Abstract
出生时，肺经历从分泌吸收了深刻的表型开关，它允许以适应自主呼吸。促进和维持这种表型是整个生命的正常肺泡生长和气体交换至关重要。几个 体外研究其特征关键调节蛋白，信号分子，和类固醇激素，可以影响肺液清除率的作用。然而， 在体内的检查，必须执行以评估这些调控因子是否在调节围产期肺液体吸收中起重要的生理作用。因此，实时X射线成像的使用情况，确定围产期肺液清，或肺水肿，代表在该领域的技术进步。在此，我们解释和说明的方法来评估在10后产后我们每天C57BL / 6小鼠肺部肺泡液体清除和肺泡洪水率ING X射线成像和分析。成功地执行本协议要求的体制动物护理和使用委员会（IACUC）， 体内小动物X射线成像系统，以及兼容的分子成像软件事先批准。
Introduction
在出生，新生儿肺部必须从流体分泌过渡到一个流体再吸收器官建立足够的通风和主体的氧合。有利于在出生时肺液有效地清除的机制（或妨碍）仍不清楚。在建模C57BL / 6新生小鼠的幼崽肺泡液体清除率将导致更好地理解监管因素，可以提高或降低液体的吸收率。它也可以适用于急性肺损伤或感染的其他新生模型，并可能导致对呼吸窘迫新生儿新的治疗策略。
由于新生儿的肺相比，成人肺是微不足道的，依赖于灌洗或gravimetrical测量肺泡液体清除常规措施可能不适合准确地研究新生儿肺部模型肺液清关。在这个协议中，我们证明的测定法，允许肺泡液体清除率的准确测定日龄10 C57BL / 6小鼠的幼崽用小动物成像仪。使用荧光方法的一个主要的好处是，将动物体内成像。他们在自由地呼吸，可能会为未来的观测和研究这种微创法恢复。该方法的总的目标是肺水肿在新生儿肺部建模，并评估在新生儿肺部肺泡液体清除的速率。这种技术被开发，部分作为减少策略，以减少所需的动物数量，然而最大化试验输出。这种技术还允许肺流体体积的优越检测用X射线成像，并需要在基本动物克制熟练度和处理1;小动物手术和气管滴入2，小动物成像仪，和基本的图像分析软件。谁愿意在体内评价肺流体体积研究者（BRE自如athing麻醉动物模型）可能会发现适合自己应用此过程。最后，该协议可能会增加在支气管肺发育不良，包括高氧性肺损伤，机械通气和肺部炎症3车型的机理研究中使用的新生儿肺损伤等现有车型。
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Protocol
所有的实验技术，必须按照制度管理和使用委员会的指导方针进行。
1. X射线图像采集
- 软件概述（参见图1软件设置的概述）。
- 选择正下方的文件选项卡捕捉按钮。
- 在设置下拉菜单中，选择当前会话 。
- 选择位于下暴露时间下拉框中标准曝光 。
- 设置曝光时间为2.00分钟和第暴露于1。设置X分级和Y分级为2个像素。 见图1。
- 选择导出选项下拉菜单中最后积累 。
- 在照明设置，塞莱CT X射线来自光源下拉菜单。默认KVP被设定在35。
- 在应用参考文件下拉菜单中选择自动选择申请相应的X射线的参考文件。 （见第2节）。
- 在设置摄像头设置 ，设置光圈为2.51。
- 设置FOV（视场），以125.64为PN10老鼠。
- 焦平面设置为13，并在焦平面滑块旁边的下拉菜单中选择X射线 。
- 对于X射线，设置激发滤光片 ，并在下拉菜单中发射滤光片为0。
- 通过单击新建顶部旁边设置保存当前会话。新输入的名称获得设置文件，如 “朱庇特单曝光事件作出一个协议。”参见图2。
- 创建的X射线成像协议
- 点击创建/编辑协议按钮打开的窗口的右侧。
- 由于出现新的协议弹出窗口，点击右上角的角落新建按钮
- 输入该协议将在保存，例如“朱庇特示范协议”，然后单击确定的名称。 （参见图3）。
- 在协议的步骤议定书弹出窗口的底部，确保步骤1中红色文本高亮显示， 捕捉新形象被选中， 什么事都不做在之前图像捕捉下拉菜单中选择。
- 在拍照设置，请从步骤1.1.12最近生成的单次曝光的事件。
- 请从拍摄图像后下拉菜单中等待（秒）。
- 单击编辑按钮，典型值Ë180插入弹出框，然后点击确定每2分钟采集后添加一个3分钟的等待时间。
- 重复通过右键单击步骤1选项卡，选择步骤重复步骤1。创建23重复了2小时的观察期。 （参见图4）。
- 在最后的步骤（步骤24）， 图像捕捉设置攻略从等待（秒） 之后 没有改变。
- 单击保存按钮并退出该议定书编辑器。
2.照明参考文件
注意：为了在整个实验中获得的X射线图像的检测器的均匀性的变化自动修正应用X射线照射的参考文件到的X射线图像。下面概述的程序是特定于布鲁克体内动物成像系统; 其它体内成像系统可使用。
- 产生通过打开分子成像软件，点击捕捉按钮的照明参考文件。
- 使用弹出式菜单，建立照明光源的X射线拍摄设置（见上述第1条建议的设置），然后选择在曝光式照明参考 。这可以根据标准曝光下拉框中找到。 （参见图5）。
- 从图像站删除所有样本。设置的X和Y分箱到4×4像素合并。参照表1：照明参考文件的曝光时间 ，以确定准确的曝光时间。
- 新闻揭露 。
- 从下拉菜单下的应用参考文件下拉选择自动选择应用参考文件。 （参见图 6）。照明参考文件将被自动应用到所有的X射线IM使用相同的相机设置拍摄的年龄。步骤2.1 - 2.4将不需要被重复，如果相同的相机设置在随后的实验中使用。
注意：所述的照明参考文件可以在图像采集之后施加，或者如果参考文件的自动选择后出现一条错误消息。应用照明参考使用以下一系列分子成像软件的导航面板中的命令文件的图像后捕获： 图像>图像数学>类型：任务> 计算：光量校正 。选择输入图像（X），你想在照明参考文件（Y）申请。重命名更正的文件（Z）。 （参见图7）。
3，动物处理
- 获取动物
- 从商业育种购买怀孕水坝或者按照机构指导方针在12周龄（或以上）繁殖的房子雌性小鼠秒。
- 房子新生小鼠与哺乳期的母亲高达日龄（PN）10。
- 动物麻醉（PN 10）
- 准备氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒麻醉PN长时间麻醉作用长达40分钟10只。加入500微升氯胺酮（100毫克/毫升）的对甲苯噻嗪的75微升（100毫克/毫升）。在0.9％的盐溶液，以使一个氯胺酮（100毫克/千克）/甲苯噻嗪（10毫克/千克）麻醉剂鸡尾酒稀释1:10。
- 称量新生小鼠。
- 使用3/10注射器用31克5/16英寸（8 MM）针，辖10微升/ g体重麻醉用腹膜内注射。
- 动物保持干燥，隔热，以防止体内热量过度流失。
4.气管滴注
- 制备由140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，1mM的氯化钙和10mM的HEPES的气管内盐水溶液; pH值= 7.4。此溶液的渗透压应319 mosmol /公斤H 2 O.
- 安装了麻醉动物腹侧到用外科胶带倾斜的手术板。 Ensurethat动物的头是在倾斜的顶部。
- 执行脚趾捏，以确保动物麻醉，准备手术。消毒所有外科领域，仪器，和胸部的动物的区域。
- 做一个小（3毫米），颈部（喉区）的前侧 - 内侧腹方面的采用外科手术刀切开，大小11推开颈阔肌，并以可视化和访问气管前壁用钝钳气管肌肉。
- 灌输3微升/ g的重量（约10 - 30微升最终体积）的生理盐水通过使用31克5/16英寸（8 MM）针暴露气管。该小切口留给动物成像期间开放，通常能自动恢复的很好。与动物资源的本地司协商，以确定是否该切口也同样可以保持打开。否则，可能缝线是必需的。
5.动物成像
- 仔兔腹侧一个明确的底部，可拆卸，动物成像盘位置。居中的动物，以使X射线束会直接在胸区。
- 为奇数动物队列，直接放置在第一小狗在托盘的中间，和为偶数队列放置第小狗刚刚离开中心的，这样，当其它动物被放置在托盘中的所有动物都集中在。
- 返回成像盘的X射线成像柜和关闭柜体的门。
- 打开动物的热控制单元，以保持麻醉动物的体温。使用高设置，以实现约35室温度 - 37℃。转动物麻醉单元（通过氧输送汽化异氟醚），以确保动物麻醉并固定在整个2小时的成像过程的持续时间。
- 执行X射线成像协议
- 点击捕获并选择适当的协议， 例如，“朱庇特示范协议”，从协议下拉菜单。 （参见图8）。
- 点击分子成像软件执行选择的 协议按钮。
注意：一个弹出式窗口将出现跟踪图像采集的状态，该协议完成后，窗口会消失的时候。 X射线的剂量低，<0.3 MREM或大于牙科用X射线小约10倍。与其它的X射线的程序，没有残留辐射。 - 当2小时采集进程完成后，从成像托盘上取出的动物，并将其退回到自己的笼子里。回到机架之前监视动物完全恢复。
6.数据分析
注：分子成像软件可以量化和XR翻译唉像素强度到肺液清除率。以下步骤概述正常化的X射线图像和在感兴趣（ROI）定义的区域量化强度所需要的程序。
- 设计一个模板，投资回报率
注意：兴趣模板的一个区域必须特定于捕获的X射线图像的2小时的研究过程中创建的，并应以比较的X射线强度之间的实验组使用。由于生理盐水的挑战少量肺4-6的左上叶通常积累，投资回报率（S）应侧重于肺的这一部分。- 打开在2小时集中的第一个和最后的X射线图像。选择第一个x射线图像的窗口。
- 在导航工具栏中，选择手动的投资回报 > 新的投资回报率设置 。
- 点击ROI椭圆 ，并创建一个投资回报率，足可涵盖鼠标的左lung.An投资回报率直到红色没有定义，概述了投资回报率是博士agged到不同的位置。已定义的投资回报率会以蓝色列出了一些。
- 如果多个幼仔成像，一下就红了，勾画ROI并拖动到其他老鼠的左肺在同一组，以创造更多的个人投资回报率。红，概述了投资回报率拖到一个区域有明显的背景下，以创建一个背景的投资回报率。
- 选择鼠标选择来定位的ROI趴在每只小鼠的左肺，直属第二肋。
- 在顶部的工具栏上，单击图像显示 。
- 检查覆盖在图像显示对话框覆盖的最后一个X射线图像，同时保持设定的ROI的位置。如果有必要，导航工具栏上选择鼠标选择调整的ROI的位置，并确保在两个图像足够的肺覆盖。
- 在手动ROI对话框中，选择模板 > 保 存为模板 。名T及他模板，然后单击确定。
- 关闭这两个图像。提示保存更改时，选择否 。
- 应用在ROI模板捕获通过打开在研究期间拍摄的所有图像来分析液体清除各X射线图像。选择一个打开的文件开始，然后单击手册投资回报率 > 模板 。
- 从下拉菜单以前创建的ROI模板，然后单击应用到所有打开的文档。
- 从图片到电子表格导出数值数据投资回报率
- 在左上角，点击File> 导出数据 > 投资回报率 。
- 支票在弹出的对话框中显示 ，并自动在Excel中打开 。
- 选择导出所有打开的文档 。
- 命名该文件，然后单击保存 。
- 关闭分子成像软件。
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Representative Results
图9左侧面板- 10是在基线成像PN 10小鼠肺的（预注入）。这些图像显示的盐水挑战成功滴注到新生儿肺部的左叶。在图9中 ，小鼠肺中气管与上述定义的盐溶液滴入（参见第2.1节）。 图9的中间和右侧板是从得到的5分钟和2小时后滴注相同的鼠标的X射线图像;这种动物已成功清除了生理盐水的挑战。具体地说，该动物ROI的X射线强度从187.67增加到515因此，存在像素密度和肺流体容积之间的一个反向相关;也就是说，较大的相对值，所述少流体中有肺。它可能有助于理解更多的 X射线能量吸收（因此较大报告的值）时，有少流体attenuati纳克X射线。在图10中，PN 10小鼠肺中气管与含有氧化型谷胱甘肽的化合物（重构中在2.1中描述盐水）通过阻断上皮钠通道活性抑制盐水挑战的肺泡液体清除灌输;这种动物的投资回报率的数值将减少从预灌输和后灌输X射线成像的文件，指示增加X射线的不透明度。具体地，动物大约5分钟，滴注后是净强度 - 64，以及降低至 - 182再次注意在ROI像素强度和在肺流体的量之间的反比关系;在肺的上部左叶增加的流体衰减的X射线吸收。
投资回报率的评估净强度使肺液清除率变化的定量评价，尽管收购软件还允许调查人员表示如果需要在克/厘米3项数据。此外，研究人员可以使用每只动物作为其自身的控制和正常化所有的X射线强度为初始时间点（IO），如叔= 5分钟，并报告在X射线的不透明度净变化（ 即，变化的量度在肺液体积）。
图1， 曝光设置。该屏幕截图显示在这个协议利用适当的曝光设置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.设置文件 。这个屏幕截图示出了在产生一个文件设置一个关键步骤，将用于在一个协议。一个弹出窗口（如图所示）会要求为收购设置文件的新名称。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 成像协议 。该屏幕截图显示在确定是否一个新的成像协议已经成功创建了关键的一步。一个弹出窗口（如图所示），将出现一个新的协议名称将被要求对产生的协议。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 普罗特ocol步骤。该屏幕截图显示的快捷方式复制收购设置文件，插入一个新的台阶，或者删除成像协议中的一个步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.照明参考 。这个截屏表现出适当的用于创建照明参考文件中的动物成像软件照明参考命令和相应的设置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.自动选择 请点击此处查看该图的放大版本。
图7.光量校正。该屏幕截图显示动物成像后产生的照明参考文件的相应的应用程序。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8.执行协议 。此屏幕截图说明如何执行所选的协议。 请点击此处查看该图的放大版本。
图9. X射线清除肺部图像 PN的形象代表10肺部之前接受生理盐水的挑战。（预灌输;左图）; 5分钟后滴注（中图），以及2小时后，生理盐水的挑战已经从原本健康的肺（右图）被清除。 请点击此处查看该图的放大版本。
图10.水淹肺的X射线图像。Represen含有二硫化谷胱甘肽，抑制旁溶质运移;接收盐水攻击前10肺部的PN对准焦点的图像（左面板预灌输）;二硫化谷胱甘肽（中图），并抑制细胞旁转运导致肺泡水浸（右图）后2小时5分钟滴眼。 请点击此处查看该图的放大版本。没有过滤器= 10秒曝光 0.1毫米= 15秒曝光 0.2毫米= 20秒曝光 0.4毫米= 30秒曝光 0.8毫米= 30秒曝光 X射线滤光器的大小相关于一个特定的曝光时间为CR吃的照明参考文件。 表1.照明参考文件，该文件报告了合适的曝光时间根据影像学检查使用X射线过滤器产生的照明参考文件。
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Discussion
使用X射线成像，新生儿肺部清晰的图像可以被分析为肺液的卷。我们7,3,11和10人，已成功地利用X射线成像，以确定自由呼吸麻醉动物模型肺液量动态变化，以及这种技术带来了巨大希望推进新生儿肺损伤的研究。在使用我们的方法来评估肺流体体积（相对于例如X射线相位constrast 10）的一个主要优点是，最多五个PN10小鼠幼仔可以使用成像系统，该系统是在研究设施和芯共同的地方可以同时研究。
灌输适当的肺液量，以不淹没或折叠肺，是成功实施该协议的关键，可能需要通过实验探索可应用于X射线成像协议之前。该测定的灵敏度允许检测极小volum的通过X射线探伤滴入生理盐水上课。我们已经能够辨别与生理盐水溶液10微升体积的滴注新生儿肺部的X射线的不透明度的差异。在X射线的不透明度的差更加明显时钠通道抑制剂引入到肺泡空域因为盐水挑战不能被吸收和肺部继续分泌流体进入空域。在该盐水的不适当的高体积的引入，将动物与氧气经由麻醉端口流入腔室可以促进在淹没肺呼吸成像室的事件。
使用X射线成像研究结果具有可比性，以肺泡液间隙测量采用更传统的方法，如肺湿干重比，伊文思蓝蛋白浓度4的决心。我们现在表明，该方法可以应用到新生小鼠小狗。该X射线即时用于确定肺流体体积老化技术可以很容易地与另外的成像方式相结合。例如，荧光标记或生物发光探针可以同时灌输到肺泡和评估。 （荧光灯和发光探针检测已被描述8，并且超出了本报告的范围）。到（使用X射线成像）一起，以检测荧光标记物的能力，共同登记肺流体的体积的能力是使用该动态测定和用于测定肺液体清除商业系统的几个优点之一。利用这种方法，用于确定间隙和相对的肺流体体积的其它好处包括进行纵向研究（因此降低达到统计学显著观测需要的动物的数量）的能力，并检测在自由呼吸的肺流体体积的微小变化的能力，麻醉，新生儿的乳鼠。使用的一个限制体内成像方法中，但是，是在麻醉可以改变气体和血流的肺中的分布。在通风和灌注（V / Q）和分流错配已显示在麻醉下，以增加在健康成年志愿者12，从而减少了身体的充氧。这种不利影响，但是，可以通过增加吸入氧浓度补偿。从技术观点来看，在X射线通量能量成像系统之间的变异性，可能需要之前执行成像研究每个系统的优化。例如，用更多的通量和/或具有优异的量子效率的检测器的X射线源的系统上，有较高的f /停止和评估在X射线阻抗小的变化时，低分级状态可能提供更好的图像质量。
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Disclosures
本文是关于多式联运临床前成像的特殊问题，布鲁克BIOSPIN赞助的一部分。
Materials
Name Company Catalog Number Comments Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO) Bruker; Billerica, MA Ketamine Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA 26637-411-01 Xylazine Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA 4821 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium) Lonza; Walkersville, MD 17-513F Sodium chloride Amresco; Solon, OH 241 Potassuim chloride Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ P217-3 Calcium chloride Sigma-Aldrich; St. Loius, MO C5080 HEPES Sigma-Aldrich; St. Loius, MO H3375 0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ 328438 References
Tags
医药，113期，新生儿肺，
