Summary
Biz kemik klimalı ortam (BCM) hazırlamak ve in vitro faaliyetlerini testi nasıl burada açıklamak.
Abstract
Otolog kemik greftleri yaygın ağız ve çene cerrahisi, ortopedi, travmatoloji ve kullanılmaktadır. Otolog kemik greftleri tek eksik kemik yerini, aynı zamanda kemik rejenerasyonu karmaşık sürecini desteklemek. Otogreftlerde Bu olumlu davranış üç özelliklerine atfedilen: osteoconductivity, osteogenicity ve Osteoindüktivite. Ancak, başka bir yönü vardır: Kemik kemik rejenerasyonu yer mezenkimal hücreler hedefleyebilir büyüme faktörleri de dahil olmak üzere moleküller, sayısız serbest greft. kemik greftleri parakrin özellikleri kemik koşullu ortam (BCM) kullanılması ile in vitro olarak incelenebilir. Burada ısıl işlem veya demineralizasyonuna uygulanan bir yerel domuz kortikal kemikten kemik klimalı ortam hazırlamak için nasıl protokolü ve kemik sunuyoruz. Hücreler doğrudan BCM maruz ya da kolajen membranların, daha önce BCM ile ıslatılmış olarak biyomalzemeler, üzerine numaralı seribaşı olabilir. Biz in vitro bioassa için örnekler verirTGF-β ayarlı genlerin ifadesi üzerindeki mezenkimal hücreler ys. sunulan protokoller ayrıca kemik rejenerasyonu esnasında kemik grefti parakrin etkileri ortaya koymak ve rekonstrüktif cerrahi geniş alanda translasyonel araştırma için bir yol açmak için teşvik etmelidir.
Introduction
Otolog kemik yaygın bir malformasyon sonucu, rezektif cerrahi, rekonstrüktif travma cerrahisi, ve önceki implant yerleştirme 1,2 olarak meydana gelen kusurları köprü için kullanılır. Kemik greftleri greft konsolidasyon sürecini destekleyen nasıl biyolojik prensiplerini anlamak otogreftleri rekonstrüktif cerrahi altın standart olarak kabul edilir anlamak için tek anahtar değil, aynı zamanda kemik yerine kullanılan 3 geliştirilmiş tasarımı Biyonik olduğunu. Yine, greft konsolidasyon hızlı otolog kemik kemik 4,5 'yerine göre olduğunu. Böylece, kemik rejenerasyonu desteklemek için çok etkili otolog kemik yapmak moleküler ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için zorunludur.
Konsolidasyon süreci 6,7 desteklemek için kabul edilen otogreftlerde üç ders kitabı özellikleri vardır. İlk olarak, otolog kemik büyümesi yeni oluşan kemik için rehberlik sağlayarak, osteokondüktif olduğunudefekt içine. İkincisi, otolog kemik o osteoblast 8 ayırt edebilirsiniz mezenkimal hücreler içerdiğini, yani osteojenik olduğunu. Matris içinde Gömülmüş kemik morfogenetik proteinleri gibi büyüme faktörleri endochondral hatta intramembranöz kemik oluşumu 9 sürecini başlatabilir gibi Üçüncüsü, otolog kemik osteoindüktif olduğunu. Başka bir yönü var: taze hazırlanmış kemik fiş "kemik klimalı ortamda" 10-15 ile in vitro gözlemlere dayalı bir parakrin fonksiyon tutun. Ayrıca miyelopoezle etkisi 16 söz edilmelidir. "Demineralize kemik matriks klimalı ortam" Benzer bir terim zaten demineralizasyon 17 tarafından işlenen bile, 1996 yılında icat ve kemik parakrin fonksiyon genel konsepti destekliyor edildi. Bizim amaçlarımız için, BCM 10,11 altçeneleri taze domuz hazırlanabilir. BCM proteomik analizler büyüme aslında da dahil olmak üzere, karmaşık kompozisyon ortayaors ve hücre dışı matris 10 bileşenleri, aynı zamanda bütün kemik 18,19 proteazomun üzerinde mevcut bilgi uzanan. Böylece, BCM in vitro kemik grefti çeşitli değişiklikler yayımlanan aktivitesini yansıtmalıdır.
Mezenkimal hücreler, örneğin kemik cips veya oral yumuşak dokusundan izole olanlar için, BCM? In vitro maruz kaldığında ne olur, BCM osteojenik ve adipojenik farklılaşma azaltır ve IL11 ifade 11 güçlü bir artış kışkırtır. Genom mikrodizi diferansiyel BCM tepki olarak mezenşimsel hücrelerde ifade edilmesi daha fazla gen ortaya çıkardı. Bu genler arasında adrenomedüllin (ADM) vardır, IL11, IL33, NADPH oksidaz 4 (NOX4), proteoglikan 4 (PRG4 veya lubricin) ve 3 (PTX3) 15 pentraksin. Otoklava kemik cips elde edilen BCM ilgili genlerin 14 ifadesini değiştirmek için başarısız oldu. Pastörizasyon uygulanan ve donma kemik cips BCM başardıGen ekspresyonu 14 değiştirin. Minerali alınmış kemik matrisi (DBM-cm) da koşullandırılmış ortam, TGF-β-ayarlı genlerin 20 ekspresyonunu değiştirir. İlginçtir, çevredeki yumuşak doku 21,22 kemik yongaları korumak için kullanılan kollajen bariyer membranlar, gen ifadesi 23 değişikliklerden sorumlu olan BCM bu parçaların adsorbe. BCM, araştırma birkaç isim, örneğin kemik erimesi ile ilgili osteoklastı ve endotelyal hücreler gibi kemik rejenerasyonu yer alan diğer hücre tipleri için genişletilebilir. Genel olarak, biriken in vitro veriler bir klinik öncesi çalışmanın tasarımı için bilimsel temelini oluşturmaktadır.
Mevcut protokol iki yönlüdür: Birincisi, BCM hazırlamak için nasıl gösterir. İkinci olarak, bu in vitro mezenkimal hücreler göre biyolojik etkinliğini test etmek için nasıl kullanılacağını gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BCM Hazırlık
- Mümkün olduğunca taze yerel kasap domuz çene kemiklerini edinin. Sağlam bir yüzeye yerleştirin altçeneleri ve tam kalınlıkta flep herhangi bir yumuşak doku bırakın veya kemiğe bağlı periost değil özel dikkat bırakın. Akış kaputu altında çalışmak gerek kalmadan temiz bir ortamda çalışın.
- Tam kalınlıkta flep yayımlandıktan sonra, bukkal taraftan kemik cips hasat kemik kazıyıcı kullanın. Kemik kazıyıcı keskin olması gerektiğini lütfen unutmayınız. Sıkıca kemik kazıyıcı Kulp ve uzun hareketler kemik toplamak ile. Daha küçük o 1mm kemik cips atın.
- Doğal kemik parçası muhafaza edilmesi için,% 1 antibiyotik ve bunları kurumasına izin vermeden antimikotik ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle ortamı (DMEM) olan 10 cm çaplı plastik tabaklar doğrudan kemik parçası yerleştirin.
- Isıl işlem etkisini değerlendirmek için, söz konusu kemik cipsi, 80 ° C'de 30 dakika boyunca pastörizasyon ya da121 ° C'de 20 dakika süreyle otoklav.
- , Mineralden arındırma etkisini değerlendirmek, 4 ° C'de 4-6 saat boyunca 1 M HCI kemik yongaları çalkalayın ve pH nötr olana kadar, kültür ortamı ile tekrar tekrar yıkamak için.
- Yeni bir plastik çanak içine% 1 antibiyotik ve antimikotik ile desteklenmiş 10 ml taze DMEM başına kemik yongaları 5 g toplam yerleştirin.
- 24 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir atmosferde plastik tabaklar yerleştirin. Sonra, hasat BCM. Santrifüj, artığın ayrılması steril (0.2 mil) filtre ve -80 ° C'de dondurulur alikotları tutmak için 10 dakika boyunca 200 x g'de BCM.
- Kullanımdan hemen önce, BCM stok çözülme ve dondurma ve eritme tekrar döngülerinden kaçınmak.
- Belirtilen deneyler için, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile, BCM ya da serum içermeyen ortam ile kolajen zarları ıslatın. PBS ile kuvvetli bir şekilde membranlar yıkayın ve 96 gözlü levhalar içine yerleştirin. Islak membranlar hücreleri ile tohumlanır.
- BCM hazırlık süreci Şekil 1'de özetlenmiştir.
Mezenkimal Hücreler dayanarak 2. biyolojik tayinler
- / Cm2 30,000 hücrelik bir konsantrasyonda olan bir 12-çukurlu plaka içinde (örneğin, kemik hücreleri, diş eti ve periodontal ligament fibroblastlar için) Tohum insan mezenkimal hücreler. Hücreler DMEM oluşan büyüme ortamı,% 10 fetal buzağı serumu ve antibiyotiklerin kullanımı tohum. Hücreler plaka O / N eklemek edelim.
- Kültür ortamı atılır ve 37 ° C'de önceden ısıtılmış hücrelerin PBS ile yıkayın. Ve% 20 BCM olmayan önceden ısıtılmış serum içermeyen kültür ortamı eklenerek hücrelerini uyarır. 24 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir atmosferde hücreleri yerleştirin.
- , Kültür ortamı atın önceden ısıtılmış PBS ile hücreleri durulayın ve tercih protokole göre RNA ayıklayın.
- Her örnek için RNA ile aynı miktarda olması için RNA konsantrasyonu ayarlayın. CDNA'lar hazırlayın ve Tablo 1 'de gösterilen primerler kullanılarak seçilen genleri analiz etmek için QRT-PCR işlemi gerçekleştirmek.
NOT: Bu her bileşenin seyreltmeleri şunlardır: 2x SYBR Green, 20x astar ileri, 20x primer ters, 5x steril DD su, 5x cDNA. QRT-PCR ile 95 ° C 15 saniye 40 döngü, 60 ° C 1 dakika içinde gerçekleştirilir. - CT GAPDH ve Δ (ACt) ACt uyarılmış olduğunu - - ACt kontrol ACt BT hedef Δ (ACt) yöntemini kullanarak temizlik gen GAPDH'ye normalleştirilmesi ile bağıl ifade seviyelerini hesaplayın.
- Bu kalite kontrolü sonra, mezenkimal hücreler, hematopoietik hücreleri ya da endotel hücreleri dahil olmak üzere bütün hücre tipleri uyarmak için, kültür ortamına BCM ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemik koşullandırılmış ortam, taze domuz kemik parçacıkları hazırlanır. Işlem genel bakış BCM hazırlamak ve BCM ile kombinasyon halinde biyomalzemeleri kullanımı, Şekil 1, sırasıyla, Şekil 2 'de gösterilmiştir. BCM hazırlanması sırasında, nihai BCM kalitesini etkileyebilir kısa hareketler ya da çok küçük kemik cips sürece hareketlerle büyük kemik cips elde etmek önemlidir. ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 ve PRG4 (Şekil 3): BCM Kalitesi BCM, hedef genlerin gen ekspresyonunu analiz etmek suretiyle kontrol edilebilir. ADM ve PTX3 0.4 kat kadar aşağı regüle edilir ve 200 kat up-regüle IL11, IL33, NOX4 ve PRG4 olabilir. Oral fibroblastlar gösterilen seviyede BCM, hedef genleri ifade yoksa hücre sağlığını kontrol etmek veya yeni mandibulası yeni BCM hazırlanması. Bir kollajen membran üzerine ekilir ve diş fibroblastlarda BCM hedef genlerin sentezlenmesi 4 görüntüler tipik sonuçlar Şekil. Oral fibroblastlar pastörize kemik parçacıkları şartlandırılmış ortam ve demineralize kemik yongaları şartlandırılmış ortam% 20 ile uyarılmış, BCM (Tablo 2 ve Tablo 3) ile uyarılmış hücrelerde benzer gen ekspresyonunu göstermiştir. Bununla birlikte, ağızdan fibroblast gen ekspresyonu, sterilize (121 ° C) kemik parçacıkları kıvamlandırılmış ortam maruz un ile uyarılmış kontrollere benzerdi.
Şekil 1. Taze domuz altçeneleri kemik klimalı ortam hazırlamak için kullanılan prosesin Özeti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. ÖzetiBCM ile mezenkimal hücreler dayalı biyoanalizlerin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Oral fibroblast kemik klimalı ortam hedef genlerin 3. Gen ifadesi Şekil. BCM. Genler ADM ve PTX3 kalitesini kontrol etmek için kullanılan altı genlerin tipik sonuçlar downregüle (A) ve IL11, IL33, NOX4, PRG4 (B) upregüle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Kemik conditione gen ifadesiBir kollajen membran üzerine numaralı seribaşı sözlü fibroblast d orta hedef genler. BCM kalitesini kontrol etmek için kullanılan altı genlerin tipik sonuçlar. Genler ADM ve PTX3 downregüle (A) ve IL11, NOX4, PRG4 (B) upregüle. Kullanılan biyo bağlı olarak, büyüme faktörleri emilimi farklı olabilir. Kolajen membranlar nedenle IL33 ifade bu ortamda düzenlenmemiş IL33 ifadesini kontrol faktörleri absorbe başarısız oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Kısaltma | Astar ileri | Ters primer |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tablo 1: kullanılan 6 genlerin primer sekans.
| Genler | 80 ° C Ortalama ± SD | 121 ° C Ortalama ± SD |
| ADM | 0.2 ± 0.1 | 1.1 ± 0.2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0.9 ± 0.2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1.5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
Tablo 2: ADM, PTX3, IL11, IL33, ısı ile muamele edilmiş kemik parçacıkları kıvamlandırılmış ortam% 20 ile uyarılmış ve diş fibroblastlarda NOX4 ve PRG4 tipik gen ekspresyonu.
| Genler | ± SD Ortalama |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tablo 3: ADM, PTX3, IL11, IL33, demineralize edilmiş kemik yongaları kıvamlandırılmış ortam% 20 ile uyarılmış ve diş fibroblastlarda NOX4 ve PRG4 tipik gen ekspresyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemik klimalı ortam kemik rejenerasyonu erken evrelerinde kemik grefti yayımlanan aktivitesini yansıtır. Burada açıklanan protokol kemik rejenerasyonu dahil çeşitli hücre tipleri tepkisini incelemek için adapte edilebilir. Bundan başka, protokol işleme kemik veya kemik dolgu kıvamlandırılmış ortam hazırlamak için de kullanılabilir. Çeşitli yerli ve işlenmiş kemik salınan faktörler: yöntemler gerçekleştirmek ve basit bir kavram güvenmek kolaydır. Nasıl BCM anlamak mezenkimal hücreler greft konsolidasyon ve kemik otogreftlerde özellikleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için yardımcı olabilir etkiler. Biz aynı zamanda üç ana soy içine çoğalması, göç ve farklılaşma üzerine, mezenkimal hücreler gen ifadesi üzerinde 11,15 yerli ve işlenmiş kemik 14,20 elde BCM etkisi hakkında bilgi birikimi var bu kavram dayanarak; osteoblast, adiposit ve kondrositler 11. BCM ayrıca ta onun kapasitesi için incelenmiştirosteoklastojenez 13 modülasyonuna göre, örneğin, hematopoietik hücreler, RGet. Birçok potansiyel hedef hücreler in vitro BCM'ye cevap bekleyen, burada sunulan protokoller, bu araştırma için bir astar olarak hizmet verebilir.
sunulan protokoller ayrıca BCM mezenkimal hücreler özellikle TGF-β-regüle genleri aktive nasıl moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için animasyon gerekir. Örneğin, SB431542 antagonist, TGF-β reseptör geni paneli ADM ifadesi üzerindeki BCM'nin etkisini bloke IL-11, NOX4, PRG4 ve PTX3 11,15. İlginç bir şekilde, alkalen fosfataz ve IL33 diğer henüz bilinmeyen yollar BCM düzenlenir düşündürmektedir SB431542 11,15 tarafından tersine değildi. Başka açık bir soru BCM moleküller hücre yanıtı sorumlu ediliyor nedir? BCM TGF-β içerir, ancak karmaşık hücresel reaksiyonları 10,11 açıklamıyor olduğunu. In yanı sıraHücresel yönlerini vitro genel bir soru kalır: hangi kemik rejenerasyonu in vivo süreci üzerinde bir etkiye sahip, BCM tarafından yansıtılan kemik greft yayımlanan faaliyeti yapar uzatmak? biyoanalizlerin gelen protokoller ve veriler bu yönde araştırmalarını tanıtmak gerekir.
Bu protokol sınırlamaları vardır. BCM tamamen nedeniyle bağışçılar ve hasat teknikleri arasındaki varyasyon standardize edilemez. Ayrıca, in vivo koşullarda bu enzimler bileşim veya BCM aktivitesini etkileyebilir kadar bilinmemektedir. Gelecekteki çalışmalar, örneğin, hasat teknikleri BCM "biyolojik aktiviteyi" nasıl etkilediği üzerine odaklanmalıdır. BCM bileşimine osteosit rolü de detaylı olarak ele alınmalıdır. BCM sklerostinin, osteosit 12 ile neredeyse sadece yayımlanan bir molekül içeriyor. Sınırlamalar, ancak, araştırma sonraki adımlar için ilham kaynağı. Hatta BCM ile araştırma klinik önemi hy kalır rağmenpothetical, bizim protokoller kemik grefti, yerli ya da işlendikten sonra ya bir "biyolojik etkinliğini" serbest uzun soluklu kavramını destekler. In vitro hücrelerini etkiler BCM nasıl anlamak muhtemelen kemik otogrefti in vivo nasıl çalışacağını anlamanıza yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok. Jordi Caballé-Serrano Diş Araştırma ve Eğitim, Basel, İsviçre Vakfı burs aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M.
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E.
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N.
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R.
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
