Summary
Optrevling hvordan fysiologi og morfologi er forbundet tillader en dybere forståelse af mekanistisk velfungerende anlæg blade. Vi præsenterer både en procedure for at udlede parametre for stomatal regulering fra stomatale ledningsevne målinger og korrelationer med traditionelle funktionelle blade træk.
Abstract
Leaf funktionelle egenskaber er vigtige, fordi de afspejler fysiologiske funktioner, såsom transpiration og kulstof assimilation. Især morfologiske blad træk har potentiale til at opsummere planter strategier i form af vandforbruget effektivitet, vækstmønster og brug af næringsstoffer. Bladet økonomi spektret (LES) er en anerkendt ramme i funktionel plante økologi og afspejler en gradient af stigende specifikt bladareal (SLA), blad kvælstof, fosfor og kation indhold, og blad tørstofindhold (LDMC) og kulstof kvælstof forholdet faldende ( KN). LES beskriver forskellige strategier lige fra den af kortlivede blade med høj fotosyntetiske kapacitet pr bladmasse til langlivede blade med lave massebaserede kulstof assimilation satser. Træk, der ikke indgår i LES kan dog give yderligere oplysninger om artens fysiologi, såsom dem, der vedrører stomatal kontrol. Protokoller præsenteres for en bred vifte af blade funktionale træk, herunder træk af LES, men også træk, der er uafhængige af LES. Især er en ny metode indføres der vedrører planternes regulerende adfærd i stomatakonduktans damptryk underskud. De resulterende parametre for stomatal regulering kan derefter sammenlignes med LES og andre vegetabilske funktionelle egenskaber. Resultaterne viser, at funktionelle blad træk af LES var også gyldige prædiktorer for parametrene for stomatal regulering. For eksempel blad carbon-koncentrationen var positivt forbundet med damptrykket underskud (VPD) ved vendepunktet, og den maksimale af ledningsevne-VPD kurve. Men træk, der ikke indgår i LES tilføjede oplysninger i at forklare parametre for stomatal kontrol: VPD på tidspunktet for bøjning af ledningsevne-VPD kurve var lavere for arter med højere stomatal tæthed og højere stomatal indeks. Samlet set stomata og vene træk var mere magtfulde prædiktorer for at forklare stomatal regulering tHan træk anvendes i LES.
Introduction
At fremme den funktionelle forståelse af planternes blade, har mange nylige undersøgelser forsøgt at relatere morfologiske, anatomiske og kemisk blad træk til fysiologiske reaktioner, såsom blade stomatal ledningsevne (g S) 1-4. Hertil kommer, at blade træk, stomatal ledningsevne er stærkt påvirket af miljømæssige forhold, såsom fotosyntetisk aktiv foton fluxtæthed, lufttemperatur og VPD 5. Forskellige måder er blevet foreslået at modellere gs - VPD kurver 6-8 som hovedsagelig er baseret på lineær regression af gs på VPD 6. I modsætning hertil modellen præsenteres i denne undersøgelse regredere de logits relativ stomatakonduktans (dvs. forholdet mellem g S til maksimal stomatakonduktans g SMAX) om VPD og tegner sig for den ulinearitet ved tilsætning af VPD som en kvadratisk Regressor sigt.
Sammenlignet med andre modeller, den nye model giver mulighed for at udlede parametre, der beskriverVPD på hvilket g S nedreguleres under vandmangel. Tilsvarende er VPD opnået ved hvilken g S er maksimal. Som det kan forventes at være tæt knyttet til kulstof assimilation 9,10 sådanne fysiologiske parametre en tæt forbindelse mellem disse modelparametre og de centrale blade træk til næringsstoffer og ressourceallokering som afspejlet i LES bør forventes 3,11. Som følge heraf bør der også være en stram sammenhæng mellem strategier for stomatal regulering med LES træk. Der forventes et sådant forhold især for blade vane (stedsegrønne versus løvfældende) som blade vane er både korreleret med LES og med brug vandeffektivitet 12,13. Stedsegrønne arter tendens til at vokse langsommere, men er mere effektiv i miljøer næringsfattig 14. Således bør blad vane oversætte til forskellige stomatal regulering mønstre, med en mere konservativ vandforbrug strategi end løvfældende arter.
Comparing et stort sæt af bredbladet træarter i et fælles haven situation blev følgende testet på: 1) modelparametre fra g S - VPD modeller er forbundet med blad træk relateret til bladet økonomi spektrum. 2) Evergreen arter har lavere gennemsnitlig g S og g smax værdier end løvfældende arter.
Protocol
1. stomatal Konduktans
- Målinger af stomatal ledningsevne
BEMÆRK: Forfatterne gjort brug af en simpel form for steady state Porometer (Decagon SC1). Den Porometer design har den fordel, lille størrelse, intuitiv manuel betjening og høj pålidelighed. Ved måling stomatal ledningsevne i marken, skal du sørge for at minimere afstanden mellem målte individer til en gentagen cyklus måling for at være den mest effektive. - Vælg blade af forskellige arter og individer ifølge en reproducerbar mønster (samme højde, samme eksponering, samme position i planten, hvis det er muligt kun fra den samme knude, og kun fra én kategori, sol eller skygge blade, etc.).
- Kun foranstaltning blade i raske, ikke-beskadiget og fuldt udviklet tilstand. Markér bladene på de personer (fx med kabelbindere eller farve tape), for at sikre, at de gentagne målinger er udført på samme blad.
BEMÆRK: Measurements af stomatal ledningsevne bør kun på blad overflade samtidig undgå midterribben og stærke ribber. - Start målinger i de tidlige morgen timer før solopgang tager fem til ti gentagne målinger, indtil stomatale konduktansværdier viser en klar nedgang ved middagstid.
BEMÆRK: En daglig løbet af målingerne vil levere gode data til at analysere forholdet mellem VPD og stomatal ledningsevne.
- Kun foranstaltning blade i raske, ikke-beskadiget og fuldt udviklet tilstand. Markér bladene på de personer (fx med kabelbindere eller farve tape), for at sikre, at de gentagne målinger er udført på samme blad.
- VPD målinger
- Med hver g S måling, registrering temperatur og relativ fugtighed fortrinsvis med bærbare loggere at direkte at måle forholdene på positionen af samme blad. Ved beregningen af damptrykket underskud bruge August-Roche Magnus formel 15.
e s = mætningstrykket vanddamp [hPa]
- Model g S - VPD respons
- Nu plot arter-wise alle g S data mod VPD, der kombinerer alle daglige kurser af individuelle blade i én analyse pr arter. Uddrag den maksimale værdi observeret fra de stomatale konduktans data ved at søge efter den maksimale værdi. At skalere model for arter-kloge sammenlignelighed, opdele de observerede værdier gennem den maksimale værdi iagttaget for denne art (g S / g SMAX).
- For hver art, relatere de logits af g S (g S / g SMAX) til VPD og den kvadratiske sigt af VPD ved hjælp af en generaliseret lineær model med en binomial fejl distribution (a, b og c repræsenterer regressionsparametrene):
Figur 1. Eksempel på de plottede værdier og monteret model for g S -. VPD stomatal konduktans plottet som funktion af damptryk underskud for arten Liquidambar formosana. Tomme prikker repræsenterer de observerede værdier. (A) Maksimal stomatal ledningsevne blev VPD ved maksimal stomatal ledningsevne og betyde stomatal ledningsevne udvundet fra den absolutte således ikke-skaleret stomatal ledningsevne (g S) data. (B) Skaleret stomatakonduktans data (g S / g SMAX) blev plottet at udtrække de relative parametre (vist som udfyldte prikker) 20. Re-print med tilladelse fra 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Alle monteret modeller for alle arter. Model grafer for de stomatale konduktans data til VPD regression for alle arter. Stedsegrønne arter er repræsenteret ved sorte streger, løvfældende arter af røde linjer 20. Re-print med tilladelse fra 20..
BEMÆRK: Brug af logits stedet for regression g S direkte til VPD, fører til det punkt, at modellerede maksimale værdier ikke overskrider g SMAX og at g S nærmer sig 0 ved høj VPD.
- Uddrag parameter for stomatal regulering for hver art
- Beregn absolutte modellerede g Smax værdier (MaxFit i figur 1B). For at gøre dette, beregne VPD ved maksimal stomatal ledningsevne fra at fastsætte den første afledede af 1.4.2 til nul, hvilket giver VPD gsMaxFit = -b / 2a. Indsæt VPD gsMaxFit i formlen på 1.4.2 og hæve til magten af e for at opnå MaxFit. Beregn mEAN af alle konduktans målinger pr arter (se figur 1A).
BEMÆRK: Brug statistisk software R (http://www.r-project.org). - For at beregne relative værdier, fra den skalerede model (g S / g Smax), ekstrakt stomatal ledningsevne og VPD værdier for følgende to punkter: (1) stomatal ledningsevne og VPD ved maksimum af modellen (MaxFit), og (2) VPD ved det andet vendepunkt for kurven (se figur 1B). Formere disse værdier med g SMAX at opnå absolutte g S-værdier for disse punkter. Se figur 2 for en fuldstændig overlejring af de enkelte modeller af alle 39 arter analyseres.
- Beregn absolutte modellerede g Smax værdier (MaxFit i figur 1B). For at gøre dette, beregne VPD ved maksimal stomatal ledningsevne fra at fastsætte den første afledede af 1.4.2 til nul, hvilket giver VPD gsMaxFit = -b / 2a. Indsæt VPD gsMaxFit i formlen på 1.4.2 og hæve til magten af e for at opnå MaxFit. Beregn mEAN af alle konduktans målinger pr arter (se figur 1A).
2. Målinger af stomatal træk
- Udtage prøver fortrinsvis fra nøjagtig de samme blade, der har været anvendt til målingerne af stomatal ledningsevne. Hvis dette ikke er muligt, anvendes den samme udvælgelsesprocedure, der blev anvendt til at vælge bladenefor stomatale konduktans målinger, helst på samme individer.
- Påfør et tyndt lag af farveløse, hurtigt tørring neglelak (test forskellige mærker, nogle er mere egnede end andre) til en frisk prøve. Hvis prøverne ikke kan behandles med det samme, gemme dem i 70% alkohol. Efter neglelak er tørret ud, forsigtigt skræl indtryk fra bladet og fortsæt til mikroskopisk analyse, som med en normal bladprøve.
BEMÆRK: I tilfælde af blade med høj densitet trichome en foregående trin for at anvende natriumhydroxid eller en 1: 1 opløsning af eddikesyre og oxygen peroxid kan føre til bedre resultater. - Optisk mikroskop analytics
- Tilslut et kamera til et optisk mikroskop i stand til forstørrelser mellem 40X til 400X. Når kameraet er sluttet til mikroskopet, matche billeder taget med den optiske forstørrelse og opløsning af billedet, f.eks ved hjælp af en skala.
- Anvender open source image forarbejdning software som ImageJ 16 analysere disse billeder.
- Tegn en form med formen værktøjet fra billedet analyseværktøj på billedet i et område med ingen snavs, tommelfinger print, beskadigede områder, eller store blade årer. Count stomata på dette område og i alt mindst 50.000 um 2 pr prøve.
- Mål stomatal guard-celle længde og porelængde. Beregne antallet af stomata per mm2. Beregn stomatal indeks som forholdet mellem stomatal tæthed til epidermal celle antal pr mm2.
3. Vurdering af Leaf Vein træk
BEMÆRK: Til vurdering af blade vene træk, en modificeret en protokol fra Sack & Scoffoni 17 var ansat.
- Prøveforberedelse
BEMÆRK: For at optimere synligheden af ribber, er bladene først bleget og derefter farvet med safranin og malakitgrønt.- At blege leaves, lade dem mindst 72 timer i 50% opløsning af decolorizer (test forskellige mærker, igen nogle kan arbejde bedre). Alternativt anvendes 5% NaOH-opløsning eller 10% KOH-opløsning eller 25% H2O 2-opløsning.
- Opvarm løsningen op til 30 ° C eller kombinere de forskellige løsninger fra trin 3.1.1 for bedre effekter. Skyl flere gange i vand bagefter. Tilpasse blegningsprocessen for de særlige arter, afhængigt af deres blad egenskaber.
BEMÆRK: Tykkere blade kan have behov for længere perioder med løsning bad og eller de mere aggressive løsninger. Tyndere og mere ømme blade kan bleges til en tilfredsstillende grad i mindre end 72 timer. - At farve bladene placere dem i 100% ethanol. Farve dem for 2 - 30 minutter i 1% safranin løsning. For at øge farvestoffer, tilføje en ekstra behandling med 1% malakitgrønt opløsning kun i flere sekunder. Tilpas protokol til alle arter med hensyn til timing og intensitet til at opnå optimale resultater. Skyl seVeral gange i vand bagefter. Hvis bladene er til dybt farves, kan nogle gang i ethanol eller decolorizer hjælpe.
- Prøve analyse
- Scan bladene med en baggrundsbelysning scanner med en opløsning på ca 1.200 dpi. Match scanninger taget til løsningen af billedet, f.eks ved hjælp af en skala, for at sikre, at pixel længde kan spores tilbage til absolutte længde mål for det scannede blade.
- Måles areal, omkreds, længde og bredde af bladene. Beregn flere indekser, fx længde / bredde og omkreds 2 / område. Skær en 1 til 1 cm rektangel ud af midten af billedet. Mål diameter venerne i første og anden orden (inkluderer ikke den vigtigste midterste vene). Mål længden af alle venerne i første orden i denne quadrat (vene tæthed).
4. Vurdering af Andre Leaf træk
BEMÆRK: Æsler typiske blad træk såsom specifikkebladareal (SLA), blad tørstofindhold (LDMC), bladareal, element indhold, blad vane, blad pinnation, blad sammensatte type, blad margin typen osv følgende etablerede protokoller 18,19.
- Observationelle blad træk
- Vurdere blad pinnation, blad sammensatte type, blad margin type og tilstedeværelsen af extrafloral nectaries 18,19 gennem observation i marken.
- Analytiske blad træk
- Saml friske blade prøver, helst på de samme individer som anvendes til de andre målinger, til bestemmelse af specifikke bladareal (SLA), bladareal og blade tørstofindhold (LDMC) 18,19. Efter 48 timer i tørreovn ved 80 ° C, måle element indhold og forhold, helst på samme blade.
Representative Results
Mange parametre for stomatal ledningsevne og stomatal regulering fandtes at være relateret til morfologiske, anatomiske og kemiske blad træk. I det følgende vil der være fokus på linkene til VPD på vendepunkt, som faldt med stomatal densitet (p = 0,04) og stomatal indeks (p = 0,03) og øget med blad kulstofindhold (p = 0,02, se figur 3). Resultaterne viser, at med faldende VPD ved vendepunktet var der et fald i stomatal tæthed og stomatal indeks. I modsætning hertil ingen parameter for stomatakonduktans viste en klar sammenhæng med blade vane. Den høje variation inden de to grupper af blade vane viser, at forskellige reguleringsmekanismer findes både inden for gruppen af stedsegrønne og løvfældende blade vaner.
Figur 3. Resultat tal for the mellem mønstre af stomatale ledningsevne regulering og blade træk Damptryk underskud (VPD) på vendepunkt i g S -. VPD kurve (VpdPoi) som en funktion af (A) stomata tæthed, (B) stomata indeks, og (C) blad kulstofindhold 20. Re-print med tilladelse fra 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Parametrene for stomatal regulering udvundet ved den metode præsenteres i dette papir understrege vigtigheden af stomatale træk, såsom stomata tæthed og stomata indeks. Disse nye relationer demonstrerer potentialet i at knytte parametre fra fysiologiske modeller til at morfologiske, anatomiske og kemisk blad avlsmål 20. Sammenlignet med andre metoder, den nuværende fremgangsmåde bærer den fordel at fange en unik og utvetydig VPD værdi, hvortil stomatal ledningsevne nedreguleres til halvdelen af det modellerede g maksimale.
Af alle trinene i protokollen de mest kritiske dem er målingerne af stomatal ledningsevne. På grund af den multifaktoriel regulering af stomatale konduktans omgivende vejrforholdene har en stærk indflydelse på g S. Stomatal ledningsevne målinger ved høj relativ luftfugtighed og lav lysintensitet kan være upålidelige 21-23. Med hensyn til morfologiske og Anatomical træk bør protokollen altid tilpasses til målarterne indgår i undersøgelsen. Navnlig i analysen venen densitet, bør varigheden af blegning og farvning af blade varieres, afhængigt af bladstrukturen og sejhed. Potentielle begrænsninger af fremgangsmåden indbefatter arter, for hvilke der umuligt eller kompliceret og udsat for fejl på grund af ekstraordinære bladformer målinger af stomatakonduktans. Dette kan omfatte nåletræer og græsser med meget snævre blad blade.
Vores resultater dels bekræfter den første hypotese er en sammenhæng mellem stomatakonduktans parametre og blad træk af bladet økonomi spektrum (LES), hvilket svarer til adskillige andre undersøgelser. For eksempel Poorter og Bongers (2006) 24 rapporterede en tæt forbindelse mellem g S og træk repræsenteret ved LES fx med g S aftagende med stigende blad levetid. Følgelig Schulze et al. (1994) 1 demonstvurderet klar sammenhæng mellem blad nitrogenindhold og g SMAX. Tilsvarende Juhrbandt et al. (2004) 25 syntes signifikant sammenhæng mellem g SMAX og bladareal og blade kvælstofindhold.
Vores anden hypotese klare forskelle med hensyn til blade vane kunne ikke bekræftes. Den høje variation i de målte parametre og træk inden stedsegrønne og løvfældende blade vane viser, at blade vane er ikke en god deskriptor af LES. Brodribb og Holbrook (2005) 26 diskuteret, at blad vane og blad fysiologiske strategier måske ikke nødvendigvis forbundet, da brede træk variation er almindelig i alle typer af blade vane.
Den fremgangsmåde kan udvides til træk og fysiologiske egenskaber end andre blade, for eksempel for træk relateret til xylem hydraulik planteorganer såsom specifikke veddet hydrauliske ledningsevne og mikroskopi træ avlsmål 27. Tilsvarende andretyper af blade træk, som er afledt af mikroskopi såsom palisade parenkym struktur og epicuticular vokslag struktur kunne medtages 28.
Sammenfattende denne undersøgelse bekræftede den tætte forbindelse mellem LES og stomatal regulering. Hertil kommer, at metoden præsenteres her afslørede facetter af stomatale regulering mønstre, der ikke er relateret til LES. Især specifikke blad træk såsom stomata størrelse, tæthed og indeks samt vene længde fortjener fremtidig opmærksomhed i plante undersøgelser funktionelle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC 1 Porometer | Decagon | Any other porometer is suitable | |
| Cable ties to mark leaves | |||
| Plastic sample bags | |||
| Paper sample bags | |||
| Hygrometer | Trotec | Any other is suitable | |
| Nail polish | |||
| Axioskop 2 plus | Zeiss | Any other is suitable | |
| Ethanol | |||
| Bleach | |||
| 5% NaOH | |||
| 10% KOH | |||
| 25% H2O2 | |||
| Malachite green | |||
| Safranine |
References
- Schulze, E. -D., Kelliher, F., Körner, C., Lloyd, J., Leuning, R. Relationships among maximum stomatal conductance, ecosystem surface conductance, carbon assimilation rate, and plant nitrogen nutrition: a global ecology scaling exercise. Annual Review of Ecology and Systematics. 25 (1), 629-662 (1994).
- Chaturvedi, R. K., Raghubanshi, A. S., Singh, J. S. Growth of tree seedlings in a tropical dry forest in relation to soil moisture and leaf traits. Journal of Plant Ecology. 6 (2), 158-170 (2013).
- Santiago, L. S., Kim, S. C. Correlated evolution of leaf shape and physiology in the woody Sonchus. alliance (Asteraceae: Sonchinae) in Macaronesia. International Journal of Plant Sciences. 170 (1), 83-92 (2009).
- Aasamaa, K., Sober, A. Hydraulic conductance and stomatal sensitivity in six deciduous tree species. Biologia Plantarum. 44 (1), 65-73 (2001).
- Waring, R. H., Chen, J., Gao, H. Plant-water relations at multiple scales: integration from observations, modeling and remote sensing. Journal of Plant Ecology-UK. 4, 1-2 (2011).
- Oren, R., Sperry, J. Survey and synthesis of intra- and interspecific variation in stomatal sensitivity to vapour pressure deficit. Plant, Cell and Environment. 22 (12), 1515-1526 (1999).
- Leuning, R. A critical appraisal of a combined stomatal-photosynthesis model for C3 plants. Plant, Cell and Environment. 18 (4), 339-355 (1995).
- Patanè, C. Leaf area index, leaf transpiration and stomatal conductance as affected by soil water deficit and vpd in processing tomato in semi arid mediterranean climate. Journal of Agronomy and Crop Science. 197 (3), 165-176 (2011).
- Jarvis, A. J., Davies, W. J. The coupled response of stomatal conductance to photosynthesis and transpiration. Journal of Experimental Botany. 49 (Special Issue), 399-406 (1998).
- Roelfsema, M. R. G., Hedrich, R. In the light of stomatal opening: new insights into “the Watergate.”. New Phytologist. 167 (3), 665-691 (2005).
- Wong, S. C., Cowan, I. R., Farquhar, G. D. Stomatal conductance correlates with photosynthetic capacity. Nature. 282 (5737), 424-426 (1979).
- Sobrado, M. A. Hydraulic conductance and water potential differences inside leaves of tropical evergreen and deciduous species. Biologia Plantarum. 40 (4), 633-637 (1998).
- Zhang, Y. -J., Meinzer, F. C., Qi, J. -H., Goldstein, G., Cao, K. -F. Midday stomatal conductance is more related to stem rather than leaf water status in subtropical deciduous and evergreen broadleaf trees. Plant, Cell and Environment. 36 (1), 149-158 (2013).
- Aerts, R.
- Murray, F. W. On the computation of saturation vapor pressure. Journal of Applied Meteorology. 6 (1), 203-204 (1967).
- Basic Concepts. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij/docs/concepts.html (2015).
- Scoffoni, C., Sack, L.
- Cornelissen, J. H. C., Lavorel, S., et al. A handbook of protocols for standardised and easy measurement of plant functional traits worldwide. Australian Journal of Botany. 51 (4), 335-380 (2003).
- Perez-Harguindeguy, N., Díaz, S., et al. New handbook for standardised measurement of plant functional traits worldwide. Australian Journal of Botany. 61 (3), 167-234 (2013).
- Kröber, W., Bruelheide, H. Transpiration and stomatal control: A cross-species study of leaf traits in 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species. Trees. 28 (3), 901-914 (2014).
- Larcher, W. Physiological plant ecology. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York, Hong Kong, London, Milan, Paris, Tokyo. 514 (2003).
- Bunce, J. Does transpiration control stomatal responses to water vapour pressure deficit. Plant, Cell and Environment. 20 (1), 131-135 (1997).
- Bunce, J. A. How do leaf hydraulics limit stomatal conductance at high water vapour pressure deficits. Plant, Cell and Environment. 29 (8), 1644-1650 (2006).
- Poorter, L., Bongers, F. Leaf traits are good predictors of plant performance across 53 rain forest species. Ecological Sciences of America. 87 (7), 1733-1743 (2006).
- Juhrbandt, J., Leuschner, C., Hölscher, D. The relationship between maximal stomatal conductance and leaf traits in eight Southeast Asian early successional tree species. Forest Ecology and Management. 202 (1-3), 245-256 (2004).
- Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. Leaf physiology does not predict leaf habit; examples from tropical dry forest. Trees. 19 (3), 290-295 (2005).
- Kröber, W., Zhang, S., Ehmig, M., Bruelheide, H. Xylem hydraulic structure and the Leaf Economics Spectrum - A cross-species study of 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species. PLOS ONE. 9 (11), e109211 (2014).
- Kröber, W., Heklau, H., Bruelheide, H. Leaf morphology of 40 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species and relationships to functional ecophysiological traits. Plant Biology. 17 (2), 373-383 (2015).
