Summary
Descrevemos aqui como preparar meio-bone condicionado (BCM) e testar a sua actividade in vitro.
Abstract
Enxertos ósseos autólogos são amplamente utilizados em cirurgia oral e maxilofacial, ortopedia, traumatologia e. Enxertos ósseos autólogos não só substituir osso em falta, eles também suportam o complexo processo de regeneração óssea. Esse comportamento favorável dos auto-enxertos é atribuído às três características: osteocondutividade, osteogenicidade, e osteoindutividade. No entanto, há um outro aspecto: Enxerto ósseo libertar uma miríade de moléculas, incluindo factores de crescimento, que podem direcionar as células mesenquimatosas envolvidas na regeneração óssea. As propriedades parácrinos de enxertos de osso pode ser estudada in vitro através da utilização de meio condicionado de ossos (BCM). Aqui apresentamos um protocolo sobre como preparar o meio-condicionado de osso nativo osso cortical suíno e osso que foram submetidos a tratamento térmico ou desmineralização. As células podem ser directamente exposta à BCM ou semeados em biomateriais, tais como membranas de colágeno, previamente embebidos com BCM. Nós damos exemplos de in vitro bioassays com células mesenquimais sobre a expressão de TGF-β genes regulados. Os protocolos apresentados devem incentivar a revelar ainda mais os efeitos parácrinos de enxertos ósseos durante a regeneração óssea e abrir um caminho para a investigação translacional no amplo campo da cirurgia reconstrutiva.
Introduction
Ósseo autólogo é amplamente utilizado para preencher defeitos que ocorreram como consequência de malformação, a cirurgia ressectivo, a cirurgia reconstrutiva trauma, e antes da colocação do implante 1,2. Compreender os princípios biológicos de como enxertos ósseos apoiar o processo de consolidação do enxerto não é única chave para entender porque auto-enxertos são considerados o padrão-ouro em cirurgia reconstrutiva, também é biônico para o projeto melhorado de substitutos ósseos 3. Ainda assim, a consolidação do enxerto é mais rápido com ósseo autólogo em comparação com osso substitui 4,5. Assim, é imperativo para revelar os mecanismos moleculares e celulares que formam osso autólogo de modo eficaz para apoiar a regeneração do osso.
Existem três características exemplares de auto-enxertos que são considerados para suportar o processo de consolidação 6,7. Primeiro osso, autólogo é osteocondutor, fornecendo orientações para o osso recém-formado para crescerno defeito. Em segundo lugar, osso autólogo é osteogénico, o que significa que ele contém células mesenquimais que podem diferenciar-se em osteoblastos 8. Terceiro osso, autólogo é osteoindutora como fatores de crescimento, como proteínas ósseas morfogenéticas sepultados na matriz pode iniciar o processo de endochondral ou mesmo a formação óssea intramembranosa 9. Há um outro aspecto: fragmentos de ossos recém-preparados realizar uma função parácrina baseado nas observações in vitro com "meio-bone condicionado" 10-15. Além disso, o impacto da mielopoese deve ser mencionado 16. Um termo similar "meio condicionado-matriz óssea desmineralizada" já foi cunhado em 1996 e apoia o conceito global de uma função parácrina do osso, mesmo quando processados por desmineralização 17. Para nossos propósitos, BCM pode ser preparado a partir de suíno fresca mandíbulas 10,11. Análises proteômicas de BCM revelou a composição complexa, incluindo facto crescimentoRUP e constituintes da matriz extracelular 10, estendendo-se também ao conhecimento existente sobre o proteassoma de osso total 18,19. Assim, BCM deve refletir a atividade liberada de várias modificações de enxertos ósseos in vitro.
O que acontece quando células mesenquimatosas, por exemplo, os isolados a partir de lascas de osso ou de tecidos moles da boca, são expostos para BCM? In vitro, o BCM reduz osteogénico e osteócito, e provoca um forte aumento da expressão IL11 11. Genoma de largura de microarray revelou mais genes a ser expressos diferencialmente em células mesenquimais em resposta ao BCM. Entre estes genes são adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidase 4 (Nox4), proteoglicanos 4 (PRG4, ou lubricin) e pentraxina 3 (PTX3) 15. BCM obtido a partir de fragmentos de ossos autoclavada não conseguiu alterar a expressão dos respectivos genes 14. BCM a partir de fragmentos de ossos que foram submetidos a pasteurização eo congelamento foi capaz dealterar a expressão do gene 14. Meio também condicionado da matriz óssea desmineralizada (DBM-CM) muda a expressão de TGF-β genes regulados por 20. Curiosamente, as membranas barreira de colagénio utilizadas para proteger os fragmentos de ossos do tecido mole circundante 21,22, adsorvido às partes de BCM que são responsáveis para que as alterações na expressão do gene 23. BCM pesquisa pode ser alargado a outros tipos de células envolvidas na regeneração do osso, tais como os osteoclastos de reabsorção óssea e células endoteliais, para citar alguns. No geral, os dados in vitro acumulando proporcionar a base científica para a concepção de um estudo pré-clínico.
O presente protocolo é duplo: Primeiro, ele mostra como preparar BCM. Em segundo lugar, como mostra a testar a sua actividade biológica com base em células mesenquimais in vitro.
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Protocol
1. Preparação BCM
- Obter mandíbulas de porco do talho local o mais fresco possível. Coloque as mandíbulas em uma superfície firme e liberar um retalho de espessura total com especial atenção para não deixar qualquer tecido mole ou periósteo fixados ao osso. Trabalhar em um ambiente limpo, sem a necessidade de trabalhar sob o capô fluxo.
- Uma vez que um retalho de espessura total é liberado, use um raspador de osso para colher as lascas de osso do lado vestibular. Por favor note que o raspador ósseo tem de ser afiado. Manusear com firmeza o raspador ósseo e com movimentos longos recolher o osso. Descarte fragmentos de ossos menores que um milímetro.
- Para manter fragmentos de ossos nativas, coloque directamente os fragmentos de ossos em pratos de plástico de 10 cm de diâmetro com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 1% antibióticos e antimicóticos não deixá-los secar.
- Para avaliar o impacto do processamento térmico, lascas de osso sujeito a uma pasteurização durante 30 min a 80 ° C ouautoclave durante 20 min a 121 ° C.
- Para avaliar o impacto de desmineralização, agitar fragmentos de ossos em HCl 1 M para 4-6 horas a 4 ° C e lava-se várias vezes com meio de cultura até o pH ser neutro.
- Inserir um total de 5 g de pedaços de osso por 10 ml de DMEM fresco suplementado com 1% de antibióticos e antimicóticos para um novo prato de plástico.
- Colocar as placas de plástico em uma atmosfera humidificada a 37 ° C durante 24 h. Então, colheita BCM. Centrifugar o BCM a 200 xg durante 10 min para remover os detritos, filtrá-la estéril (0,2 nM), e manter aliquotas congeladas a -80 ° C.
- Descongele o estoque BCM imediatamente antes da utilização e evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
- Para as experiências indicadas, embeber as membranas de colagénio com meio BCM ou isento de soro durante 1 hora à TA. Lavar vigorosamente as membranas com PBS e colocá-los em placas de 96 poços. Membranas molhadas são semeadas com células.
- Processo de preparação de BCM está resumida na Figura 1.
2. Os bioensaios Baseado em Células mesenquimais
- Células mesenquimais semente humana (por exemplo, células ósseas, gengival e fibroblastos do ligamento periodontal) em uma placa de 12 poços com uma concentração de 30.000 células / cm2. Para semear as células usam meio de crescimento consistindo em DMEM, 10% de soro fetal de vitelo e antibióticos. Deixe as células anexar à placa O / N.
- Descartar o meio de cultura e lava-se as células com PBS pré-aquecido a 37 ° C. Estimular as células pela adição de meio de cultura isento de soro pré-aquecido, com e sem 20% de BCM. Colocar as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C durante 24 h.
- Descartar o meio de cultura, lavar as células com PBS pré-aquecido e extrai-se o ARN de acordo com o seu protocolo preferido.
- Ajustar a concentração de ARN, de modo a ter a mesma quantidade de ARN em cada amostra. Preparar ADNc e executar um de qRT-PCR para analisar os genes seleccionados utilizando os iniciadores apresentados na Tabela 1.
NOTA: Estas são as diluições de cada componente: 2x SYBR verde, 20x iniciador directo, 20x iniciador inverso, 5x DD estéril água, 5x cDNA. O qRT-PCR é realizada em 40 ciclos de 95 ° C, 15 seg e 60 ° C 1 min. - Calcular os níveis de expressão relativa através da normalização para o gene GAPDH de limpeza utilizando o método Δ (ΔCt) onde é ΔCT alvo TC - CT GAPDH e Δ (ΔCT) é estimulada ΔCT - ΔCT controlo.
- Após este controlo de qualidade, BCM adicionar ao meio de cultura para estimular a todos os tipos de células, incluindo células mesenquimais, células hematopoiéticas ou células endoteliais.
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Representative Results
Osso meio condicionado é preparado a partir frescos fragmentos de ossos suína. Descrição geral do processo para preparar e utilizar BCM biomateriais em combinação com BCM é mostrado na Figura 1 e Figura 2, respectivamente. Durante a preparação BCM, é importante obter grandes fragmentos de ossos com movimentos longos como movimentos curtos ou muito pequenos fragmentos de ossos pode afetar a qualidade do BCM final. Qualidade de o BCM pode ser controlada através da análise da expressão génica de genes alvo BCM: ADM, a PTX3, IL11, IL33, Nox4 e PRG4 (Figura 3). ADM e PTX3 está regulada para baixo até 0,4 vezes e IL11, IL33, Nox4 e PRG4 pode ser regulado para cima de 200 vezes. Se fibroblastos orais não expressam genes alvo BCM no nível mostrado, verificar a saúde das células ou preparar nova BCM de novas mandíbulas. Figura 4 mostra os resultados típicos da expressão de genes alvo de GCN em fibroblastos orais semeados sobre uma membrana de barreira de colágeno. Oral fibroblastos estimulados com 20% de meio condicionado a partir de lascas de osso pasteurizados e meio condicionado a partir de lascas de osso desmineralizado, mostrou expressão do gene semelhante a células estimuladas com BCM (Tabela 2 e Tabela 3). No entanto, a expressão do gene de fibroblastos orais exposta a meio condicionado de esterilização (121 ° C) fragmentos de ossos, foi comparável com os controlos un-estimuladas.
Figura 1. Resumo do processo utilizado para preparar o meio-condicionado óssea de mandíbulas de suínos frescos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Sumáriodos bioensaios com base em células mesenquimais com BCM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A expressão gênica de genes-alvo médio de osso condicionado em fibroblastos orais. Os resultados típicos de seis genes usados para controlar a qualidade do BCM. Genes ADM e PTX3 são downregulated (A) e IL11, IL33, Nox4, PRG4 são regulados positivamente (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A expressão gênica de osso conditioned genes alvo médio em fibroblastos orais semeados sobre uma membrana de barreira de colagénio. Os resultados típicos de seis genes utilizados para controlar a qualidade de o BCM. Genes ADM e PTX3 são downregulated (A) e IL11, Nox4, PRG4 são regulados positivamente (B). Dependendo do biomaterial utilizado, a absorção de factores de crescimento pode ser diferente. Membranas de colágeno não conseguiu absorver os fatores que controlam a expressão IL33, IL33, portanto, a expressão não é regulamentada nesse cenário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Abreviatura | Frente Primer | Iniciador reverso |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| Nox4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabela 1: Sequência de Primer dos seis genes utilizados.
| Genes | 80 ° C Média ± SD | 121 ° C Média ± SD |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1,1 ± 0,2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1,5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1,2 ± 4 |
| Nox4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1,8 ± 1 |
Tabela 2: expressão genética típica de ADM, PTX3, IL11, IL33, Nox4 e PRG4 em fibroblastos orais estimuladas com 20% de meio condicionado a partir de fragmentos de ossos tratados termicamente.
| Genes | Média ± SD |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| Nox4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabela 3: expressão genética típica de ADM, PTX3, IL11, IL33, Nox4 e PRG4 em fibroblastos orais estimuladas com 20% de meio condicionado a partir de lascas de osso desmineralizado.
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Discussion
Meio condicionado por óssea reflecte a actividade libertada de enxertos de osso durante os estágios iniciais de regeneração óssea. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado para estudar a resposta de diferentes tipos de células envolvidas na regeneração óssea. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para preparar o meio condicionado a partir de agentes de enchimento de osso ou ossos processados. Os métodos são fáceis de realizar e contam com um conceito simples: os fatores libertados por várias osso nativo e processado. Entender como BCM afeta células mesenquimais podem ajudar a aprender mais sobre a consolidação e propriedades de auto-enxertos ósseos do enxerto. Com base neste conceito que temos acumulado conhecimento sobre o impacto do BCM obtido a partir de 11,15 nativa e processados osso 14,20 na expressão gênica de células mesenquimais, mas também sobre a proliferação, migração e diferenciação em três linhagens principais; osteoblastos e condrócitos, adipócitos 11. BCM também foi examinado por sua capacidade de tarPegue células hematopoiéticas, por exemplo no que diz respeito à modulação da osteoclastogénese 13. Muitas células alvo em potencial estão esperando para responder a BCM in vitro, os protocolos aqui apresentados, pode servir como uma cartilha para esta pesquisa.
Os protocolos apresentados também deve animar a revelar os mecanismos moleculares de como BCM ativa genes particularmente TGF-β-regulada em células mesenquimais. Por exemplo, o receptor de TGF-β I antagonista SB431542 bloqueou o efeito de o BCM sobre a expressão do gene do painel de ADM, IL-11, Nox4, PRG4, e PTX3 11,15. Curiosamente, fosfatase alcalina e IL33 não foram revertidos por SB431542 11,15 sugerindo que outras vias ainda desconhecidas são regulados por BCM. Outra questão em aberto é o que são as moléculas em BCM sendo responsável pela resposta celular? BCM TGF-β contém, mas não é explicar as reações celulares complexos 10,11. Além do emvitro aspectos celulares, a questão mantém-se em geral: em que medida é que a actividade libertada de enxertos ósseos como reflectido por BCM, ter um impacto sobre o processo in vivo de regeneração óssea? Os protocolos e dados de bioensaios deveriam introduzir pesquisa nesta direção.
Este protocolo tem limitações. BCM não pode ser totalmente padronizada por causa de variações entre os doadores e técnicas de colheita. Além disso, como as enzimas presentes in vivo pode afectar a composição ou a actividade de o BCM permanece desconhecida. Estudos futuros devem, por exemplo, se concentrar em como as técnicas de colheita afetam a "atividade biológica" do BCM. O papel de osteócitos sobre a composição do BCM também devem ser estudados em detalhe. BCM contém esclerostina, uma molécula liberada quase que exclusivamente por osteocytes 12. Limitações, no entanto, fornecer a inspiração para as próximas etapas da pesquisa. Embora a relevância clínica da pesquisa com BCM permanece hypothetical, nossos protocolos de apoiar o conceito de longa data que enxertos ósseos, seja nativo ou após transformação, lançar uma "atividade biológica". Entender como BCM afetar células in vitro pode presumivelmente ajudar a compreender como enxerto ósseo vai funcionar in vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar. Jordi Caballé-Serrano recebeu uma bolsa da Fundação de Pesquisa Dental e da Educação, Basileia, Suíça.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
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