Protocol
1. Etapes à effectuer le jour avant la Assay
- Choisissez les vers de la scène à L4 milieu de croissance des nématodes frais (NGM) plaques ensemencées avec une pelouse de OP50 E. coli, et de la culture eux à 20 CO / N. Chaque condition d'essai nécessite 10 vers; chercher un excès de vers pour permettre O / N perte de vers.
- Seuls les animaux dosage qui sont adultes premier jour; de nombreux mutants se développent à une vitesse plus lente que le type sauvage. Réglez le moment de la cueillette pour les souches qui ont des retards de développement, afin que tous les animaux testés sont adultes de la première jour.
2. Etapes à effectuer sur le jour de l'essai
- Préparation pour le test:
- Effectuer des essais sur 60 x 15 mm plaques NGM non ensemencés standard. Sécher toutes les plaques à utiliser à 37 ° C pendant 2 heures, avec des couvercles de congé. Pour chaque essai expérimental, utilisez quatre plaques NGM séchées; ce seront les 0 et 400 mm plaques de dosage de l'éthanol et leurs plaques d'acclimatation d'accompagnement.
NOTE:L'utilisation de plaques NGM est important ici; différences dans la composition des plaques, en particulier leur osmolarité, peuvent affecter fortement la réponse à la dose d'éthanol sur le comportement, ce est due, au moins en partie, à des changements dans la quantité d'éthanol accumulé par les animaux 20. Agar NGM est de 160 mOsm. - Après séchage, peser chacune des plaques NGM non ensemencés pour être utilisé dans l'essai et noter le poids. Déterminer le volume de milieu dans des plaques par rapport au poids d'une plaque vide. Pour estimer le poids de conversion de la gélose au volume, supposons que le support pèse le même qu'un volume égal d'eau.
NOTE: Nos résultats les plus constants ont été trouvés avec les médias NGM qui a suffisamment déshydratés qu'un 10 volume d'origine ml a un volume post-séchage entre 8.3 à 8.9 ml. Une alternative au temps de séchage de 2 heures est de sécher jusqu'à ce que les plaques atteignent cette gamme de volume pour tenir compte des différences dans les incubateurs. - Faire fondre 4 anneaux de cuivre (diamètre interne de 1.6 cm) dans la surface de chacune des plaques d'agir comme enclos pour les différents génotypes ou groupes de worms.Grasp chaque bague avec une pince, et le traitement thermique à flamme (une forte flamme d'un brûleur Bunsen fonctionne bien) pour environ 3 sec. Placer immédiatement l'anneau sur une plaque tout en maintenant la bague avec la pince pour l'empêcher de «sauter».
- Assurez-vous que l'anneau repose à plat sur la surface de la gélose en appuyant doucement avec la pince à plusieurs points sur l'anneau. Lorsque vous placez l'anneau, veillez à laisser de la place pour trois anneaux supplémentaires.
- Faire fondre les trois anneaux de cuivre supplémentaires dans la surface de la plaque, en prenant soin de les placer aussi près que possible de sorte que tous les quatre seront dans le champ de vision de la caméra.
NOTE: Faire une bonne étanchéité à l'agar est essentiel de garder les vers dans les anneaux pendant l'essai. Anneaux qui sautent autour sur la plaque sont peu susceptibles de faire l'étanchéité correcte avec l'agar etpeut cicatriser la gélose, qui permet aux vers de creuser et interfère avec la visualisation des vers. - Pour chaque plaque dosage préparer une plaque d'accompagnement "d'acclimatation", qui devrait être séché et non ensemencées et recevra pas d'éthanol. Placez quatre anneaux de cuivre sur ces plaques.
- Etiqueter le fond des assiettes à côté de l'anneau avec la souche du ver à être utilisé dans le ring, en prenant soin de ne pas écrire dans le champ de vision de l'anneau lui-même. Faites correspondre les étiquettes sur la plaque d'essai avec sa plaque d'acclimatation accompagnant.
- Calculer la quantité de 100% d'éthanol pour ajouter à chaque plaque de dosage de sorte que la concentration finale est de 0 mM ou 400 mM d'éthanol (poids par volume). Pour chaque expérience (n = 1), il y aura une 0 mM et une plaque 400 mM d'éthanol; plaques d'acclimatation ne reçoivent pas l'éthanol. Ajouter l'éthanol, le pipetage autour de la surface de la plaque. Utilisez le film de laboratoire pour sceller la plaque et laisser se stabiliser sur la paillasse pendant 2 heures.
- Lorsque 1,5 heure se est écoulée, commencer à l'étape d'acclimatation de l'essai, l'étape 2.2.
- Effectuer des essais sur 60 x 15 mm plaques NGM non ensemencés standard. Sécher toutes les plaques à utiliser à 37 ° C pendant 2 heures, avec des couvercles de congé. Pour chaque essai expérimental, utilisez quatre plaques NGM séchées; ce seront les 0 et 400 mm plaques de dosage de l'éthanol et leurs plaques d'acclimatation d'accompagnement.
- Effectuer test de locomotion: plaques d'essai
- Soigneusement transférer 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d'un anneau de cuivre sur la plaque d'acclimatation. Enlevez tous les aliments qui est visible sur la gélose à ce point en grattant doucement avec le choix du ver. Variez l'ordre dans lequel les groupes expérimentaux sont mis sur les plaques à travers des essais expérimentaux de sorte que les mêmes souches ne sont pas mis sur les plaques dans le même ordre entre les essais.
NOTE: L'objectif est de transférer les animaux à la plaque avec des quantités minimales de nourriture, parce que si la nourriture sur la plaque d'acclimatation est transférée à la plaque de dosage, les vers vont se agréger autour de la nourriture et de l'effet du médicament sur la locomotion sera obscurci. - Veillez à ne pas briser la surface de la gélose à la reprise, car cela va permettre aux vers de creuser et de perturber le test. Incuber les vers à température ambiante pendant 30 min.
- Assurez-vous que il ya un intervalle approprié entre les initiations de chaque plaque. Un expérimentateur expérimenté peut déplacer 40 animaux, 10 / ring pour quatre anneaux dans <1,5 min, mais ne importe quel intervalle jusqu'à 2 min est acceptable. Le test standard a l'enregistrement de films à 10-12 min et 30-32 min d'exposition à la fois pour 0 mM et de l'éthanol 400 mM.
- Initier la plaque d'acclimatation pour l'exposition 0 mM et la plaque d'acclimatation pour l'exposition de 400 mm environ 2 min et 30 sec en dehors pour permettre économie du premier fichier de film avant le deuxième film doit commencer.
- Après la période d'acclimatation de 30 minutes, les transférer vers des plaques d'acclimatation aux plaques de dosage. Transférer les vers aux plaques d'essai (0 mm ou 400 mm) éthanol dans le même ordre qu'ils ont été ajoutés à la plaque d'acclimatation, garder la trace de la synchronisation entre les finitions de chaque plaque. Sceller la plaque avec un film de laboratoire pour minimiser la perte d'éthanol à la vaporisation.
- USE mouvement d'écopage avec un ver choix mince tranchant aplati pour recueillir vers le haut de la reprise aplatie. Effectuer le transfert de vers de la plaque d'acclimatation non ensemencée à la plaque de dosage, sans l'utilisation de bactéries, qui est couramment utilisé dans le transfert vers car il contribue à coller au ver de la reprise.
NOTE: La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très important parce que les premiers vers sur la plaque seront exposés à l'éthanol plus que les derniers vers ajoutés à la plaque, et des points de temps antérieurs peut montrer certains effets dépendant du temps. Ce est la principale raison pour faire tourner les souches sont placés sur une première plaque travers répétitions expérimentales.
- Soigneusement transférer 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d'un anneau de cuivre sur la plaque d'acclimatation. Enlevez tous les aliments qui est visible sur la gélose à ce point en grattant doucement avec le choix du ver. Variez l'ordre dans lequel les groupes expérimentaux sont mis sur les plaques à travers des essais expérimentaux de sorte que les mêmes souches ne sont pas mis sur les plaques dans le même ordre entre les essais.
- Effectuer Locomotion Assay: Tournage
- Utiliser une combinaison microscope / de caméra qui permet de imagerie simultanée de tous les quatre anneaux dans le champ de vision (environ 42x42 mm 2 carré), tel qu'un objectif de microscope 0,5x, 0,8x grossissement et une caméra avec un 2048x2048 7,481; m pixel CCD.
- Utilisez un éclairage uniforme à travers le champ de vision, ce qui facilite la reconnaissance d'objets à l'étape de seuil d'intensité (voir ci-dessous). A 3 "x3" rétro-éclairage fonctionne bien.
- Image les vers sur une plaque positionnée médias vers le haut (couvercle vers le bas), ce qui génère contraste qui est perdue lorsque le rétroéclairage par rapport au microscope traditionnelle transmise source de lumière.
- Préparer le logiciel d'analyse d'image pour capturer des films en accéléré des vers mobiles. Réglez le logiciel pour capturer des images 12 bits de gris toutes les 1 sec, comme un 2-min (120 images) film. Pour réduire la taille du fichier de sortie, tout en conservant une résolution d'image suffisante, utiliser un mode de regroupement de 2x2 pour capturer des images de 1024x1024 pixels.
- Enregistrer les films. Commencer l'enregistrement d'un film de 120 châssis de la première plaque (0 d'éthanol mM) 10 min après la dernière des vers ont été placés sur cette plaque. Enregistrez le fichier de film.
- Enregistrez la deuxième plaque (éthanol 400 mM). Répétez ce processus pourles deux plaques commençant 30 min après la dernière vers ont été placés sur la première plaque (0 mM d'éthanol) pour capturer les points de temps de 30 à 32 min pour chaque exposition.
NOTE: Prévoyez suffisamment de temps pour enregistrer les fichiers image après chaque session de capture avant de commencer l'enregistrement de la plaque suivante à analyser. - Pour l'avenir épreuvage des films archivés et pour permettre à ces films d'être ouverts et analysés par d'autres logiciels d'imagerie open source dans le domaine public, tels que ImageJ 28, convertir une copie de chaque film à 8 bits 256 fichiers TIFF d'échelle de gris.
REMARQUE: Le logiciel d'analyse d'image décrit ici utilise un format de fichier propriétaire.
- Analyse des films en utilisant le logiciel ImagePro.
- Une fois capturé, analyser les films en utilisant plus le logiciel Image-Pro ou son équivalent.
REMARQUE: Une variété d'autres logiciels de suivi d'objet est disponible qui a été utilisé pour suivre avec succès multiples C. elegans à un moment 29 et telslogiciel pourrait raisonnablement se substituer à celle décrite ici comme les étapes d'identification de l'objet sont fondées sur des principes similaires. La méthode décrite se rapporte aux versions Image-Pro Plus logiciels de 6,0 à 6,3 et 7,0, de nouvelles versions de Image-Pro Plus logiciels peut avoir des différences mineures. - Analyser les films dans les segments 2 min (120 images). En premier lieu, appliquer un filtre aux images pour aplatir le fond et à améliorer le contraste des objets à vis sans fin. Sélectionnez le filtre comme suit: Menu> Processus> Filtres> Amélioration> Aplatir: Paramètres: background = dark; Feature Largeur = 20 Pix.
- Re-enregistrer les films après l'étape de filtrage mais toujours garder le film original dans sa forme non filtré.
- Analyser le locomotion des animaux dans chaque cycle séparément avec une zone circulaire d'intérêt (ROI) qui est placé et dimensionné pour recouvrir l'anneau de cuivre. Identifier et suivre les vers avec le menu> Mesure> suivre les objets ... commande; cela soulève Tracking Dfenêtre de la table de ata. Le bouton Options de suivi permet pistes spécifiques à exclure et de limiter les artefacts expérimentaux.
- Sous l'onglet Suivi automatique, utiliser les paramètres suivants: Paramètres Piste: limite de vitesse (recherche de rayon) = 400 um / cadre, Accélération limite = Auto, la longueur minimale d'une plage totale = 400 um, le type de mouvement prédominante = chaotique; Objets dans les paramètres de pistes: Permettre aux pistes partielles = yes, longueur min = 21 cadres, suivi profondeur de prédiction = 1 cadre.
- Pour lancer le processus de suivi, cliquez sur le Trouver toutes les pistes automatiquement touche fonction pour faire apparaître le / boîte de dialogue Options de taille de comte et la boîte de dialogue de suivi. Sélectionnez l'option Manuel pour la sélection de gamme d'intensité dans la boîte de dialogue comte / Taille, qui fournit l'étape de seuil importante qui utilise l'intensité d'échelle de gris, le ver pixels de mettre en évidence un objet de ver pour analyse et d'ignorer les légers fond pixels.
- Réglez le seuil d'intensité sliDER (une pour définir la limite supérieure, une pour définir la limite inférieure) pour créer une gamme inclusive qui met en évidence tous les objets sombres. Une gamme de 0-1,500 sur une échelle de 0-4,095 est un bon point de départ pour le réglage plus fin.
- Appliquer un filtre de taille pour exclure les objets qui sont plus grandes et plus petit qu'un objet ver unique, comme l'anneau de cuivre et tous les débris sur les plaques. Placer les deux paramètres de taille pour ce faire que couvrent tailles pour chaque ver dans une variété de postures avec la mesure> sélectionner les mesures élément de menu sur la boîte de dialogue des options comte / Taille. (Gamme Area: 28,000-120,000 um 2 et la gamme Périmètre: 600-2,500 um).
- Si une souche mutante est nettement plus petit ou plus grand que les autres animaux sur la plaque pour être analysé, élargir la gamme des paramètres de filtre pour la reconnaissance d'objet pour accueillir les différentes tailles des souches avant de suivre les animaux afin que les paramètres ne ont pas besoin d'être changé mi-analyse.
- Achever le processus de suivi en cliquant sur Continuer dans la boîte de dialogue de suivi. Comparer visuellement les pistes de sortie avec les progrès de chaque ver dans le film afin de se assurer que chaque ver est représenté moins qu'il y ait une raison valable pour exclure sur la base des réglages automatiques de filtrage. Supprimez manuellement les pistes qui ont été produites par la présence d'objets non-ver confirmés qui répondaient aux critères de filtrage de taille.
- Utilisez le logiciel pour calculer la vitesse de chaque ver entre chaque cadre (distance parcourue pour le centre de gravité d'un objet par une sec entre les cadres) et afficher la vitesse moyenne pour chaque piste et la vitesse moyenne sur toutes les pistes pour la population de vers dans le anneau de cuivre. Considérez cette moyenne finale soit n = 1 en termes d'essais expérimentaux. Exporter les données vers un tableur pour les analyses statistiques et l'archivage des données.
- Une fois que les données ont été enregistrées pour le premier anneau sur la plaque, déplacer le ROI à l'anneau suivant etrépéter le processus de suivi, sans modifier les paramètres.
- Calculer la vitesse relative de la locomotion à travers:
- La vitesse relative (%) = traité (400 mM) de vitesse / non traitée (0 mm) Vitesse x 100.
REMARQUE: les manipulations génétiques différentes modifient souvent le taux de la locomotion de base des animaux. Afin de déterminer l'effet de l'éthanol sur la vitesse de locomotion des animaux et d'être en mesure de comparer ces effets à travers différents génotypes ou conditions, calculer une vitesse relative.
- Une fois capturé, analyser les films en utilisant plus le logiciel Image-Pro ou son équivalent.
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Representative Results
Les données représentatives (figure 1) de plusieurs génotypes différents et leurs contrôles appariés sont présentés 8,24; données ont été spécifiquement choisis que les différences de mettre en évidence chez les animaux testés. Le degré d'effet à 10 min de l'exposition est considérée comme la sensibilité initiale d'une souche, qui est représentée sur les axes de gauche de la figure 1B-G. Les souches mutantes avec une vitesse relative plus grande que le contrôle à 10 min sont considérés comme résistant (figure 1F, G) de l'éthanol, tandis que les souches mutantes avec une vitesse relative qui est inférieure à celle du témoin sont considérés comme étant une hypersensibilité à l'éthanol (figure 1D, E). Les axes de droite dans la figure 1 montrent le degré de récupération de la vitesse entre les périodes de 10 et 30 min. Cela représente une mesure de la vitesse de développement de la tolérance aiguë fonctionnelle (AFT) et est calculée comme la vitesse par rapport à 10 min soustrait du rapport SPEed à 30 min. Souches avec des valeurs de récupération plus grandes sont considérés comme ayant un taux plus rapide du développement de l'AFT par rapport aux animaux témoins (figure 1D, F) et les souches avec des valeurs de récupération plus faibles que les animaux de contrôle sont considérées comme ayant des taux inférieurs de développement de l'AFT (figure 1C , E). Notez que l'AFT mesurée pour SBP1 (ep79) (figure 1G) est une tendance vers une reprise négatif, mais ne était pas statistiquement différent du type sauvage en raison de grande variance (p = 0,08 pour la comparaison avec la récupération N2). Bain-1 code pour un homologue de TUBBY ; BBS-1 code pour un homologue de BBS1 humaine; lèvres-7 code pour une lipase triacylglycérol; fat-1 code pour une désaturase gras oméga-3 acyle; graisse-3 code pour une désaturase delta-6 acide gras; SBP-1 code pour un homologue de Regulatory Element humaine stérols protéines de liaison (SREBPs).
Il existe plusieurs caractéristiques importantes de ladonnées à noter: d'abord, la N2 (-type sauvage) des données de contrôle diffère selon les expériences; ce est probablement dû à des facteurs environnementaux qui sont difficiles à contrôler, comme la teneur absolue de l'eau ou de la concentration de sel des médias secs et de la température dans le laboratoire. Typiquement, 400 mM d'éthanol exogène appuie sur la vitesse de N2 à environ 30% des témoins non traités; mais le degré absolu de la dépression varie d'une expérience à. En outre, tandis qu'environ 12% de récupération de la vitesse de locomotion plus de 30 min en N2 est généralement prévu, là encore les chiffres varient. Surtout, alors que les niveaux absolus de sensibilité et exposition AFT variation au jour le jour, les comparaisons entre les génotypes ou conditions ne diffèrent pas généralement. Ce est, de type sauvage et un mutant aura toujours des effets similaires par rapport à l'autre; si un mutant provoque une diminution de l'AFT par rapport au type sauvage, cette diminution sera l'échelle avec le montant de l'AFT démontré par type sauvage. Cela met en évidencel'importance d'effectuer des contrôles sur les mêmes plaques jumelé en même temps pour les souches ou les conditions qui sont comparées.
Deuxièmement, les phénotypes de sensibilité initiale et AFT sont génétiquement séparables. Notez que la sensibilité initiale et tolérance fonctionnelle aiguë peut varier ensemble ou séparément; Des exemples ont été inclus d'une variété de phénotypes et dans laquelle la sensibilité initiale AFT diffèrent de façon indépendante. Une modification de l'un des phénotypes ne signifie pas un changement dans le phénotype autre, ni de prédire la direction du changement du phénotype seconde (soit augmentée ou diminuée réponse à l'éthanol).
Figure 1. sensibilité d'éthanol initial et le taux de développement de la tolérance fonctionnelle aiguë (AFT) sont des réponses comportementales séparables. Table (A) Résumé pour lesens des effets de mutations dans les gènes nommés sur le niveau de sensibilité initiale à l'éthanol et le taux de développement de l'AFT, les deux sont en comparaison avec les contrôles de type sauvage (N2 dans chaque cas). (B-G) Réponses aigus de locomotion 400 mM éthanol exogène sont évalués à 10-12 min et 30-32 min d'exposition à l'éthanol continue. Vitesses relatives (% de la vitesse non traitée) sont indiquées sur les axes de gauche. Les taux de récupération de la vitesse sont indiquées sur les bons axes et représentent une mesure du taux de l'AFT pendant cet intervalle de 20 min. Le nombre d'essais est comparé comme suit: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. comparaisons statistiquement significatives (tests t jumelés) sont présentés: *, p <0,05; **, P <0,01. 8,24 Les données présentées dans cette figure sont modifiés de 8,24. Plouer cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La neurobiologie simple et des outils génétiques disponibles en C. elegans faire le ver un excellent modèle pour étudier les bases moléculaires des effets de l'éthanol sur le comportement. Ici, nous décrivons un test qui a été utilisé pour identifier plusieurs médiateurs moléculaires et environnementaux de la réponse comportementale aiguë en éthanol 8,10,20,24,25. Cette méthode permet la différenciation et l'examen simultané des deux phénotypes de comportement de réponse de l'éthanol, différentes sensibilité initiale et le développement de la tolérance aiguë fonctionnelle, que le phénotype modéliser ensemble composite de niveau de réponse chez les mammifères. La même analyse pourrait être facilement adapté pour étudier d'autres agents pharmacologiques, profitant ainsi de l'inspection simultanée de plusieurs souches dans l'évaluation des effets sur le comportement d'autres médicaments.
La fenêtre de temps de 10 à 12 min fournit un point de temps utile de mesurer la sensibilité d'une souche initiale de etHanol. L'analyse des effets de l'éthanol 400 mM dans les 10 premières minutes de l'exposition montre des effets de vitesse à partir du deuxième minute de l'exposition, mais un état d'équilibre de l'effet ne est pas atteint jusqu'à la septième minute de l'exposition à l'éthanol 20. En raison de cet effet dépendant du temps sur la vitesse de locomotion, l'ordre dans lequel souches particulières sont placés sur la plaque sera important pour toutes les mesures de vitesse avant la huitième ou neuvième minute (en supposant qu'il prend moins de 2 min de placer tous les vers sur la plaque de l'éthanol). À ces points de temps antérieurs certains vers seront plus touchées par de l'éthanol, simplement parce qu'ils ont été placés sur la plaque plus tôt. Même si un effet stable initiale d'éthanol est obtenu par la septième minute, il est recommandé que l'ordre dans lequel les souches sont placés sur des plaques varier entre les essais répétés afin de minimiser tout effet systématique travers souches en raison de cet effet dépendant du temps d'éthanol et le temps nécessaire pour se déplacer vers la platee.
Les paramètres spécifiques ont été choisis dans les étapes de suivi de l'objet de minimiser les biais des vers qui se heurtent à plusieurs reprises avec l'anneau de cuivre ou avec d'autres vers. Le filtre étape de taille de l'objet devrait éliminer ne importe quel objet du suivi qui est plus grand qu'un seul ver, dont deux vers touchants. Si un ver touche un autre ver ou l'anneau de cuivre, puis la piste se termine et il ne devrait plus être reconnu comme un objet valide alors qu'il reste en contact. Lorsque le ver perd le contact avec l'autre objet, il devient un nouvel objet et initie une nouvelle piste. Si la piste fait par un ver est inférieur à 20 sec de longueur, alors il est automatiquement exclu en définissant une longueur de piste minimum de 21 cadres. Ce filtre empêche cas d'un ver aller de l'avant dans un autre objet (ver ou anneau), renversant puis aller de l'avant de toucher à nouveau cet objet, comme des épisodes courts de renversements rapides peut biaiser la vitesse moyenne globale de la population d'animaux. L'utilisation de ces paramètres, it est possible et pas rare pour un seul ver à contribuer plus d'une piste qui est supérieure à 20 sec de longueur (mais moins de 99 secondes) à la moyenne globale. Les paramètres peuvent être modifiés de sorte que chaque ver ne contribue une seule piste en faisant la longueur de piste minimum 61 sec (sur un total de 120 sec), mais l'observation empirique déterminé que ce qui a éliminé un grand nombre de pistes et il a été constaté que plus lente vers qui entre en collision avec d'autres vers seraient moins souvent être sur-représentés. Sinon, de nouvelles pistes pourraient être refusés pour commencer après la première image de la vidéo mais alors vers qui entrent en collision au début de la période de 2 min sont retirés de l'analyse et des données utiles serait perdu. Enfin, l'utilisation de 10 vers par anneau de cuivre représente un bon compromis entre avoir plusieurs pistes représentatifs contribuant à une moyenne et le problème du trop grand nombre de collisions de vers.
Ce test comportemental a plusieurs importantesavantages pour l'étude des comportements d'intervention d'éthanol dans les vers. Test simultané de plusieurs génotypes sur la même plaque est possible grâce à l'utilisation de cuivre "corrals." Cette innovation présente plusieurs avantages distincts. Tout d'abord, dans ce test, l'état de commande ou de la souche est toujours testés sur la même plaque en même temps que l'état ou de la souche expérimentale, et seuls les animaux testés simultanément sont directement comparés. Ceci est particulièrement important parce que les essais de comportement sont souvent influencées par l'environnement, et la variation de jour en jour dans les réponses comportementales peuvent augmenter le bruit dans le dosage et réduire la capacité à détecter des signaux. La comparaison côte-à-côté de groupes expérimentaux dans des conditions identiques diminue sensiblement l'impact de la variation de l'environnement au jour le jour, ce qui est un avantage majeur de cette approche. Deuxièmement, l'utilisation de cuivre contient enclos des animaux dans le champ de vision, ce qui permet des dosages de locomotion à être effectuées dans l'unbsence de nourriture. Lorsque la privation de nourriture, les vers se déplacent rapidement et ont tendance à se disperser à la recherche de bactéries; sans que les bagues, les vers laisseraient le champ de vision au cours de l'essai. En outre, les vers sont repoussés par le cuivre et ont tendance à rester plus près du milieu des anneaux, ce qui les rend faciles à visualiser. Le fait que les vers déplacent rapidement dans ces conditions d'essai augmente considérablement la résolution pour détecter les effets dépressifs d'éthanol; lorsque déplacent lentement vers, les vitesses atteignent le plancher de la capacité à les détecter plus tôt. A noter que le cuivre est toxique pour les vers; tandis que les anneaux ne semblent pas affecter les réponses aiguës en éthanol dosé dans ce protocole, étendu incubation des animaux dans les anneaux (pendant plusieurs heures) ne est pas recommandée. Troisièmement, avec cette conception expérimentale, un seul essai peut évaluer les réponses comportementales de jusqu'à quatre groupes expérimentaux différents. Par conséquent, le temps nécessaire pour accumuler des données statistiquement significative est diminuée. En additisur, car un seul film numérique est faite, ce qui diminue les besoins en espace de mémoire pour le stockage à long terme des données primaires. Enfin, dans chaque expérience, le comportement des animaux 10 individuels de chaque groupe expérimental est examinée. Les vitesses de ces 10 individus sont en moyenne pour générer une vitesse composite pour un seul essai, de sorte que n = 1 procès. Cet étalement de la conduite de nombreux animaux diminue encore la variabilité dans ces essais comportementaux sensibles, et augmente en outre la résolution pour détecter des effets subtils sur les comportements de réponse de l'éthanol.
Il ya des limites aux méthodes décrites ici, dont certaines se appliquent à des analyses comportementales de tous les animaux mutants. Une limite importante de cette approche est que les vers mutants qui ont très sensiblement réduit la vitesse de base, en raison de manque de coordination ou de quasi-paralysie, peuvent être identifiés comme faussement positif pour la résistance aux effets de l'éthanol parce que leur vitesse mesurée diminue à une valeur eà est inférieur au seuil de détection précise d'une installation de formation d'image particulier. Comme la plupart des logiciels de suivi d'objet utilisent un barycentre (centre de masse) que la position à partir de laquelle mesurer la distance parcourue entre les cadres, un ver fixe qui se déplace la tête peut encore générer un changement dans la position du centre de gravité et ce changement serait détecté que le mouvement. Par conséquent un ver doit se déplacer plus rapidement que ce qui est causée par des changements subtils dans la posture du corps afin de mesurer aussi vrai locomotion. Worms exposés à l'éthanol ne sont pas paralysés mais ils sont très désordonnée, donc avec des vers qui ont déjà un déficit dans la locomotion, il est possible que l'exposition de l'éthanol va diminuer leurs taux de vitesse inférieure à cet effet de plancher technique. L'augmentation du temps entre les images de sorte que les grands changements dans la position du corps serait séparable de subtils changements dans la position centroïde ne résout pas ce problème, si le temps entre les images est allongé beaucoup plus que 1 sec il devient plus difficile pour object logiciel de suivi pour se assurer que le même ver contribue à une piste plutôt que d'un saut de piste entre les vers à proximité, mais ne se touchent pas.
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Acknowledgments
Ces études ont été soutenus par des subventions des Instituts nationaux de la santé, Institut national de l'alcoolisme et l'abus d'alcool: R01AA016837 (JCB) et P20AA017828 (AGD et JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
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