Abstract
عند الولادة، يخضع الرئة التحول المظهري عميق من إفراز لامتصاص، والتي تسمح للتكيف مع التنفس بشكل مستقل. تعزيز واستدامة هذا النمط الظاهري هو في غاية الأهمية في نمو والغاز الطبيعي الصرف السنخية في جميع مراحل الحياة. اتسمت عدة في الدراسات المختبرية دور البروتينات الأساسية التنظيمية، والجزيئات يشير، وهرمونات الستيرويد يمكن أن يؤثر على معدل إزالة السوائل في الرئة. ومع ذلك، في الامتحانات الجسم الحي يجب أن يؤديها لتقييم ما إذا كانت هذه العوامل التنظيمية تلعب أدوارا فسيولوجية هامة في تنظيم فترة ما حول الولادة امتصاص السائل الرئة. على هذا النحو، والاستفادة من الوقت الحقيقي التصوير بالأشعة السينية لتحديد ما حول الولادة الرئة إزالة السوائل، أو وذمة رئوية، يمثل التقدم التكنولوجي في هذا المجال. هنا، نحن شرح وتوضيح نهج لتقييم معدل السنخية إزالة السوائل في الرئة والفيضانات السنخية في C57BL / 6 الفئران في آخر يوم الولادة 10 إليناجي التصوير بالأشعة السينية وتحليل. نجاح تنفيذ هذا البروتوكول يتطلب موافقة مسبقة من اللجان المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC)، وهو في فيفو الحيوانات الصغيرة نظام التصوير بالأشعة السينية، ومتوافق برامج التصوير الجزيئي.
Introduction
عند الولادة، يجب الرئة حديثي الولادة الانتقال من إفراز السائل لجهاز امتصاص ثانية السوائل لإنشاء التهوية الكافية والأوكسجين في الجسم. لا تزال الآليات التي تيسر (أو يعرقل) إزالة فعالية من السائل الرئة في وقت ولادة غير واضحة. والنمذجة من معدل إزالة السوائل السنخية في C57BL / 6 الجراء الماوس حديثي الولادة يؤدي إلى فهم أفضل للعوامل التنظيمية التي يمكن أن تعزز أو تخفف من معدل امتصاص السوائل. ويمكن أيضا أن يتم تطبيقه على نماذج الوليدية الأخرى من إصابة الرئة الحادة أو العدوى، ويمكن أن يؤدي إلى استراتيجيات علاجية جديدة للأطفال الرضع حديثي الولادة مع ضيق في التنفس.
منذ الرئتين حديثي الولادة هي ضئيلة مقارنة الرئتين الكبار، والتدابير التقليدية لإزالة السوائل السنخية التي تعتمد على قياسات غسيل أو gravimetrical قد لا تكون مناسبة لدراسة بدقة إزالة السوائل في الرئة في نماذج الرئة لحديثي الولادة. في هذا البروتوكول، ونحن لشرح مقايسة التي تسمح للتحديد دقيق لمعدلات إزالة السوائل السنخية في ما بعد الولادة الجراء يوم 10 C57BL / 6 الماوس باستخدام جهاز تصوير الحيوانات الصغيرة. واحدة من أهم فوائد استخدام نهج فلووروسكبيك هو أن الحيوانات يتم تصوير في الجسم الحي. تنفسوا بحرية وقد يتعافى من هذا الاختبار الغازية الحد الأدنى للمراقبة ودراسة في المستقبل. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو نموذج وذمة رئوية في الرئة حديثي الولادة، وتقييم معدل إزالة السوائل السنخية في الرئة لحديثي الولادة. وقد تم تطوير هذه التقنية، في جزء منه، واستراتيجية للحد من لتقليل عدد الحيوانات اللازمة، ولكن تعظيم الانتاج التجريبي. هذا الأسلوب يسمح أيضا للكشف متفوقة من كميات السوائل في الرئة باستخدام التصوير بالأشعة السينية ويتطلب الكفاءة في ضبط النفس الحيوانية الأساسية والتعامل مع 1؛ صغير العمليات الجراحية الحيوانية والقصبة الهوائية تقطير 2، جهاز تصوير الحيوانات الصغيرة، وصورة برامج التحليل الأساسي. المحققون الذين يرغبون في تقييم كميات السوائل في الرئة في الجسم الحي (الف بحريةتخدير athing نماذج حيوانية) قد تجد هذا الإجراء المناسب لتطبيقها. وأخيرا، يمكن هذا البروتوكول تزيد النماذج الأخرى الموجودة في إصابة الرئة لحديثي الولادة المستخدمة في الدراسة الميكانيكية للخلل التنسج القصبي الرئوي، بما في ذلك الضرر الناجم عن فرط التأكسج الرئة والتهوية الميكانيكية، ونماذج من التهاب الرئة 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن تتم جميع التقنيات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الرعاية المؤسسية واللجنة الاستخدام.
1. الأشعة السينية التصوير اكتساب
- برنامج نظرة عامة (انظر الشكل 1 لمحة عامة عن إعدادات البرنامج).
- حدد زر التقاط تحت علامة التبويب ملف مباشرة.
- في القائمة المنسدلة إعدادات، حدد الدورة الحالية.
- تحديد التعرض قياسي في مربع القائمة المنسدلة الموجودة تحت التعرض الوقت.
- تعيين وقت التعرض إلى 2.00 دقيقة، ورقم التعرض إلى 1. تعيين X Binning وY Binning إلى 2 بكسل. انظر الشكل 1.
- اختر تراكم النهائي من القائمة المنسدلة خيارات التصدير.
- في إعدادات الإضاءة، سيليط م X-راي من القائمة المنسدلة الإضاءة المصدر. الافتراضي تعيين KVP في 35.
- حدد اختيار آلي في القائمة المنسدلة تطبيق المرجعي ملف لتطبيق ملف إشارة الأشعة السينية المقابلة. (أنظر القسم 2).
- في كاميرا تعيين لإعدادات، تعيين و توقف إلى 2.51.
- تعيين فوف (مجال الرؤية) إلى 125.64 للفئران PN10.
- تعيين البؤري إلى 13، وفي القائمة المنسدلة بجوار شريط التمرير البؤري، حدد الأشعة السينية.
- لالأشعة السينية، تعيين تصفية الإثارة وتصفية الانبعاثات إلى 0 في القائمة المنسدلة.
- إنقاذ الدورة الحالية بالنقر فوق جديد على رأس بجانب إعدادات. أدخل اسم جديد اكتساب إعدادات ملف، على سبيل المثال، "جوبيتر واحدة التعرض حدث لجعل البروتوكول." انظر الشكل 2.
- إنشاء بروتوكول التصوير بالأشعة السينية
- انقر على زر إنشاء / تحرير البروتوكولات على الجانب الأيمن من نافذة مفتوحة.
- كما تظهر نافذة منبثقة البروتوكول الجديد، انقر فوق زر جديد في أعلى الزاوية اليمنى
- أدخل الاسم الذي البروتوكول سيوفر تحت، على سبيل المثال "إن الرب بروتوكول تجريبي"، ثم انقر فوق موافق. (انظر الشكل 3).
- في الجزء السفلي من النافذة المنبثقة بروتوكول في خطوات بروتوكول، تأكد من أبرز أن الخطوة 1 في النص الأحمر، التقاط صور جديدة محددا، والقيام بأي شيء تم تحديده في قبل التقاط الصور القائمة المنسدلة.
- في إعداد لقطة، حدد الحدث التعرض مرة واحدة ولدت مؤخرا من الخطوة 1.1.12.
- حدد انتظر (ثانية) من بعد التقاط صورة القائمة المنسدلة.
- انقر فوق الزر تحرير، الطباعه 180 في مربع المنبثقة، ثم انقر فوق موافق لإضافة 3 دقائق وقت الانتظار بعد كل شراء 2 دقيقة.
- تكرار الخطوة 1 عن طريق النقر بزر الماوس فوق علامة التبويب الخطوة 1 واختيار الخطوة مكررة. إنشاء 23 مكررة لفترة الملاحظة 2 ساعة. (انظر الشكل 4).
- في الخطوة الأخيرة (الخطوة 24)، تغيير بعد التقاط الصور وضع لفعل أي شيء من الانتظار (ثانية).
- انقر على زر حفظ والخروج من محرر البروتوكول.
2. الملفات المرجعي الإضاءة
ملاحظة: تطبيق الملفات إضاءة إشارة الأشعة السينية إلى صورة الأشعة السينية من أجل الصحيح تلقائيا عن الاختلافات في الكشف عن التوحيد من صور الأشعة السينية التي تم الحصول عليها في جميع أنحاء التجربة. الإجراءات المبينة أدناه هي محددة لبروكر في فيفو أنظمة التصوير الحيوانية. الأنظمة الأخرى في الجسم الحي التصوير قديستخدم.
- إنشاء ملف إشارة الإضاءة عن طريق فتح برامج التصوير الجزيئي والنقر على زر الالتقاط.
- باستخدام القائمة المنبثقة، ووضع إعدادات التقاط الأشعة السينية في الإضاءة المصدر (انظر الإعدادات المقترحة في المادة 1 أعلاه) ثم حدد المرجع الإضاءة في نوع التعرض. يمكن العثور على هذا تحت إسقاط التعرض ستاندرد أسفل مربع. (انظر الشكل 5).
- إزالة جميع العينات من محطة الصورة. تعيين binning X و Y إلى 4 × 4 binning. الرجوع إلى الجدول رقم 1: مرات التعرض ملف مرجعي الإضاءة لتحديد زمن التعرض دقيقة.
- الصحافة فضح.
- تطبيق ملف مرجعي عن طريق تحديد اختيار السيارات من القائمة المنسدلة تطبيق تحت المرجعي الملف. (انظر الشكل 6). سيتم الآن تطبيق الملف إضاءة إشارة تلقائيا إلى جميع ايم الأشعة السينيةالأعمار التي التقطتها مع إعدادات الكاميرا نفسها. الخطوات 2،1-2،4 لن تحتاج لتكرارها إذا تستخدم إعدادات الكاميرا نفسها في تجارب لاحقة.
ملاحظة: يمكن تطبيق ملف إشارة الإضاءة بعد الحصول على الصور، أو في حالة حدوث رسالة خطأ بعد لصناعة السيارات في اختيار الملفات المرجعية. تطبيق إضاءة إشارة ملفات التقاط ما بعد الصورة باستخدام السلسلة التالية من الأوامر في لوحة التنقل من برامج التصوير الجزيئي: صورة> الرياضيات صورة> النوع: العمل> حساب: تصحيح الإضاءة. حدد الصورة الإدخال (X) التي ترغب في تطبيق ملف إضاءة إشارة (ص) ل. إعادة تسمية ملف تصحيح (Z). (انظر الشكل 7).
المناولة 3. الحيوان
- الحصول على الحيوانات
- شراء السدود الحوامل من مربي تجارية أو تولد إناث الفئران في المنزل في 12 أسبوعا من العمر (أو أكثر) وفقا للمبدأ التوجيهي المؤسسيالصورة.
- بيت الفئران حديثي الولادة مع الأمهات المرضعات إلى يوم بعد الولادة (PN) 10.
- التخدير الحيوان (PN 10)
- إعداد كوكتيل الكيتامين / زيلازين لتخدير PN 10 الفئران للآثار التخدير طويلة لمدة تصل إلى 40 دقيقة. إضافة 500 ميكرولتر من الكيتامين (100 ملغ / مل) إلى 75 ميكرولتر من زيلازين (100 ملغ / مل). تمييع 01:10 في محلول ملحي 0.9٪ لجعل الكيتامين (100 ملغ / كلغ) / زيلازين (10 ملغ / كلغ) كوكتيل مخدر.
- وزن الفئران حديثي الولادة.
- باستخدام حقنة 10/03 مع إبرة 31 G 5/16 بوصة (8 ملم) وإدارة 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من التخدير مع حقنة داخل الصفاق.
- إبقاء الحيوانات جافة ومعزولة لمنع خسائر فادحة في حرارة الجسم.
4. الرغامي Instillations
- إعداد محلول ملحي داخل القصبة الهوائية يتكون من كلوريد الصوديوم 140 ملم و 5 ملم بوكل، 1 ملم CaCl 2، و 10 ملي HEPES. الرقم الهيدروجيني = 7.4. يجب أن يكون الأسمولية هذا الحل319 mosmol / كغ H 2 O.
- جبل تخدير الحيوانات الجانب البطني حتى على لوحة العمليات الجراحية منحدر باستخدام الشريط الجراحية. Ensurethat رؤوس الحيوانات هي في الجزء العلوي من الصعود.
- إجراء قرصة اصبع القدم للتأكد من أن الحيوانات هي تخدير وعلى استعداد لإجراء عملية جراحية. تطهير جميع المناطق، والصكوك، ومنطقة الصدر الجراحية للحيوان.
- تقديم (3 مم) شق صغير في الجانب البطني الأمامي-وسطي من الرقبة (منطقة الحلق) باستخدام مشرط جراحي، حجم 11. دفع جانبا لل platysma والأمامية عضلات القصبة الهوائية باستخدام ملقط أضعفت من أجل رؤية والوصول إلى القصبة الهوائية.
- غرس 3 ميكرولتر / غرام من الوزن (حوالي 10-30 ميكرولتر الحجم النهائي) من المياه المالحة عبر القصبة الهوائية تتعرض باستخدام إبرة 31 G 5/16 بوصة (8 ملم). يتم ترك شق بسيط مفتوحة أثناء التصوير الحيوانية وعادة ما يشفى نفسه بشكل جيد. التشاور مع شعبة المحلية من الثروة الحيوانية لتحديد ما إذا شق وبالمثل يمكن ترك الباب مفتوحا. خلاف ذلك، قد الغرزأن تكون مطلوبا.
5. الحيوان التصوير
- ضع الجراء البطني على القاع واضح، قابل للنقل، صينية التصوير الحيوانية. توسيط الحيوانات بحيث شعاع الأشعة السينية ستكون مباشرة على منطقة الصدر.
- بالنسبة للأتراب الحيوانات الوتر، وضع الجرو الأول مباشرة في منتصف الدرج، وبالنسبة للأتراب زوجية مكان الجرو الأول غادر لتوه من المركز حتى أنه عندما يتم وضع الحيوانات الأخرى على علبة تتركز جميع الحيوانات.
- العودة علبة التصوير لمجلس الوزراء التصوير بالأشعة السينية وإغلاق باب مجلس الوزراء.
- تشغيل وحدة التحكم الحراري الحيوانية للحفاظ على درجة حرارة الجسم الحيوانات تخدير. استخدام الإعداد عالية لتحقيق درجة حرارة الغرفة حوالي 35-37 درجة مئوية. تشغيل وحدة التخدير الحيوان (الأيزوفلورين المتبخرة تسليمها عن طريق الأكسجين) لضمان تخدير الحيوانات ويجمد طوال مدة إجراء التصوير 2 ساعة.
- تنفيذ الأشعة السينية بروتوكول التصوير
- انقر على التقاط وحدد البروتوكول المناسب، على سبيل المثال، "إن الرب بروتوكول تجريبي" من القائمة المنسدلة البروتوكول. (انظر الشكل 8).
- انقر على زر بروتوكول تنفيذ مختارة في برامج التصوير الجزيئي.
ملاحظة: سوف نافذة منبثقة تظهر لمتابعة حالة من الحصول على الصور، وعندما بروتوكول اكتمال نافذة سوف تختفي. جرعة الأشعة السينية منخفضة، <من 0.3 mRem أو حوالي 10 مرات أقل من الأسنان الأشعة السينية. كما هو الحال مع إجراءات الأشعة السينية أخرى، لا يوجد الإشعاع المتبقي. - عندما الدورة اكتساب 2 ساعة كاملة، وإزالة الحيوانات من علبة التصوير وإعادتها إلى القفص. مراقبة الحيوانات لتحقيق الانتعاش الكامل قبل أن يعود إلى الرفوف.
تحليل 6. البيانات
ملاحظة: برنامج التصوير الجزيئي يسمح للالكمي وترجمة XRعبد المنعم يوسف كثافة بكسل في معدل إزالة السوائل في الرئة. الخطوات التالية الخطوط العريضة للإجراءات اللازمة لتطبيع صور الأشعة السينية وقياس شدة في مناطق محددة من الفائدة (ROI).
- تصميم قالب العائد على الاستثمار
ملاحظة: يجب أن يتم إنشاء منطقة قالب مصلحة محددة لصور الأشعة السينية استولي عليه خلال الدراسة 2 ساعة، ويجب استخدامها من أجل مقارنة شدة الأشعة السينية بين المجموعات التجريبية. منذ كميات صغيرة من التحديات المالحة تتراكم عادة في الفص العلوي الأيسر من الرئة 4-6 وينبغي أن العائد على الاستثمار (ق) التركيز على هذا الجزء من الرئة.- فتح أول وآخر صورة الأشعة السينية في المجموعة 2 ساعة. حدد إطار أول صورة الأشعة السينية.
- في شريط الأدوات ملاحة، حدد يدوي رويس> مجموعة العائد على الاستثمار الجديد.
- انقر العائد على الاستثمار البيضوي وخلق العائد على الاستثمار الذي يغطي على نحو كاف الماوس لمغادرة lung.An العائد على الاستثمار لا يعرف حتى الحمراء، الخطوط العريضة العائد على الاستثمار هو الدكتورagged إلى موضع آخر. سيتم وضع الخطوط العريضة لالعائد على الاستثمار المحددة باللون الأزرق مع عدد.
- إذا يتم تصوير الجراء متعددة، انقر على الأحمر، وعائدات الاستثمار المحددة واسحب إلى الرئتين الأيسر من الفئران الأخرى لخلق المزيد من رويس الفردي في نفس المجموعة. اسحب الأحمر، وعائدات الاستثمار الواردة إلى المنطقة مع خلفية واضحة لإنشاء ROI الخلفية.
- تحديد مؤشر التحديد لوضع رويس للكذب على الرئة اليسرى كل فأر، ومباشرة تحت الضلع الثاني.
- في شريط الأدوات العلوي، انقر فوق صورة العرض.
- تحقق التراكب في الحوار صورة العرض تراكب مشاركة صورة الأشعة السينية مع الحفاظ على مواقع مجموعة العائد على الاستثمار. إذا لزم الأمر، حدد مؤشر التحديد في شريط الأدوات الإنتقال إلى توفيق أوضاع رويس وضمان التغطية الرئة كافية في كلتا الصورتين.
- في الحوار العائد على الاستثمار يدوي، حدد قالب> حفظ للقالب. اسم رانه القالب ثم انقر فوق موافق.
- إغلاق كل من الصور. حدد لا عند مطالبتك بحفظ التغييرات.
- تطبيق قالب عائد الاستثمار لكل صورة الأشعة السينية القبض على تحليل إزالة السوائل من خلال فتح جميع الصور التي التقطت أثناء الدراسة. ابدأ بتحديد ملف مفتوح وانقر رويس دليل> قالب.
- حدد القالب العائد على الاستثمار التي تم إنشاؤها مسبقا من القائمة المنسدلة وانقر فوق تطبيق على كافة المستندات المفتوحة.
- تصدير العددية بيانات العائد على الاستثمار من الصور إلى جدول
- في أعلى الزاوية اليسرى، انقر فوق ملف> تصدير البيانات> العائد على الاستثمار.
- تحقق كما هو معروض والسيارات المفتوحة في Excel في الحوار المنبثقة.
- حدد المستندات تصدير جميع المفتوحة.
- اسم الملف ثم انقر فوق حفظ.
- انهيار برنامج التصوير الجزيئي.
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8, The National Academies Press. (2011).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 233-245 (2014).
- Goodson, P., et al. Nadph oxidase regulates alveolar epithelial sodium channel activity and lung fluid balance in vivo via O2- signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L410-L419 (2012).
- McNeilly, T. N., Tennant, P., Lujan, L., Perez, M., Harkiss, G. D. Differential infection efficiencies of peripheral lung and tracheal tissues in sheep infected with Visna/maedi virus via the respiratory tract. J Gen Virol. 88, 670-679 (2007).
- Starcher, B., Williams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Downs, C. A., Kumar, A., Kreiner, L. H., Johnson, N. M., Helms, M. N. H2O2 regulates lung ENaC via ubiquitin-like protein Nedd8. J Biol Chem. 288, 8136-8145 (2013).
- Gammon, S. T., et al. Preclinical anatomical, molecular, and functional imaging of the lung with multiple modalities. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L897-L914 (2014).
- Takemura, Y., et al. Cholinergic regulation of epithelial sodium channels in rat alveolar type 2 epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L428-L437 (2013).
- Lewis, R. A., et al. Dynamic imaging of the lungs using x-ray phase contrast. Phys Med Biol. 50, 5031-5040 (2005).
- Nyren, S., Radell, P., Mure, M., Petersson, J., Jacobsson, H., Lindahl, S. G., Sanchez-Crespo, A. Inhalation anesthesia increases V/Q heterogeneity during spontaneous breathing in healthy subjects. Anesthesiology. 113 (6), 1370-1375 (2010).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لوحات اليسار في الأرقام 9-10 هي من PN 10 الرئتين الماوس تصويرها في الأساس (ما قبل غرسها). تظهر هذه الصور تقطير ناجحة من التحديات المالحة في الفص الأيسر من الرئة لحديثي الولادة. في الشكل 9، والرئة الماوس تغرس tracheally مع محلول ملحي المحددة أعلاه (انظر القسم 2.1). لوحات الوسطى والأيمن من الشكل 9 عبارة عن صور الأشعة السينية من نفس الماوس التي تم الحصول عليها 5 دقيقة و 2 ساعة بعد تقطير. وكان هذا الحيوان مسح بنجاح التحدي المالحة. على وجه التحديد، وزيادة كثافة الأشعة السينية من هذه الحيوانات العائد على الاستثمار من 187.67 إلى 515. وهكذا، هناك علاقة عكسية بين كثافة بكسل وحجم السوائل في الرئة. وهذا هو القول، والقيمة النسبية أكبر، وأقل السائل هناك في الرئتين. قد يكون من المفيد أن نفهم أن المزيد من الطاقة الأشعة السينية يمتص (وبالتالي قيمة المبلغ عنها أكبر) عندما يكون هناك attenuati أقل السوائلنانوغرام الأشعة السينية. في الشكل 10، وتغرس في الرئة الماوس PN 10 tracheally مع مركب يحتوي على الجلوتاثيون المؤكسد (أعيد تشكيلها في المياه المالحة وصفها في 2.1) التي تحول دون إزالة السوائل السنخية التحدي المالحة من خلال منع الظهارية النشاط قناة الصوديوم. فإن القيمة العددية للالعائد على الاستثمار هذا الحيوان يقلل من قبل غرس وملفات تصوير الأشعة السينية تغرس آخر، مما يدل على زيادة التعتيم الأشعة السينية. على وجه التحديد، وشدة صافي الحيوان حوالي 5 دقائق وبعد تقطير - 64، وانخفض إلى - 182. ومرة أخرى، لاحظ علاقة عكسية بين كثافة العائد على الاستثمار بكسل وكمية السوائل في الرئتين، زيادة السوائل في الفص الأيسر العلوي من الرئة خفف امتصاص الأشعة السينية.
تقييم شدة صافي العائد على الاستثمار تتيح التقييم الكمي للتغيرات في معدل الرئة تطهير السائل، وإن كان البرنامج الحصول أيضا يسمح للمحققين للتعبير عنالبيانات من حيث جم / سم 3 عند الرغبة في ذلك. وعلاوة على ذلك، يمكن للمحققين استخدام كل حيوان كما سيطرتها وتطبيع كل شدة الأشعة السينية إلى نقطة زمنية الأولية (أيو)، مثل تي = 5 دقائق وتقرير صافي التغيرات في التعتيم الأشعة السينية (أي قدر من التغيير في حجم السوائل في الرئة).
الشكل 1. إعدادات التعرض. ويوضح هذا لقطة شاشة الإعدادات التعرض المناسبة المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إعدادات ملف. يوضح هذا قطة الشاشة خطوة رئيسية في توليد إعداد ملف الذي سيتم استخدامهفي البروتوكول. وهناك نافذة منبثقة (كما هو موضح) طلب الاسم الجديد للملف إعدادات الاستحواذ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. بروتوكول التصوير. يوضح هذا قطة الشاشة خطوة رئيسية في تحديد ما إذا كان قد تم إنشاء بروتوكول التصوير الجديد بنجاح. وهناك نافذة منبثقة (كما هو موضح) تظهر وسيطلب اسم بروتوكول جديد للبروتوكول الذي تم إنشاؤه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. بروتocol خطوات. ويوضح هذا قطة الشاشة اختصار لتكرار ملف إعدادات الاستحواذ، اضافة الى وجود خطوة جديدة، أو لحذف خطوة ضمن بروتوكول التصوير. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الإضاءة المرجعي. هذه لقطة شاشة يعرض الأمر إضاءة المرجعية والإعدادات المناسبة في برنامج التصوير الحيوان المناسب لإنشاء ملف إضاءة إشارة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. تحديد تلقائي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. تصحيح الإضاءة. ويوضح هذا لقطة شاشة التطبيق المناسب لملف إضاءة إشارة ولدت بعد التصوير الحيوانية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. تنفيذ البروتوكول. هذه لقطة الشاشةيوضح كيفية تنفيذ بروتوكول المحدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
شخصية الصور 9. الأشعة السينية من الرئتين مسح الصورة التمثيلية للPN 10 الرئتين قبل حصوله على التحدي المالحة. (قبل غرس، اللوحة اليسرى). 5 دقائق بعد تقطير (لوحة المتوسطة)، و 2 ساعة بعد التحدي المالحة قد طهرت من رئة سليمة على خلاف ذلك (اللوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 10. صور الأشعة السينية من الرئتين المغمورة. تمثيلا وصورة tative من PN 10 الرئتين قبل حصوله على التحدي المالحة (قبل غرس، اللوحة اليسرى) التي تحتوي على ثاني كبريتيد الجلوتاثيون، والذي يمنع النقل المذاب paracellular. 5 دقائق بعد تقطير من ثاني كبريتيد الجلوتاثيون (لوحة المتوسطة)، و 2 ساعة بعد تثبيط النقل paracellular الأمر الذي يؤدي إلى حدوث فيضانات السنخية (اللوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.لا مرشح = تعرض 10 ثانية 0.1MM = تعرض 15 ثانية 0.2mm و= تعرض 20 ثانية 0.4MM = تعرض 30 ثانية 0.8MM = تعرض 30 ثانية حجم فلتر الأشعة السينية يرتبط إلى وقت التعرض محدد لكرتناول ملف إضاءة إشارة. الجدول 1. الإضاءة المرجعي الملف ويرفع هذا الملف مرات التعرض المناسبة لتوليد الملفات المرجعية الإضاءة على أساس مرشحات الأشعة السينية المستخدمة في دراسات التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام التصوير بالأشعة السينية، صور واضحة من الرئتين حديثي الولادة يمكن تحليلها لكميات السوائل في الرئة. نحن 7،3،11، والبعض الآخر 10، وقد استخدمت بنجاح التصوير بالأشعة السينية لتحديد التغيرات الديناميكية في حجم السوائل في الرئة في نماذج حيوانية بحرية التنفس تخدير، وهذا الأسلوب يحمل وعودا كبيرة للمضي قدما في دراسة إصابة الرئة لحديثي الولادة. واحدة ميزة كبيرة في استخدام نهجنا لتقييم حجم السوائل في الرئة (على عكس الأشعة السينية مرحلة التباين 10 على سبيل المثال) هي أن ما يصل إلى خمسة PN10 الجراء الماوس يمكن دراستها في وقت واحد باستخدام نظام التصوير الذي هو مكان مشترك في مرافق البحوث والنوى .
غرس الرئة حجم السائل المناسب، حتى لا يغرق أو انهيار الرئة، أمر بالغ الأهمية لنجاح تنفيذ هذا البروتوكول، وربما تحتاج إلى استكشاف تجريبيا قبل بروتوكولات التصوير بالأشعة السينية يمكن تطبيقها. حساسية هذا الاختبار يسمح للكشف عن نظام القبول صغير جداوفاق من المياه المالحة تغرس عن طريق الكشف بالأشعة السينية. كنا قادرين على تمييز الاختلافات في التعتيم الأشعة السينية من الرئتين حديثي الولادة غرست مع 10 مجلدات ميكرولتر من محلول ملحي. الفرق في عتامة الأشعة السينية هم أكثر وضوحا عندما يتم إدخال مثبطات قناة الصوديوم في المجال الجوي السنخية لأن التحديات المالحة لا يمكن استيعابها وتستمر الرئتين لإفراز السوائل في المجال الجوي. في حال تم إدخال أية كميات كبيرة بشكل غير لائق من المياه المالحة، ووضع الحيوانات في غرفة التصوير مع الأكسجين التي تصب في غرفة عبر الموانئ التخدير يمكن أن يسهل التنفس في الرئتين التي غمرتها المياه.
نتائجنا باستخدام التصوير بالأشعة السينية قابلة للمقارنة مع الموافقات السوائل السنخية قياس باستخدام نهج أكثر تقليدية، مثل الرئة نسب الوزن الرطب الجاف والأزرق ايفان لتحديد تركيز البروتين (4). علينا أن نبرهن الآن أن هذا النهج يمكن تطبيقها على الجرو الماوس حديثي الولادة. هذا ايم الأشعة السينيةالشيخوخة تقنية لتحديد كميات السوائل في الرئة يمكن بسهولة جنبا إلى جنب مع طرائق التصوير إضافية. على سبيل المثال، علامات الفلورسنت أو تحقيقات إضاءة الحيوية التي يمكن أن تغرس في نفس الوقت إلى الحويصلات الهوائية وتقييمها. (وقد وصفت الكشف عن تحقيقات الفلورسنت والانارة 8، ويقع خارج نطاق هذا التقرير). القدرة على المشاركة في تسجيل حجم السائل الرئة (باستخدام التصوير بالأشعة السينية) جنبا إلى جنب مع القدرة على الكشف عن المؤشرات الحيوية الفلورسنت هي واحدة من العديد من المزايا من استخدام هذا الاختبار الديناميكي ونظام تجاري لقياس إزالة السوائل في الرئة. فوائد أخرى لاستخدام هذا النهج لتحديد التخليص والنسبي حجم السوائل في الرئة وتتضمن القدرة على إجراء الدراسات الطولية (وبالتالي تقليل عدد الحيوانات اللازمة لتحقيق ملاحظات ذات دلالة إحصائية)، والقدرة على اكتشاف التغيرات الصغيرة في حجم السوائل في الرئة في التنفس بحرية ، تخدير، الجراء الماوس الولدان. واحد الحد من استخدامفي نهج التصوير الجسم الحي، ومع ذلك، هو أن التخدير يمكن أن يغير توزيع الغاز وتدفق الدم في الرئتين. وقد ثبت عدم التطابق في التهوية والتروية (V / Q) وتحويلة إلى زيادة تحت التخدير في المتطوعين البالغين الأصحاء 12، وبالتالي تقليل الأوكسجين في الجسم. هذا تأثير سلبي، ومع ذلك، يمكن أن يتم تعويضهم عن طريق زيادة تركيز الأكسجين من وحي. من وجهة نظر تقنية، وتقلب بين أنظمة التصوير في الطاقة تدفق الأشعة السينية قد يتطلب تعظيم الاستفادة من كل نظام قبل إجراء الدراسات التصوير. على سبيل المثال، على نظام مع مصدر الأشعة السينية مع مزيد من التمويه و / أو كاشف مع كفاءة الكم متفوقة، وهو أعلى و / وقف وانخفاض الدولة binning قد توفر أفضل جودة الصورة عند تقييم تغيير طفيف في مقاومة الأشعة السينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
هذه المقالة هي جزء من عدد خاص عن التصوير المتعدد الوسائط ما قبل السريرية، برعاية بروكر BIOSPIN.
Materials
Name Company Catalog Number Comments Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO) Bruker; Billerica, MA Ketamine Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA 26637-411-01 Xylazine Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA 4821 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium) Lonza; Walkersville, MD 17-513F Sodium chloride Amresco; Solon, OH 241 Potassuim chloride Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ P217-3 Calcium chloride Sigma-Aldrich; St. Loius, MO C5080 HEPES Sigma-Aldrich; St. Loius, MO H3375 0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ 328438 References
Tags
الطب، العدد 113، الرئة لحديثي الولادة،
