objetos ... comando; esto nos lleva a la Tracking Dventana Tabla ata. El botón Opciones de seguimiento permite pistas específicas que deben excluirse y limitar los artefactos experimentales.
- En la ficha de seguimiento automático, utilice los siguientes parámetros: Parámetros de pista: límite de velocidad (el radio de búsqueda) = 400 m / marco, límite de aceleración = Auto, longitud total de pistas mínima = 400 m, tipo de movimiento predominante = caótica; Los objetos en parámetros pistas: Permitir pistas parciales = yes, longitud Min = 21 marcos, Seguimiento profundidad predicción = 1 marco.
- Para iniciar el proceso de seguimiento, haga clic en el Buscar sus temas de forma automática botón de función para abrir el / cuadro de diálogo Opciones en medidas Conde y el cuadro de diálogo de seguimiento. Seleccione la opción Manual para la Selección de rango de intensidad en el cuadro de diálogo Contador / tamaño, que proporciona el paso del umbral importante que utiliza la intensidad en escala de grises de los píxeles de gusano para resaltar un objeto gusano para el análisis y hacer caso omiso de los antecedentes más claros píxeles.
- Ajuste el sli umbral de intensidadDers (uno para establecer el límite superior, uno para establecer el límite inferior) para crear un rango inclusivo que resalta todos los objetos oscuros. Una gama de 0-1,500 en una escala de 0-4,095 es un buen punto de partida para la sintonía fina.
- Aplicar un filtro de tamaño para excluir los objetos que son más grandes y más pequeño que un solo objeto gusano, tales como el anillo de cobre y cualquier residuo en los platos. Establecer dos parámetros de tamaño para hacer esto que cubren tamaños de gusanos individuales en una variedad de posturas con la Medida> Seleccionar Mediciones elemento de menú en el cuadro de diálogo Opciones Conde / Tamaño. (Rango de Área: 28,000-120,000 m 2 y la gama Perímetro: 600-2,500 micras).
- Si una cepa mutante es significativamente más pequeño o más grande que otros animales en la placa a analizar, ampliar la gama de los valores de filtro para el reconocimiento de objetos para dar cabida a los diferentes tamaños de las cepas primero antes de seguimiento de los animales para que los ajustes no necesitan ser cambiados mediados de análisis.
- Completar el proceso de seguimiento, haga clic en Continuar en el cuadro de diálogo de seguimiento. Comparar visualmente las pistas de salida con el progreso de cada gusano en la película para asegurar que cada gusano se representa a menos que haya una razón válida para excluir que en base a la configuración de filtros automáticos. Elimine manualmente las pistas que fueron producidos por la presencia de objetos que no son gusanos confirmado que cumplían con los criterios de filtrado de tamaño.
- Utilice el software para calcular la velocidad de cada gusano entre cada fotograma (distancia recorrida por el centro de gravedad de un objeto por 1 seg entre bastidores) y mostrar la velocidad promedio para cada pista y la velocidad promedio en todas las pistas para la población de gusanos en el anillo de cobre. Considere este promedio final sea n = 1 en términos de ensayos experimentales. Exportar los datos a una hoja de cálculo para el análisis estadístico y el archivado de datos.
- Una vez que los datos han sido registrados en el primer anillo en la placa, mueva el retorno de la inversión para el siguiente anillo yrepita el proceso de seguimiento, sin cambiar ninguno de los parámetros.
- Calcular la velocidad relativa de la locomoción a través de:
- Velocidad relativa (%) = tratado (400 mM) Velocidad / no tratada (0 mm) Velocidad x 100.
NOTA: Las diferentes manipulaciones genéticas menudo alteran la tasa de locomoción basal de los animales. Con el fin de determinar el efecto del etanol sobre la velocidad de locomoción de los animales y para poder comparar estos efectos a través de diferentes genotipos o condiciones, calcular una velocidad relativa.
- Una vez capturados, analizar las películas usando Plus software Image-Pro o su equivalente.
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Representative Results
Los datos representativos (Figura 1) de varios genotipos diferentes y sus controles emparejados se presentan 8,24; datos fueron escogidos específicamente que las diferencias de relieve en los animales ensayados. El grado de efecto en 10 minutos de exposición se considera la sensibilidad inicial de una cepa, que se muestra en los ejes izquierda en la figura 1B-G. Las cepas mutantes con una velocidad relativa más grande que el control en 10 min se considera que son resistentes (Figura 1F, G) etanol, mientras que las cepas mutantes con una velocidad relativa que es menor que el control se considera que son hipersensibles a etanol (Figura 1D, E). Los ejes derecha en la Figura 1 muestran el grado de recuperación de la velocidad entre los períodos de tiempo de 10 y 30 min. Esto representa una medida de la tasa de desarrollo de la tolerancia funcional aguda (AFT) y se calcula como la velocidad relativa en 10 min resta de la SPE relativaed a los 30 minutos. Las cepas con valores de recuperación de mayor tamaño se considera que tienen un ritmo más rápido de desarrollo de la AFT en comparación con los animales control (Figura 1D, F) y cepas con valores de recuperación más bajos que los animales control se considera que tienen índices más bajos de desarrollo de AFT (Figura 1C , E). Tenga en cuenta que el AFT medido para SBP1 (ep79) (Figura 1G) es una tendencia hacia una recuperación negativa, pero no fue estadísticamente diferente de la de tipo salvaje debido a la gran varianza (p = 0,08 para la comparación contra de la recuperación N2). TUB-1 codifica un homólogo TUBBY ; bbs-1 codifica un homólogo de BBS1 humana; labios-7 codifica una lipasa triacilglicerol; grasa-1 codifica una desaturasa acilo graso omega-3, la grasa-3 codifica un ácido graso desaturasa delta-6; sbp-1 codifica un homólogo de humana esteroles Reguladora elemento vinculante proteínas (SREBPs).
Hay varias características importantes de laDatos a tener en cuenta: En primer lugar, la N2 (de tipo salvaje) datos de control difiere a través de experimentos; esto es probable que sea debido a factores ambientales que son difíciles de controlar, tales como contenido absoluto de agua o la concentración de sal de los medios secos y la temperatura en el laboratorio. Típicamente, 400 mM de etanol exógeno deprime la velocidad de N2 a aproximadamente el 30% de los controles no tratados; sin embargo, el grado absoluto de la depresión varía de experimento a experimento. Además, aunque por lo general se espera que aproximadamente el 12% de recuperación de la velocidad de locomoción más de 30 min en N2, aquí de nuevo los números varían. Es importante destacar que, mientras que los niveles absolutos de la sensibilidad y la exposición AFT variación día a día, las comparaciones entre los genotipos o condiciones no difieren en general. Esto es, de tipo salvaje y un mutante siempre tendrá efectos similares respecto a la otra; si un mutante provoca una disminución en AFT relación con el de tipo salvaje, que se escala con disminución de la cantidad de AFT demostrado por tipo salvaje. Esto pone de relieveLa importancia de realizar emparejado controles en las mismas placas al mismo tiempo para cepas o condiciones que se están comparando.
En segundo lugar, los fenotipos de sensibilidad inicial y AFT son genéticamente separables. Tenga en cuenta que la sensibilidad inicial y la tolerancia funcional aguda puede variar juntos o por separado; ejemplos se han incluido de una variedad de fenotipos en la que la sensibilidad inicial y AFT difieren de forma independiente. Una alteración en uno de los fenotipos no predice un cambio en el otro fenotipo, ni predecir la dirección del cambio de la segunda fenotipo (ya sea aumento o disminución de respuesta a etanol).
Figura 1. sensibilidad inicial de etanol y la tasa de desarrollo de la tolerancia funcional aguda (AFT) son las respuestas de comportamiento separables. Mesa (A) Resumen para ladirección de los efectos de las mutaciones en los genes nombrados en el nivel de sensibilidad inicial a etanol y la tasa de desarrollo de AFT, ambos son en comparación con los controles de tipo salvaje (N2 en cada caso). (B-G) las respuestas de locomoción agudos a 400 mM de etanol exógena se miden a 10-12 minutos y 30-32 minutos de exposición continua de etanol. Velocidades relativas (% de la velocidad sin tratar) se muestran en los ejes de la izquierda. Los grados de recuperación de la velocidad se muestran en los ejes derecha y representan una medida de la tasa de AFT durante ese intervalo de 20 min. El número de ensayos comparados es como sigue: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. comparaciones estadísticamente significativas (pruebas t pareadas) se muestran: *, p <0,05; **, P <0,01. 8,24 Los datos presentados en esta figura están modificados de 8,24. Parrendar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La neurobiología simple y herramientas genéticas disponibles en C. elegans hacer el gusano un excelente modelo en el que el estudio de las bases moleculares de los efectos del etanol sobre el comportamiento. Aquí se describe un ensayo que se ha utilizado para identificar varios mediadores moleculares y ambientales de la respuesta de comportamiento aguda a etanol 8,10,20,24,25. Este método permite la diferenciación y el examen simultáneo de dos fenotipos comportamiento de respuesta etanol diferentes, la sensibilidad inicial y el desarrollo de tolerancia aguda funcional, que juntos modelar el fenotipo compuesto de nivel de respuesta en mamíferos. El mismo ensayo puede ser fácilmente adaptado para estudiar otros agentes farmacológicos, aprovechando de este modo la prueba simultánea de múltiples cepas en la evaluación de los efectos conductuales de otras drogas.
La ventana de tiempo de 10-12 min proporciona un punto de tiempo útil para medir la sensibilidad inicial de una cepa a etHanol. Análisis de los efectos del etanol 400 mM a través de la primera 10 minutos de exposición muestra efectos de velocidad a partir de la segunda minutos de la exposición, sino un estado constante de efecto no se consigue hasta el séptimo minutos de la exposición de etanol 20. Debido a este efecto dependiente del tiempo en la velocidad de locomoción, el orden en que cepas particulares se colocan en la placa será importante para cualquier medición de velocidad anterior a la octava o novena minutos (suponiendo que se tarda menos de 2 min para colocar todos los gusanos en la placa de etanol). En estos puntos de tiempo anteriores algunos gusanos se verán más afectados por el etanol, simplemente porque fueron colocados en la placa anterior. A pesar de que un efecto estable inicial de etanol se consigue mediante la séptima minutos, se recomienda que el orden en que las cepas se colocan en placas variar entre los ensayos replicados para minimizar cualquier efecto sistemático través de las cepas debido a este efecto dependiente del tiempo de etanol y el tiempo requerido para mover los gusanos a la plate.
Los parámetros específicos fueron escogidos en los pasos de seguimiento de objetos para minimizar el sesgo de los gusanos que chocan repetidamente con el anillo de cobre o con otros gusanos. La etapa de filtro de tamaño de objeto debe eliminar cualquier objeto de seguimiento que es mayor que un solo tornillo sin fin, incluyendo dos gusanos tocar. Si un gusano toca a otro gusano o el anillo de cobre luego la pista termina y ya no debería ser reconocido como un objeto válido, mientras que permanece en contacto. Cuando el gusano pierde el contacto con el otro objeto, se convierte en un nuevo objeto e inicia una nueva pista. Si la pista hecha por un tornillo sin fin es de menos de 20 seg de largo, entonces se excluye automáticamente por la definición de una longitud de la pista mínimo de 21 marcos. Este filtro impide que las instancias de un gusano moviéndose hacia adelante en otro objeto (gusano o anillo), de marcha atrás y luego ir hacia adelante para tocar ese objeto nuevo, como ataques cortos de reversiones rápidas puede sesgar la velocidad promedio general de la población de animales. El uso de estos ajustes, it es posible y no es raro que un solo gusano contribuir más de una pista que es mayor que 20 segundos de longitud (pero menos de 99 segundos) para el promedio general. Los ajustes podrían ser alterados de manera que cada gusano sólo contribuye con una sola pista haciendo que la longitud mínima de pista 61 seg (de un total de 120 seg), pero la observación empírica determinaron que esto eliminó un número significativo de pistas y se encontró que más lento gusanos que colisionaron con otros gusanos con menos frecuencia serían excesivamente representados. Por otra parte, las nuevas pistas podrían desecharon para comenzar después del primer fotograma de la película, pero luego gusanos que chocan temprano en el período de 2 min se eliminan del análisis y se perderían los datos útiles. Finalmente, el uso de 10 gusanos por anillo de cobre representa un buen compromiso entre tener múltiples pistas representativos que contribuyen a un promedio y el problema de demasiadas colisiones de gusano.
Este ensayo conductual tiene varios importantesventajas para el estudio de los comportamientos de respuesta de etanol en gusanos. Prueba simultánea de varios genotipos en el mismo plato que es posible mediante el uso de cobre "corrales". Esta innovación tiene varias ventajas. En primer lugar, en este ensayo, la condición de control o tensión siempre se probaron en la misma placa, al mismo tiempo que la condición experimental o tensión, y sólo los animales ensayados simultáneamente se comparan directamente. Esto es de particular importancia debido a ensayos de comportamiento a menudo son influenciadas por el medio ambiente, y la variación día a día en las respuestas de comportamiento pueden aumentar el ruido en el ensayo y disminuir la capacidad de detectar señales. La comparación lado a lado de los grupos experimentales en condiciones idénticas disminuye sustancialmente el impacto de la variación ambiental en el día a día, que es una importante ventaja de este enfoque. En segundo lugar, el uso de corrales de cobre contiene animales en el campo de visión, que permite a los ensayos de locomoción a realizar en la unabsence de los alimentos. Cuando se les priva de alimentos, los gusanos se mueven rápidamente y tienden a dispersarse en busca de bacterias; sin los anillos, gusanos dejarían el campo de visión durante el curso del ensayo. Además, los gusanos son repelidos por el cobre y tienden a estar más cerca de la mitad de los anillos, haciendo que sean fáciles de visualizar. El hecho de que los gusanos se mueven rápidamente en estas condiciones de ensayo aumenta sustancialmente la resolución para detectar los efectos depresivos de etanol; cuando los gusanos se mueven lentamente, las velocidades alcanzan el suelo de la capacidad para detectar los que antes. Tenga en cuenta que el cobre es tóxico para los gusanos; mientras que los anillos no parecen afectar a las respuestas agudas para el etanol se ensayó en este protocolo, la incubación de los animales en los anillos (más de varias horas) extendido no es recomendable. En tercer lugar, con este diseño experimental, un único ensayo puede evaluar las respuestas de comportamiento de hasta cuatro grupos experimentales diferentes. Por lo tanto, el tiempo necesario para acumular datos estadísticamente significativa se reduce. En additisobre, ya que se realiza una sola película digital, esto disminuye los requisitos de espacio de memoria para el almacenamiento a largo plazo de los datos primarios. Finalmente, en cada experimento, se examina el comportamiento de 10 animales individuales de cada grupo experimental. Las velocidades de los 10 individuos se promedian para generar una velocidad de compuesto para un único ensayo, de modo que n = 1 ensayo. Este promedio del comportamiento de muchos animales disminuye aún más la variabilidad en estos ensayos de comportamiento sensibles, y aumenta aún más la resolución para detectar los efectos sutiles sobre los comportamientos de respuesta etanol.
Hay limitaciones en los métodos descritos aquí, algunos de los cuales se aplican a los análisis de comportamiento de los animales mutantes. Una limitación significativa de este enfoque es que los gusanos mutantes que han reducido muy significativamente las velocidades basales, debido a la falta de coordinación o cerca de parálisis, pueden ser identificados como falsamente positivo para la resistencia a los efectos del etanol debido a que su velocidad medida disminuye a un valor ésimoa está por debajo del umbral de detección precisa para una configuración de imagen particular. Como la mayoría de los programas de software de seguimiento de objetos utilizan un baricentro (centro de masa) como la posición desde la que medir la distancia recorrida entre bastidores, un gusano estacionaria que se mueve su cabeza todavía puede generar un cambio en la posición del centro de gravedad y que el cambio sería detectado como el movimiento. Por lo tanto un gusano necesita estar en movimiento más rápido que es causada por cambios sutiles en la postura del cuerpo con el fin de medir como verdadero locomoción. Worms expuestos a etanol no están paralizados, pero son muy descoordinada, así que con gusanos que ya cuentan con un déficit en la locomoción, es posible que la exposición de etanol disminuirá sus tasas de velocidad por debajo de este efecto suelo técnico. El aumento del tiempo entre las tramas de modo que los cambios más grandes en la posición del cuerpo sería separable de cambios sutiles en la posición centroide no resuelve este problema, si el tiempo entre tramas se alarga mucho más que 1 seg se hace más difícil para la object software de seguimiento para asegurar que el mismo gusano está contribuyendo a una pista en lugar de un salto de pista entre los gusanos cerca pero sin tocar.
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Acknowledgments
Estos estudios fueron apoyados por becas de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alcoholismo y Abuso de Alcohol: R01AA016837 (JCB) y P20AA017828 (AGD y JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
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