Introduction
Nästa generations sekvensering (NGS) of Clinical Oncology prover har blivit mer allmänt tillgängliga under de senaste åren som växande vetenskaplig litteratur pekar på vikten av att identifiera inriktnings genetiska förändringar och prediktiva / prognostiska molekylära markörer. Multi-gen panelen analyserar och hela exome sekvense studier i både epitelceller 1,2 och hematologiska maligniteter 3 har stelnat begreppet tumör heterogenitet och klonal utveckling som sjukdomen fortskrider och återfall. Dessutom, till skillnad från konkurrerande tekniker såsom polymerase chain reaction (PCR) eller Sanger-sekvensering, kan NGS identifiera de flesta genomiska förändringar i alla kliniskt relevanta cancergener i en enda analys 4.
Centrum för personlig diagnostik ursprungligen lanserades med två kliniska NGS paneler, en anpassad Hematologisk Panel (Heme-NGS Panelen) och en off-the-shelf Cancer Panel för FFPE prover (Solid-NGS Panel) (se Innehållet för Heme-NGS Panel härrör från flera källor, men kretsar kring 16 gener muterade i akut myeloisk leukemi (AML) som tidigare beskrivits som visar en hög nivå av klinisk användbarhet 5. Solid-NGS Panel tillverkas kommersiellt med de riktade regioner baserade på vanliga muterade gener i cancer som redovisas i katalogen av somatiska mutationer i cancer (COSMIC) databas 6. Flera viktiga steg karakterisera den totala arbetsflödet för kliniska NGS. Efter läkaren beställer testet bestämmer en patolog lämplighet provet efter analys för tumör procent och provvolym. I vår institution, kräver vi åtminstone 10% tumör på grund av bakgrundssekvense felprocenten ( "brus") av den teknik och effektivitet målinriktad strategi. Om vävnaden är tillräcklig för testning, är genomiskt DNA extraheras. Detta DNA utsätts därefter för kvalitetskontroll multipla (QC) steg. Om DNA passerar QC är en amplikon library genereras och sekvenserades. Den resulterande data analyseras genom ett internt bioinformatik pipeline. Efter bioinformatik analys, är varianter manuellt granskas och tolkas för patogenicitet före införlivande i en klinisk rapport. Nedan beskriver vi två fall som gick igenom denna rigorösa arbetsflöde och slutligen ledde till förändringar i klinisk behandling. Fall 1 - akut myeloisk leukemi En benmärgsbiopsi från patient A var diagnostisk för AML, utan mognad. Cytogenetiska studier sändes på benmärgs provet och visade en normal kvinnlig karyotyp. Det fanns 95% cirkulerande blast närvarande, så en perifert blodprov skickades för personlig diagnostiska tester på Heme-NGS Panelen. Akut myeloisk leukemi (AML) är en hematologisk malignitet av myeloid härkomst av vita blodkroppar. detekteringenav genmutationer i AML har blivit allt viktigare för prognos och behandling, med återkommande genmutationer anses vara viktiga i patogenesen och prognos 7. Mutationer i NPM1 och CEBPA har förknippats med en gynnsam prognostisk risk medan interna tandemdubbleringar (ITD) i FLT3 har förknippats med en mindre positivt resultat 8. En växande mängd bevis stöder en patogen roll för dessa och andra mutationer i AML 9. Fall 2 - lungadenokarcinom En biopsi av en vänster supraklavikulära massa från patient B visade lung adenocarcinom. Biopsimaterial från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) lymfkörtel massa sändes för genomisk test (Solid-NGS Panel) som rullar / lockar med mer än 50% tumör, för att avgöra om en mutation var närvarande för riktad terapeutisk intervention. Lung Cancer är den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet i USA och är uppdelad i två huvudtyper, icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och småcellig lungcancer (SCLC). NSCLC kan vidare definieras som antingen adenokarcinom eller skivepitelkarcinom, baserat på histologi av lesionen. Lungadenokarcinom är den vanligaste subtypen av lungcancer, sett i både rökare och icke-rökare, och är den vanligaste formen av lungcancer för icke-rökare 10. Molekylära studier av lung adenocarcinom har identifierat mutation i flera onkogener 11. De vanligaste förare mutationer som identifierats hos rökare är mutationer i KRAS och BRAF. De vanligaste mutationer i icke-rökare är mutationer i EGFR, och omarrangemang som omfattar generna ALK, RET och ROS1. Lungtumörer har beskrivits med en i-ram exon 20 insättning i genen ErbB2 (HER2 / neu). Den vanligaste abnormitet i HER2 / neu är en förstärkning av detta lokus i bröstcancer som en målinriktad terapi är tillgänglig (trastuzumab: en humaniserad monoklonal antikropp mot HER2 / neu). HER2 / neu exon 20 insättning som observeras i 2-4% av lung adenocarcimomas 12 har visat partiell respons på kombinationsbehandling med HER2 / neu och mTOR-hämmare (neratinib och temsirolimus, respektive) 13. 
Figur 1:. Förteckning över gener som omfattas av paneler Bibliotek förberedelse utförs med hjälp av antingen anpassade Hematologisk Panel (Heme-NGS panel) av 33 gener eller off-the-shelf Amplicon Cancer Panel (Solid-NGS) av 47 gener. Inte alla av de gener eller exoner täcks fullt ut, eftersom vissa amplikoner kan bara täcka vissa hotspots. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ A>
Protocol
Detta protokoll omfattar framträdande stegen två validerade laboratoriet utvecklat tester för genomisk profilering av fasta och flytande tumörer, respektive. Provningen utförs i laboratoriet sker i enlighet med kraven i det kliniska laboratoriet Förbättrings Ändringar (CLIA) från 1988.
1. DNA-extraktion från perifert blod eller benmärg
- Bestäm hur mycket blod eller benmärg att ta baserat på tabell 1.
| Prov / WBC | Belopp som skall behandlas som 1 ml blod |
| Benmärg | 250 | il |
| Blod WBC 12.000 - 50.000 | 1 ml |
| Blod WBC 50.000 - 100.000 | 500 ^ |
| Blod WBC 100.000 - 200.000 | 200 ^ </ Td> |
| Blod WBC> 200000 | 100 ^ |
| * För Blod WBC <12.000, ta 2 ml blod | |
Tabell 1:. Blod / Benmärg volym att använda diagram Eftersom vita blodkroppar kommer att variera från prov till prov, är det svårt att ange en specifik volym av blod att använda. Därför måste mängden blod som ska användas för analysen bestämmas genom att titta på vita blodkroppar (WBC) före start av analysen. Även om mindre blod används, bör det fortfarande behandlas som om dess 1 ml sedan volymen av blod som används reduceras eftersom antalet celler närvarande är större än normalt.
- Följ den kommersiellt tillgängligt kit protokoll för isolering av genomiskt DNA.
2. DNA-extraktion från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) Tissue
- Baserat påtumörområdet patologen inringad på H & E slide, rada upp de ofärgade glider med guiden H & E bild och beskriva ett liknande område för utvinning. För makro dissektion process endast ett exemplar / patientens uppsättning diabilder i taget.
- Värm glasen på en 45 ° C värmeblock att något smälta paraffin. Skrapa vävnaden inom de linjer som är markerade på bilden, med hjälp av en ny skalpell för varje prov som ska extraheras. Placera vax avskrap i den på lämpligt sätt märkt 1,5 ml rör. Var försiktig eftersom skrapade vaxet är mycket elektro och kan hoppa ut ur röret.
- Lägg 320 pl Avparaffinering lösning för varje fem till sex 5 um sektioner (25-30 um totalt). Till exempel om ett rör innehållande 3 delar av en 10 | j, m rulle / curl kommer att bearbetas och sedan använda 320 | j, l, men om 5 sektioner på samma tjocklek erhölls sedan använda 640 | j, l.
- Skaka kraftigt under minst 10 sekunder och utföra aquick snurra i en mikrocentrifug för att avlägsna vävnad / vax från sidorna och locket och in i lösningen. Inkubera vid 56 ° C under 3 min, och sedan inkubera vid RT i 5 -. 10 min.
- Efter RT inkubationen, till 180 pl av ATL-buffert för varje 320 | j, l av Avparaffinering Lösning sattes. Mala vävnaden tio gånger med användning av en steril minimortelstöt med hjälp av en ny mortelstöt för varje prov. Se till att det inte finns någon vävnad fastnat på mortelstöt, eftersom det kan vara mycket klibbiga. Vortex suspensionen kraftigt under 3 sekunder, sedan centrifugera vid maximal hastighet under 1 minut.
- Tillsätt 10 | il proteinas K till den nedre klara fasen. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner för att säkerställa att vävnaden återsuspenderas. Inte virvel. Inkubera vid 56 ° C över natten med skakning vid 400-500 rpm.
- Nästa morgon, kontrollera om vävnaden är helt upplöst (detta har inträffat om den nedre lösningen är klar). Om lägre lösningen inte är klar, sedan skaka kraftigt under 3 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet for 1 min. Lägg till en extra 5-10 il proteinas K och inkubera vid 56 ° C under ytterligare 30 till 60 minuter.
- Inkubera vid 90 ° C under 1 h för att bidra till att vända den formaldehydtvärbindning. Låt proven svalna till rumstemperatur under 5-10 min och därefter kort centrifugera varje rör för att konsolidera vätskan.
- Överföra den nedre klara fasen i ett märkt 1,5 ml rör. Om det finns flera rör från samma patientprovet (såsom fallet om flera rullar används), rekombinera de undre faserna i ett rör vid denna punkt. Obs: Överföra små mängder av Avparaffinering Lösningen ska inte störa reningsförfarandet, men det finns en risk om en stor mängd överförs.
- Tillsätt 2 pl av RNas A-lösning. Vortex försiktigt eller vänd 25 gånger och snabb dragning i en mikrocentrifug. Inkubera vid RT i 5 min.
- Tillsätt 200 pl av proteinutfällning Solution. Om att göra en eller två rullar, använda 200 l. Om att göra tre rulles på en gång, använd sedan 400 pl. Skaka kraftigt vid hög hastighet under 30 sek för att enhetligt blanda de lyseringsbuffertar. Inkubera på is under 5 min eller proverna kan stanna på is i upp till en timme.
- Centrifugera vid 5000 x g under 5 min. Det utfällda proteinet bör bilda en tät, vit pellet. Häll supernatanten i ett märkt 1,5 ml rör, och sedan inkubera proverna på is under åtminstone 3 min. Centrifugera vid 5000 xg under 3 min.
- Tillsätt 200 pl av 2-propanol (isopropanol) för varje 180 | il buffert ATL sattes tidigare till ett märkt 1,5 ml rör (det kan vara nödvändigt att använda en 2 ml rör). Till exempel om att göra tre rullar tillsätt 600 | il isopropanol. Tillsätt 1 pl glykogen för varje 180 pl buffert ATL lagt tidigare till isopropanol och invertera röret flera gånger för att blanda.
- Försiktigt supernatanten från proteinutfällning steget in i en blandning av isopropanol. Blanda röret genom att försiktigt vända dem åtminstone 50 gånger.
- Centrifugera vid maximal spBehov under 3 min. DNA: t kommer att vara synliga som små vita pellet på botten av röret.
- Häll eller aspirera bort supernatanten i rätt avfallsröret. Håll en separat 1,5 ml avfall rör för varje prov i fall pelleten kommer lösgjorts så att den inte försvinner eller blandas med avfall från andra prover. Dränera röret på en pappershandduk och säkerställa den största delen av Isopropanol avlägsnas.
- Tillsätt 300 pl nybakade 70% etanol. Invertera röret försiktigt flera gånger för att tvätta pelleten. Försök att se till att pelleten kommer rubbas för att säkerställa en mer noggrann rengöring.
- Centrifugera vid maximal hastighet under 5 min. och sedan försiktigt bort etanolen. Pelleten kan vara lös, så häll eller aspirera långsamt och titta på pelleten. Avlägsna överskott av etanol från insidan av röret, utan att röra pelleten. Låt proverna lufttorka under 5 - 15 min, var noga med att inte över torka provet.
- Lägg mellan 25-100 pl av DNA Hydra lösning till eACH prov baserat på storleken av DNA-pelleten och utgångsbeloppet för vävnad. Vortex rören kraftigt och kortfattat snurra i en mikrocentrifug. Inkubera under 1 h vid 65 ° C för att fullständigt rehydrera det DNA.
3. Genomisk DNA Kvalitetskontroll
Obs: Det finns tre oberoende steg för DNA kvalitetskontroll (QC). Se tabell 2 för ytterligare förklaring till varför varje QC utföres.
| Instrument | Resultat | Indikation | ideal Range |
| DropSense96 | A260 / A230 | Identifiering av kemiska föroreningar (t.ex. etanol) | 1,50-2,2 |
| DropSense96 | A260 / A280 | Identifiering av proteinkontaminanter | 1,60-2,2 |
| DropSense96 | Koncentration | DNA kvantifiering | > 1 ng / l |
| TapeStation | DNA Smear | Fastställande av DNA-integritet (t.ex. nedbrytning / fragmentering av extraherat DNA) | 50%> 1000 bp |
| kvantbiten 2,0 | Koncentration | Mer exakt DNA kvantifiering | > 1 ng / l |
Tabell 2:. DNA QC Förväntade resultat Alla dessa värden beaktas innan du kör tillåter ett prov för att gå vidare till att förbereda biblioteksstadiet.
- Att följa tillverkarens protokoll, kör 2 | il av det extraherade DNA på en fluorometer för att erhålla arbetskoncentrationen (ng / ^ il) av provet.
- Kör 1 - 2 pl av varje prov på en UV / VIS-spektrofotometer för att kontrollera kvaliteten på provet (A260 / A230 och A260 / A280 råttaios) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- För FFPE prover: Efter tillverkarens instruktioner, kör 1 pl av varje prov på en mikroflödes gel-elektroforessystem för att bedöma nedbrytning / fragmentering av DNA. Se figur 2 för exempel.
Figur 2:. Genomisk DNA QC Gel Exempel gröna linjen under de lägre banden är att indikera lägre markör. Den tillsatta-röd linje är att ange ungefär 1000 bp. Lane A2 representerar helt intakt DNA, som man skulle förvänta sig från färsk tis stämma (t.ex. perifert blod eller benmärg). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 är exempel på bra, intakt FFPE DNA. DNA i bana F2 verkar vara intakt, men en alltför låg koncentration. DNA i bana G2 försämras eller fragmenterad och fungerar inte i analysen. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 representerar DNA som faller i "gråzonen" betyder att analysen kan fungera bra, men en del av DNA kan också skadas eller tvärbunden och därför inte kommer att fungera väl i analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Amplicon Library Framställning
- Hybridisering av Oligo Pool och förlängnings-Ligering av bundna Oligos
- I Pre-PCR rum, lägga till den nödvändiga volymen av Low EDTA TE, 5 pl panelens Oligo Tube (t.ex. Solid-NGS Panelen eller Heme-NGS Panel), och 100-250 ng av genomiskt DNA till varje motsvarande brunn i en semi-kjolar 96 väl platta märkt som hybridisering (HYB) platta.
- Tillsätt 40 pl Oligo hybridisering för Sequencing Reagent 1 (OHS1) till varje prov i HYB plattan. pipett försiktigt upp och ned minst 5 - 6 gånger för att blanda. Ändra tips efter varje kolumn för att undvikakorskontaminering.
- Täta HYB plattan med självhäftande aluminiumfolie och centrifugera vid 1000 xg under 30 sek.
- Inkubera HYB plattan i den förvärmda hybridisering inkubator vid 95 ° C under 1 min. Ställ in temperaturen på hybridisering inkubator till 40 ° C. Fortsätta att inkubera så länge som det tar inkubatorn att minska från 95 ° C till 40 ° C (~ 90 min). Obs: Denna gradvisa kylningen är kritisk för korrekt hybridisering.
- Under de senaste 15 - 20 min av hybridisering inkubation, pre-tvätta filterplattan Unit (FPU). Förbered endast brunnarna som ska användas i den aktuella analysen, dvs endast använda färska / oanvända brunnar i en tidigare öppnad filterplatta, men aldrig återanvända brunnar som har använts. Obs: Det ska vara klar baserat på Satsnummer på filterplattan, markeringarna på filterplattan, och tätningsmedlet används över plattan.
- Med hjälp av en flerkanals pipett, tillsätt 45 pl Stringent Wash 1 (SW1) till varje brunn.
- Om kvarvarande vätska föreligger, rotera FPU 180 ° och upprepa centrifug steg igen för ytterligare tre minuter. Om den kvarvarande vätskan snurrar genom andra gången, sedan gå vidare till nästa steg, om inte så kan det finnas ett fel i filterplattan och den nuvarande plattan behöver bytas ut.
- Med hjälp av en flerkanals pipett, tillsätt 45 pl Stringent Wash 1 (SW1) till varje brunn.
- När väl hybridisering inkubator har svalnat till 40 ° C, centrifugera plattan vid 1000 x g under åtminstone 30 sek vid 20 ° C för uppsamling av kondens. Överför hela volymen av varje prov från HYB plattan mitt på motsvarande pre-tvättade brunnar i FPU. Ändra tips efter varje kolumn för att undvika korskontaminering. Täck FPU och centrifugera vid 2250 xg under 3 min vid 20 ° C.
- Tillsätt 45 pl av SW1 och centrifugera vid 2250 xg under 3 min vid 20 ° C. Upprepa för totalt två tvättar. Vrid FPU 180 ° och centrifugera igen vid 2250 xg under 3 min för att helt ta bort alla SW1.
- Isär FPU. Kasta alla genomströmning (innehållande formamid) i rätt avfallsbehållare. Sätt ihop FPU med en annan MIDI Waste Collection Plate. Tillsätt 45 pl av Universal Buffert 1 (UB1) till varje provbrunn och centrifugera vid 2250 xg under 3 min vid 20 ° C. VARNING: Innehåller formamid.
- Lägg 45 pl Extension ligeringsblandningen 3 (ELM3) till varje provbrunn på FPU plattan och pipett upp och ner 3 gånger för att blanda. Obs! Extension-Ligeringsreaktionen sker på filterplattan membranet.
- Täta FPU plattan med självhäftande aluminiumfolie och inkubera hela FPU enheten i en förvärmd 37 ° C inkubator under 45 minuter.
- Indexering och PCR-förstärkning
- Portion index som används till motsvarande brunnar i den indexerade Amplification Plåt (IAP) genom att arrangera primers i index Plate Fixtur, ordnade på följande sätt: i5 primer rör (vita mössor, klar lösning) vertikalt i linje med raderna A till H, i7 primer rör (orange lock, gul lösning) horisontellt , i linje med kolumnerna 1 till 12. med hjälp av en p10 multikanalpipett, tillsätt 4 ^ il av i7 primers (gul lösning) och varje rad i IAP och tillsätt 4 ^ il i5 primrar (klar lösning) till varje kolumn i IAP.
- På is eller ett kylblock, förbereda PCR Master Mix genom att tillsätta 0,5 pl DNA-polymeras 1 (TDP1) till 25 pl PCR Master Mix 2 (PMM2) per prov. Invertera, snabbt virvel, och kort centrifugera PCR Master Mix för att blanda.
- Lägg 22 | il av PCR Master Mix till varje brunn i IAP och pipettera upp och ner 3 gånger för att blanda. Ändra tips mellan brunnar. Håll IAP vid 4 ° C.
- Efter 45 min Extension-Ligeringsreaktionen (steg 4.1.10), ta bort FPU från inkubatorn och försiktigt bort aluminum folieförseglingen. Täck med locket och centrifugera vid 2250 xg under 3 min vid 20 ° C.
- Tillsätt 25 pl av 50 mM NaOH till varje provbrunn på FPU. Pipett upp och ner åtminstone 6 gånger; säkerställa pipettspetsarna kommer i kontakt med membranet. Ändra tips efter varje kolumn. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Överför prover eluerade från FPU till IAP enligt följande:
- Med användning av en p100 multikanalpipett inställd på 20 pl, pipettera NaOH på FPU plattan upp och ner åtminstone 6 gånger. Något luta FPU plattan för att säkerställa fullständig aspiration av plattan.
- Transfer 20 pl från FPU till motsvarande kolumn av IAP. pipett försiktigt upp och ner åtminstone sex gånger för att noggrant kombinera DNA med PCR Master Mix. Försegla IAP med självhäftande film och centrifugera vid 1000 xg under 1 min vid 20 ° C.
- Ta PCR-plattan i Post-PCR Room och ladda plattan på en termisk cykler. Kör PCR program bestående av ett värmedenatureringssteg vid 95 ° C under 3 min; följt av 25 cykler av 95 ° C under 30 sek, 62 ° C under 30 sek, 72 ° C under 60 sek; följt av en slutlig förlängning av 72 ° C under 5 min; slutbehandling med en uppehåll vid 10 ° C. Om inte går vidare till nästa steg efter fullbordandet av PCR kan plattan förbli på termocyklern över natten, eller den kan lagras vid 2 till 8 ° C i upp till två dagar.
- PCR Purification och Bead-Baserat Normalisering
- Avlägsna de magnetiska renings pärlor, elueringsbuffert (EBT), och gel-elektroforesreagens från 4 ° C kylskåp och plats vid RT minst 20 min innan nästa steg.
- När väl PCR är fullständig, att centrifugera vid 1000 xg under 1 min vid 20 ° C samla kondens. Överför 1 pl av varje PCR-reaktion för att tömma rör / plattbrunnar innehållande 4 pl av vatten för att späda proverna 1/5. Pipettera upp och ned för att blanda.
- Tillsätt 2 | il av denutspädd PCRed prover till 2 pl mikroflödes-gel buffert. Täta remsor / platta. Skaka vid 1800 varv per minut under minst 30 sek och centrifugera vid 1000 xg under 30 sek. Efter tillverkarens protokoll, köra blandningen på en mikroflödes gel för att bedöma om biblioteket preparatet gav en acceptabel bibliotek (se figur 3).
- Vortex de magnetiska renings pärlorna tills de är väl upphängd och färgen verkar homogen. Tillsätt 45 pl av pärlorna till varje prov.
- Förslut plattan med klar klisterfilm och skaka plattan vid 1800 rpm under 2 min. Inkubera vid rumstemperatur utan skakning under 10 min.
- Placera plattan på en magnetiskt stativ. När supernatanten har försvunnit, försiktigt bort och kassera supernatanten. Om några Pärlorna oavsiktligt aspireras in spetsarna, dispensera pärlorna tillbaka till plattan och låt plattan vila på magneten i 2 min och bekräftar att supernatanten har försvunnit.
- Med plattan på than magnetisk monter, tillsätt 200 pl nyframställd 80% etanol till varje provbrunn. Förflytta plattan fram och tillbaka några gånger. Inkubera plattan på den magnetiska stativ för 30 sek. Försiktigt bort och kassera supernatanten. Upprepa för totalt två tvättar.
- Avlägsna överskott av etanol genom att kort centrifugering av plattan vid 1000 xg för att driva ner någon etanol på röret sidor, placera plattan tillbaka på den magnetiska monter, och med hjälp av en p10 multikanalpipett inställd på 10 ul för att avlägsna etanolen. Tillåta pärlorna lufttorka för 5-8 min.
- Med användning av en p100 multikanalpipett, tillsätt 30 pl EBT till varje brunn. Pipettera upp och ner några gånger för att säkerställa pärlorna lossna den sida av röret. Förslut plattan med klar klisterfilm och skaka plattan vid 1800 rpm under 2 min.
- Inkubera vid rumstemperatur utan skakning under 3 min. Om det finns prover i vilka pärlorna inte är fullständigt återsuspenderade försiktigt pipettera upp och ner för att resuspendera kulorna.
- Placera plattan på en magnetisk stativ. Med hjälp av en P100 flerkanals pipett 20 ul av supernatanten till en helt ny platta som kallas biblioteket Normalisering Plate (LNP). Överför återstående ~ 10 | il av de individuella sekvense bibliotek till en separat platta kallas återstående Städat Library Plate (RCLP). Lagra denna platta tillsammans med den slutliga biblioteket prep, eftersom den kan användas som en reserv för en andra sekvenseringskörning, om det behövs. Om inte gå vidare till nästa steg, kan LNP och RCLP förvaras vid -15 till -25 ° C.
- Kraftfullt virvel och suspendera biblioteket normaliserings pärlor 1 (LNB1). Det är kritiskt att helt resuspendera LNB1 pärlpelleten på botten av röret. Förbered Normalisering Mix, genom att blanda 8 pl LNB1 med 44 pl Library Normalisering Tillsatser en (LNA1) per prov. Kraftfullt virvel Normalisering Mix för 10-20 sekunder.
VARNING: LNA1 innehåller formamid. - Med intermittent inversion ennd virvling av normalisering Mix, tillsätt 45 pl till varje prov av LNP. Förslut plattan med klar klisterfilm och skaka plattan vid 1800 rpm under 30 min. Denna 30 min inkubation är kritisk för korrekt bibliotek normalisering som inkubationer av större eller mindre än 30 minuter kan påverka biblioteks representation och klusterdensitet.
- Under 30 minuters inkubation, förbereda reagens för sekvensering genom upptining reagenspatronen och Hyb buffert (HT1) [VARNING: Båda innehåller formamid]. Dessutom får is under ett senare steg och säkerställer ett värmeblock lämplig för 1,5 ml centrifugrör är inställd på 96 ° C.
- När 30 min blandningssteget är komplett, placera LNP på en magnetisk stativ. När supernatanten har försvunnit, använd en flerkanals pipett för att försiktigt ta bort och kassera supernatanten i lämplig avfallsbehållare.
- Ta LNP från magnet stativet och tvätta pärlor med bibliotek Normalisering Tvätta en (LNW1) enligt följande:
- lägg 45il av LNW1 till varje provbrunn.
VARNING: Innehåller formamid. Förslut plattan med klar klisterfilm och skaka plattan vid 1800 rpm under 5 min. Upprepa för totalt två tvättar. Se till att avlägsna allt LNW1 efter den andra tvättningen.
- lägg 45il av LNW1 till varje provbrunn.
- Avlägsna LNP från magnet stativet och, med hjälp av en flerkanals pipett, tillsätt 30 pl 0,1 N NaOH (mindre än en vecka gammal) till varje brunn för att eluera provet. Förslut plattan med klar klisterfilm och skaka plattan vid 1800 rpm under 5 min.
- Under 5 min eluering, tillsätt 30 pl Bibliotek Normalisering förrådsbuffert 1 (LNS1) till varje brunn för att användas i en ny platta som namnges den lagringsplattan (SGP).
- Placera LNP på den magnetiska monter. När supernatanten har försvunnit, överföra 30 pl elueringen till LNS1 i stabilitets- och tillväxtpakten. Ändra tips mellan prover för att undvika korskontaminering.
- Förslut plattan med självhäftande film och centrifugera vid 1000 xg under åtminstone 30 sek.
- tillsätt 51; l av varje prov som skall sekvenseras till en märkt Pooled Amplicon Library (PAL) 1,5 ml rör. Virvel PAL att blanda och kortfattat spinn ner i en mikrocentrifug.
- Beroende på vad sekvense kemi som används (V2 eller V3) tillsätt 4 - 10 pl av PAL till 590 - 596 pl HT1. I allmänhet till 5,8 pl PAL till 595 pl HT1 för V2 kemi och 8,5 pl PAL till 592 pl HT1 för V3 kemi. Märk detta rör som Utspädd Amplicon Library (DAL) rör.
- Virvel DAL och kortfattat spinn ner i en mikrocentrifug. Inkubera DAL vid 96 ° C under 2 min. Vänd DAL röret 3 gånger och sätta DAL på is under åtminstone 5 minuter, medan du förbereder sequencer för sekvensering. Efter 5 min, är DAL redo att lastas.
- Om klar med stabilitets- och tillväxtpakten, försegla plattan med självhäftande aluminiumfolie film och märk den med datum och plattan ID. Lagra den förseglade SGP och PAL vid -15 till -25 ° C.
Figur 3:. Bibliotek Prep QC Gel Exempel gröna linjen under de lägre banden är att ange lägre markör och den lila linjen under de övre banden är att ange högre markör. Allt fungerade bra för banorna H1, A2, B2, C2, E2, och G2. Biblioteket prep fungerade inte optimalt för körfält D2, F2 och H2, men resultaten kommer fortfarande erhållas de bara inte kan ha tillräcklig täckning. För A3, biblioteket prep knappt arbetade och troligen denna DNA-provet var inte tillräckligt för analysen. De lägre banden ovanför nedre markör är de oanvända primrar, eftersom den alikvot tas direkt från PCRed väl. NTC prov endast ha oanvänd primer bandet och inget annat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Sekvensering
- Säkerställa en korrekt SampleSheet.csv har gjorts för körningen. Se Kompletterande Figur 1 för ett exempel.
- Skölj och torka flödescellen och tillsätt 600 pl av DAL till tinade reagenspatronen.
- Förbered sequencer för sekvensering genom att följa anvisningarna på skärmen.
6. Dataanalys
- Utför bioinformatik pipeline. Utnyttja internt, specialdesignad bioinformatisk rörledning för att identifiera mutationer, infogningar, borttagningar och förstärkningar 18.
- När rörledningen har avslutats, kontrollera loggfiler för fel / varning, som någon betydande fel / varningar stöd i QC av rörledningen bearbetning.
- Analysera statistiken körnings (tabell 3) för att säkerställa att sekvens biblioteket har passerat labbet bestäms QC mätvärden (Figur 4). Manuellt granska varje variant genom att visa .bam filer i en genomisk uppgifter betraktare (t.ex. integrativ Genomics Viewer 16 (IGV)).
OBS: Endast de varianter inom den validerade allelen-frekvensområde och över minimidjup täckning efter kvalitet filtrering rapporteras (med Human Genome Variation Societys (lastbilar) nomenklatur). För slutrapportering, var varje exonic variant kategoriseras i: patogen, förmodligen sjukdom associerad, variant av okänd signifikans (VUS), sannolikt godartade och godartade. Alla varianter ovanför rapporteringskriterierna av 5% allel frekvens, som inte har blivit godartade varianter och synonyma förändringar rapporterades.
Figur 4. Översikt för kvalitetskontroll steg för NGS. Kvalitetskontroll av varje steg i processen är nödvändigt för att säkerställa sekvense kommer att ge resultat så att före och efter sekvense mått beaktas. Lämplig prov behandling är nödvändig för hög kvalitet DNA. blodet ochbenmärg i olämpliga fixativ kan ge låg kvalitet DNA. Olämpligt fixering av fasta tumörprover kan försämra DNA (t.ex. fixering i B5). DNA-kvalitet bör bedömas för protein och föroreningar RNA genom spektrofotometriska medel och noggrant utvärderas för mängden och integritet DNA. Sekvens mätvärden måste bestämmas empiriskt i sekvense laboratorium och följas för varje sekvenseringsreaktion och varje prov. Före rapportera sekvense resultat för varje prov ska bedömas för täckning, djup och tillräcklig prestanda för positiva och negativa kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Fall 1 - Heme-NGS Panel
DNA extraheras från leukemi perifert blod var tillräcklig kvalitet och kvantitet (176 ng / l) för Heme-NGS Panelen. Den genomsnittliga djup täckning var 4,933x (över den lägsta medeldjup av täckning av 1,000x). Ytterligare kör statistik i tabell 3. Av de 8 regioner under 250x täckning, tre var på grund av felaktig trimning av primers (dvs var primersekvensen inte korrekt bort på grund av sekvens fel), en var en känd artefakt av analysen, och andra fyra var delvis regioner exoner av olika gener utan rapporterbara varianter. Även om vår kliniska protokoll endast omfattar rapportering varianter som omfattas av minst 250 läser, läser alla data med åtminstone 100 importeras till databasen för granskning.
Databehandling fROM bioinformatik pipeline upptäckt tre rapporterbara, sjukdomsassocierade mutationer; en missense-mutation i FLT3, en missense-mutation i IDH2 och en ramskiftsmutation i NPM1. De exonic varianter med sina allelfrekvensema beskrivs i tabell 4. En vanlig mutation i FLT3 är FLT3 -Intern tandemduplicering (ITD) som inte automatiskt kallas av vår pipeline och kräver en visuell inspektion av exon 14. Visuell inspektion av exon 14 av FLT3 visade ingen insättning eller dubbel i de inlämnade provet. FLT3 I836del var vid 1% allelen frekvens och ingick inte i slutrapporten, eftersom det föll under den godkända minimi allelen frekvens på 5%. Denna mutation är inte på samma DNA-molekyl som FLT3 D835Y förändring (dvs observerats i samma amplikon region, men inte i "cis" i någon av sekvensering läser) och det observerades endast genom manuell granskning av .bam files vid kontroll av p.D835Y förändring. De lägre allel frekvenser av de två FLT3-mutationer tyder dessa mutationer kan representera heterogenitet och / eller klon utveckling; dock kan skillnaden bero på analysens prestanda för att amplikon eller en enbaspolymorfi (SNP) nära eller överlappande primersekvensen som påverkade förstärkningen av denna allel.
Heme-NGS Panel resultat mål 1 med AML identifierat mutationer i FLT3, IDH2 och NPM1 är tre vanliga muterade gener i AML. Mutationer i FLT3 observerats i ~ 25% av vuxna patienter med AML (COSMIC databas 17) och är antingen inre tandem dupliceringar (ITD) eller missense mutationer i tyrosinkinasdomänen. Flt3-ITD är de vanligare mutationen och är associerade med dålig respons på standardkemoterapi, medan den prognostiska signifikansen av FLT3-kinas domain punktmutationer, som sett i denna AML patient har en oklar inverkan på prognosen 14. Isocitratdehydrogenas 2 (NADP +), mitokondrie (IDH2) är en gen som kodar för en epigenetisk modifierings som ofta är muterad i AML. Mutationer i epigenetiska modifierings är relativt vanliga i AML, med mutationer i IDH1 och DNMT3A representerar andra mutationer i denna klass av gener som leder till gen dysreglering. Mutationer i genen för nukleofosmin (NPM1) är en av de vanligaste förvärvade mutationer i AML och är allmänt ansedda att vara en bra prognostisk faktor (i frånvaro av en FLT3 - ITD).
Co-mutationer av NPM1 och IDH2 har beskrivits i litteraturen som en gynnsam prognostisk indikator 5, med en 3-års total överlevnad av 89%. Detta representerar en signifikant överlevnadsfördel i jämförelse med den totala 3-års överlevnadvild typ NPM1 och IDH2 31%. Till exempel, standardvårdpraxis omfattar mutationsanalys för NPM en och FLT3-ITD-mutationer. I detta scenario skulle upptäckten av endast en NPM1 mutation inte lämpligt stratify patienten för risk, eftersom de sekundära mutationer kan vara gynnsam (t ex IDH2) eller ogynnsamma (t.ex. TET2), minskar förtroendet för att lindra en benmärgstransplantation.
Fall 2 - Solid-NGS Panel
DNA extraherat från FFPE vävnaden var tillräcklig kvalitet och kvantitet för Solid-NGS Panelen med en koncentration av 252 ng / l och endast 4% av DNA under 1000 baspar (bp). Efter dataanalys medeldjupet täckning var 9167 läser (väl över vår minsta djup cutoff av 1000 läser) utan regioner under 250 läs djup. Ytterligare QC mätvärden är shown i tabell 3.
Uppgifter som behandlas genom bioinformatik pipeline upptäckt två sjukdomsassocierade mutationer: en i-ram införande i exon 20 av ErbB2 (HER2 / neu) och en missense-mutation i TP53. Alla exonic varianter med sina allel frekvenser representeras i tabell 5. Införandet i ErbB2 representerar faktiskt en tandem dupliceras (HER2 / neu) sekvens, vilket återspeglas i nomenklaturen. Identifiering och bekräftelse av in-frame insättning krävs manuell granskning av sekvense läser igenom IGV. Detekteringen av mutationsfrekvenser som är större än 50%, vilket kan ses för både TP53 och Her2 / neu mutationer tyder på en förlust av heterozygositet (LOH) händelse (se diskussion).
Fast-NGS Panel resultat mål 2 med lungadenokarcinom upptäckts mutationer in ErbB2 (HER2 / neu) och TP53, inte två gener som vanligen testas för som en del av den nuvarande standarden-of-care för lungcancerpatienter. HER2 / neu kodar en tyrosinkinasreceptor som liknar en annan allmänt muterade genen i lungcancer, EGFR . Aktivera HER2 / neu exon 20 insättningar observeras i 2-4% av lung adenokarcinom, står för merparten av HER2 / neu mutationer som observerats i lungcancer, och är vanligtvis ses i tumörer utan mutationer i andra förar gener, såsom EGFR och ALK 12 . Det finns flera rader av bevis potential för olika behandlingsalternativ för patienter med aktivering HER2 / neu insättningar, inklusive partiellt svar på kombinationsbehandling med HER2 / neu och mTOR-hämmare 13 och betydande sjukdomskontroll med den monoklonala antikroppen Trastuzumab i kombination med kemoterapi 15. Upptäcka en TP53 förändring är inte uncommon i cancer, men vid denna tid finns det inga genomförbara terapier.
| fall en | fall 2 | |
| Totala Start Läser | 2215926 | 2129110 |
| Procent av Läser Mapping | 98,42% | 98,29% |
| Andel av Läser på Target | 99,01% | 97,29% |
| Andel av Läser på mål efter filter | 97,60% | 95,45% |
| Andel av Användbart Läser | 94,87% | 91,79% |
| Andel av baser över 250x Täckning | 98,40% | 100% |
| Andel av baserna ABove 1000x Täckning | 95,90% | 99,70% |
| Täckning Nedan 250x - Amplicon Antal | 8 | 0 |
Tabell 3:. Sekvenseringskörning QC Metrics Detta är en sammanfattning av de viktigaste köra statistik, exklusive medel täckning, som används för granskning av data för att avgöra om ett bibliotek prep prov har passerat QC. Hela processen är framgångsrik om alla procenttal är över 90%, men det är möjligt med överföring av SW1 eller UB1 i FPU tvättningssteget eller primer överhörning, att ha lägre "Procent på Target" i storleksordningen 80 - 90%. Om "Procent Mapped" är för låg, skulle det tyda på en kontaminering av bakterier eller andra DNA, som alla prover bör anpassa till människa. När någon av dessa specifikationer är under 80%, provet flaggas för ytterligare granskning för att avgöra hur man proceed och förbättra processen.
Tabell 4:.. Mål 1 Resultat upptäcks patogena, sjukdom associerad, variant av okänd signifikans (VUS), och sannolikt godartade exonic varianter ovanför rapporteringskriterierna av 5% allel frekvens listas Klicka här för att ladda ned den här tabellen.
Tabell 5:.. Mål 2 resultat upptäcks patogen, sjukdom associerad, variant av okänd signifikans (VUS), och sannolikt godartade exonic varianter ovanför rapporteringskriterierna av 5% allel frekvens listas Klicka här för att ladda ner tabell.
Kompletterande Figur 1: Ett exempel på en amplikon-baserad SampleSheet.csv. Detta ark förmedlar till sequencer vad kemi för att köra (i detta fall Amplicon), vilken arbetsflöde (t.ex. GenerateFastq), vilket program och analys (t.ex. FastqOnly), hur många baser (eller läser) till sekvens (i detta fall 186 bp x 186 bp), och slutligen vad proven är förknippade med vissa index (i detta fall dubbla indexering). De delar som är markerade i gult kan ändras till vad försöksledaren vill, men i det här fallet labbet använder dessa parametrar. Klicka här för att ladda ned den här figuren.
Discussion
Eftersom de två NGS tester som beskrivs i detta manuskript erbjuds kliniskt, är den viktigaste praktiska övervägande kvalitetskontroll. Specifikt måste nära hänsyn tas till kvaliteten och kvantiteten av extraherat DNA. Detta är särskilt viktigt för FFPE prover som ofta starkt nedbrutet med variabel DNA avkastning. En isopropanolutfällning metod utvecklades för att maximera DNA utbyte från FFPE prover såsom kolonnbaserade metoder befanns ibland leda till DNA-klippning med begränsade elueringsvolymer. Därför är de flesta av den tid då ett prov ger alltför låg koncentration eller är alltför förstörd för analysen, är det mest troligt på grund av vävnads storlek, typ, eller fixering och inte utvinningsprocessen. För blod / benmärgsprover, om det finns ett utdrag fel, är det oftast på grund av att ett prov är hemodilute (dvs inte har tillräckligt antal vita blod eller tumörceller i det oavgjort) eller cellgifter avlägsnas.
. Nt "> Under validering, bör inrättas cutoffs för acceptans av DNA-kvalitet och kvantitet Den rekommenderade ingång 100-250 ng används ofta i analysen, men om DNA-kvaliteten är bra, då lägre ingångs mängder kan vara framgångsrik. Dessutom, om DNA-kvaliteten är dålig (dvs., är mängden av amplifierbara DNA mindre än 100 till 250 ng) då högre mängder ingångs kan förbättra kvaliteten på sekvenseringsresultaten (eftersom mängden amplifierbara DNA kommer att nå den rekommenderade ingång) . Metrics för DNA-kvalitet och kvantitet bör tillämpas på varje prov innan avancera DNA i biblioteket förberedelse. Dessa prover i en "gråzon" (se figur 2) ska köras vid bedömning av laboratoriechefen eller utsedd. för närvarande det bästa sätt att förutsäga om DNA inte kommer att fungera väl under sekvensering är att utföra en qPCR baserad analys som gör det möjligt för kvantifiering och kvalitetsbedömning av ingångs DNA. Detta tillvägagångssätt behandlar bioavailabbilitet av olika stora fragment i provet, genom amplifiering av olika stora fragment (t.ex. 100 bp, 150 bp, 200 bp och 300 bp) och jämförelser utbyte.För närvarande, bibliotek förberedelse innebär ett stort antal manuella steg där en felsteg på en av flera tidpunkter kan orsaka biblioteket för att antingen misslyckas eller vara av dålig kvalitet. Den mikroflödes gelanalys är den enda QC steg för att kontrollera ett bibliotek prep fråga innan sekvensering. Följaktligen finns det flera viktiga steg där extra mindfulness kan öka sannolikheten för en framgångsrik reaktion. Det är absolut nödvändigt för att garantera den korrekta provet och oligonukleotid pool användes för varje prov. Säkerställa och korrekt inspelning att varje prov innehåller en av 96 unika kombinationer av dubbla index PCR primerpar minskar risken för ett prov blandning upp. Dessutom är det viktigt att se till filterplattan (FPU) dränerar korrekt; om den inte dränera lämpligt detta kan orsaka att Technsion-ligeringssteget av biblioteket förberedelse för att utföra suboptimalt och leda till dålig kvalitet sekvenseringsdata. Efter biblioteks QC, är det viktigt att se till att de LNB1 pärlorna fullständigt återsuspenderas och att LNB1 / LNA1 lösningen blandas väl innan den läggs till proverna som koncentrationen av denna blandning används för att bestämma molariteten av biblioteket. Slutligen, om pärlan elueringssteget leder till en suboptimal mängd bibliotek eluering av pärlorna det kommer att minska klusterdensitet och möjligen orsaka biblioteket för att inte få tillräcklig genomsnittlig täckning. Omvänt kommer ett överskott av bibliotek leda till sämre kvalitet läser. Därför är det viktigt att vara konsekvent i pärlan baserade normalisering steg för att säkerställa en optimal sammanslagning och klustring av biblioteken på sequencer.
Förutom bibliotek förberedelse, är det viktigt att validera en bioinformatik pipeline som kommer att ge korrekta mutations samtal från den råa, de-multiplexering fastq filer. Att välja enanpassad lösning kan vara tidskrävande eftersom det finns många open source och kommersiellt tillgängliga Skenorna, variant ringer och NGS programpaket som man skulle behöva gå igenom. Anpassade algoritmer måste vara utformade för att extrahera viktiga resultatstatistik, identifiera unika återkommande mutationer som gäckat mest open source-verktyg, och bestämma antalet kopior status över varje loci. Under valideringsprocessen av en bioinformatik pipeline, är det viktigt att fastställa de rapporterings cutoffs för varianter som uppfyller eller överträffar både ett djup på minst täckning efter kvalitet filtrering (t.ex. minst 250 läsningar) och en minimi allel frekvens (t.ex. 4 %). Eftersom detta är en multiplex amplikon-baserad analys, är det viktigt att bestämma den minsta medeldjup av täckning (t.ex. 1,000x) att biblioteket måste uppnå för att kunna få den utförande amplikon lägsta till minsta djup läser. Dessutom den multiplexerade analysens natur gör cause av mål effekter och dessa "artefakter" måste upptäckas och helt kontrollerats innan lansering. En annan viktig begränsning till den beskrivna analysen är ett behov av prover för att innehålla mer än 10% tumör i syfte att uppnå den validerade minimi allelfrekvensen.
Detekteringen av låg frekvens, 1%, FLT3 infogningar finns bevis för att manuell granskning fortfarande är önskvärt i denna process. Även med en allel frekvens cut-off på 5%, några viktiga mutationer kanske missade och därmed manuell granskning kommer att vara avgörande för att fastställa dessa varianter. För FLT3-ITD är visuell inspektion av exon 14 utfördes för alla AML-patienter för att säkerställa en låg nivå eller stor insättning / dubbel inte gå obemärkt förbi. Dessutom HER2 exon 20 insättningar som är allmänt intill primersekvensen behöver manuellt ingripande. Trots att en robust bioinformatik rörledning, kan vissa varianter gå förbises vilket är precis den typ av har en hård snittoff för de flesta statistik som nämns ovan. Bättre bioinformatik skulle behövas för att lindra detta problem, liksom bättre biblioteks beredning och / eller sekvensering metoder, eftersom det är mer fördelaktigt att ha data av god kvalitet vid ännu lägre cutoffs som innehåller färre artefakter och falska positiva.
Detektering och tolkning av allelfrekvenser kan vara svårt på grund av svårigheten i tumör procentuell bestämning och amplifiering förspänningen hos vissa regioner av genomet. Dessutom kan allelfrekvenser över 50% detekteras, såsom observeras i fallet 2. Detta tolkas som en förlust av heterozygositet (LOH) händelse, antingen på grund av förlust av den normala allelen, vilket leder till den uppenbara ökningen av mutant läser, en förstärkningen för den mutanta allelen (t.ex., 2-mutant och en normal kopia) eller andra mekanismer. Dessa mekanismer kan belysas genom utnyttjande array jämförande genomisk hybridisering (aCGH 19) och / eller en SNP genotyping array. 20.
De nuvarande mål anrikningsmetoder förlitar sig på heldags förfaranden för antingen ineffektiva hybrid capture eller multiplexerade PCR-tekniker som resulterar i att det behövs mer sekvense täckning av ett enda prov och mer utanför mål sekvense läser. Ytterligare applikationer för NGS molekylär onkologi förväntas inom en snar framtid kommer att omfatta lättare biblioteksframställningsmetoder som kan vara helt automatiserade och kunna bearbeta prover med mycket små mängder av input-DNA (dvs mindre än 1 ng) samt prover med mycket försämras DNA. För att möta dessa utmaningar, kommer de flesta metoder förmodligen vara PCR-baserad, antingen är en flerstegs PCR strategi eller ett massivt parallella singleplex PCR strategi. Dessutom har molekylstreckkodning av individuella amplikoner visats dramatiskt minska bakgrundssekvense buller och kommer att möjliggöra testning av prover med lägre proportioner av tumörceller för att uppnå lägre allelfrekvensema och gå mot fånga circulating tumörceller.
Detektion av sjukdomsassocierade mutationer i cancerprover har varit standardbehandling för årtionden. Historiskt sett gener ofta testas sekventiellt, en gen / exon i taget, med identifiering av en mutation som leder till slutet av testsekvens. Tillkomsten av NGS har möjliggjort en mindre partisk inställning till sekvense flera gener associerade med många cancerformer parallellt leder till identifiering av flera mutationer som är förknippade med neoplasi. Den kliniska användbarheten av NGS för detektion av somatiska mutationer vid cancer är allt tydligare. I själva verket, NGS baserad analys av tumörprover representerar ett nytt paradigm som utmanar traditionell, enkel gentestning, men den kliniska nyttan är mycket tydlig. Kliniska laboratorier idag har spännande möjlighet att gifta noggrann metodvalidering och testa tolkning med tillämpningen av denna kraftfulla teknik.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för den hjälp av Daniel Wild för läsning av manuskriptet och hjälp i produktionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5365 | |
| Genomic DNA Reagents | Agilent Technology | 5067-5366 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technology | 5067-5585 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technology | G2965A | |
| TapeStation Analysis Software | Agilent Technology | A.01.04 or higher | |
| 96-well Tube Storage Racks | Any Vendor | ||
| 15/50 ml Tube Rack | Any Vendor | ||
| 96-well Plate Rack | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 0.5–2.5 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 1–10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 2–20 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 10–100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 20–200 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 100–1,000 μl | Any Vendor | ||
| Serological Pipettor | Any Vendor | ||
| Vortexer | Any Vendor | ||
| Ice bucket | Any Vendor | ||
| Microcentrifuge (for tubes and strip tubes) | Any Vendor | ||
| Freezer, -20 °C | Any Vendor | ||
| 4 °C Refrigerator | Any Vendor | ||
| Water or Bead Bath | Any Vendor | ||
| Incubator (37 °C) | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 1 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 5 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 10 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 25 ml | Any Vendor | ||
| Gloves | Any Vendor | ||
| Razor Blades/Scaples | Any Vendor | ||
| KimWipes | Any Vendor | ||
| 15 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| 50 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| Paper Towels | Any Vendor | ||
| 200 proof Ethanol | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 25 ml Reservoirs | Any Vendor | ||
| 10 N NaOH | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 1 – 10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 10 – 100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 20 – 300 μl | Any Vendor | ||
| Ice Bucket | Any Vendor | ||
| Water Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Alcohol Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Lens Cleaning Paper | Any Vendor | ||
| Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted | Any Vendor | ||
| Tube strips, 8-well, 0.2 ml | Any Vendor | ||
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| BioShake IQ or 3000-T elm | Bulldog Bio/Q.Instruments | 1808-0506/ 1808-0517 | |
| DropPlate96 S - LabChipDS | Caliper | 128876 | |
| DropPlate96 D - LabChipDS | Caliper | 132848 | |
| DropSense96 | Caliper (Trinean) | ||
| DropQuant Software | Caliper (Trinean) | ||
| Plate Sealing Film | Denville | B1212-5S | |
| Aluminum Seal Foil | Denville | B1212-6S | |
| Nuclease-Free, Pure Water System | EMD Millipore | ||
| 5424 centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 | Both 15 ml tube and plate rotators, preferably a centrifuge that can go up to 2,500 x g. |
| Safe-Lock Tube 1.5 ml, Natural | Eppendorf | 22431021 | |
| 5 ml Tube, DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108310 | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 022620645 | Any plate rotator centrifuge will work |
| Hybex Microsample Incubator | Fisher Scientific | 1057-30-0 | |
| Hybex 0.2 ml Tube Block | Fisher Scientific | 1057-31-0 | |
| TruSeq Amplicon – Cancer Panel | Illumina | FC-130-1008 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon | Illumina | PE-940-1011 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon Index Kit | Illumina | FC-130-1003 | 96 Indices, 384 Samples |
| MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles | Illumina | MS-102-2003 | |
| Experiment Manager | Illumina | 1.3 or higher | |
| MiSeq Reporter | Illumina | 2.0 or higher | |
| Sequencing Analysis Viewer | Illumina | 1.8 or higher | |
| TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit | Illumina | FC-130-1007 | |
| MiSeq v2 | Illumina | SY-410-1003 | |
| TruSeq Custom Amplicon Filter Plate | Illumina | FC-130-1006 | |
| Index Adapter Replacement Caps | Illumina | 11294657 | |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit 0.5 ml Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | |
| DynaMa6-96 Magnetic Stand, Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | |
| GeneAmp PCR System 9700 (gold/silver block) | Life Technologies | N8050200 | |
| Gentra Puregene Blood Kit | Qiagen | 158489 | |
| Deparaffinization Solution (16 ml) | Qiagen | 19093 | |
| Buffer ATL (4 x 50ml) | Qiagen | 939011 | |
| Protein Precipitation Solution (50 ml) | Qiagen | 158910 | |
| DNA Hydration Solution (100 ml) | Qiagen | 158914 | |
| Glycogen Solution (500 μl) | Qiagen | 158930 | |
| Qiagen Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| Rnase (5 ml) | Qiagen | 158924 | |
| Nuclease-Free Water (10 x 50 ml) | Qiagen | 129114 | |
| Pestles | USA Scientific | 1415-5390 | |
| TipOne RPT 10 µl elongated filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips). | USA Scientific | 1180-3810 | |
| TipOne RPT 100 µl natural, beveled filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1840 | |
| TipOne RPT 200 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-8810 | |
| TipOne RPT 20 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1810 | |
| TipOne RPT 1,000 μl natural, graduated XL filter pipet tips in | USA Scientific | 1182-1830 |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Campbell, P. J., et al. The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).
- Frampton, G. M., et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).
- Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).
- Forbes, S. A., et al. COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).
- Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies. Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).
- Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use. Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).
- Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. Molecular genetics in acute myeloid leukemia. Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).
- Subramanian, J., Govindan, R. Lung cancer in "Never-smokers": a unique entity. Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).
- Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma. Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).
- Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).
- Gandhi, L., et al. Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors. J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).
- Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients. Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).
- Mazières, J., et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).
- Robinson, J. T., et al.
- Forbes, S. A., et al. COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).
- Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets. Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).
- Haraksingh, R. R., et al. Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms. PLoS ONE. 6 (11), e27859 (2011).
- de Leeuw, N., et al. SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control. Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).
