Summary
Comet assay mäter DNA-brott, som framkallas av olika faktorer. Om alla faktorer (utom oxidativ stress) som orsakar DNA-skador hålls konstanta, är mängden DNA-skador en god indirekt parameter för oxidativ stress. Målet med detta protokoll är att använda komet analys för indirekt mätning av oxidativ stress.
Abstract
Högre eukaryota organismer inte kan leva utan syre; men paradoxalt nog, kan syre vara skadligt för dem. Syremolekylen är kemiskt relativt inert eftersom det har två oparade elektroner i olika pi * anti-bindnings orbitaler. Dessa två elektroner har parallella spinn, vilket innebär att de roterar i samma riktning kring sina egna axlar. Det är därför syremolekylen är inte särskilt reaktiv. Aktivering av syre kan ske genom två olika mekanismer; antingen genom reduktion via en elektron i taget (envärd reduktion), eller genom absorption av tillräcklig energi för att vända den snurr på en av de oparade elektronerna. Detta resulterar i produktionen av reaktiva oxidativa species (ROS). Det finns ett antal sätt på vilka människokroppen eliminerar ROS i dess fysiologiska tillstånd. Om ROS produktionen överskrider den reparation kapacitet, oxidativ stress resultat och skadestånd olika molekyler. Det finns många olika metoder som oxidativ stress kan vara migasured. Detta manuskript fokuserar på en av de metoder som nämns cell gelelektrofores, även känd som "kometanalys", som medger mätning av DNA-brott. Om alla faktorer som är kända för att orsaka DNA-skada, andra än oxidativ stress hålls konstanta, är mängden av DNA-skada uppmätt genom kometanalysen en bra parameter för oxidativ stress. Principen är enkel och förlitar sig på det faktum att DNA-molekylerna är negativt laddade. En intakt DNA-molekylen har en så stor storlek att den inte migrerar under elektrofores. DNA-brott, men om föreliggande resultat i mindre fragment som rör sig i det elektriska fältet mot anoden. Mindre fragment migrerar snabbare. Eftersom fragmenten har olika storlekar det slutliga resultatet av elektroforesen är inte en distinkt linje utan snarare ett kontinuum med formen av en komet. Systemet tillåter en kvantifiering av den resulterande "komet" och således de DNA-brott i cellen.
Introduction
Comet assay har utvecklats av svenska forskare Ostling och Johanson 1. DNA är en negativt laddad molekyl. Under elektrofores, mindre, skadade DNA-fragment färdas snabbare mot en positivt laddad anod 2. Ju mindre DNA-fragmenten, till den snabbare deras migrering mot anoden bildar en typisk "komet" med en "huvud", som består av intakt, oskadad DNA och en "svans" bestående av skadade DNA-fragment 3. Skadat DNA kan repareras genom olika mekanismer i kroppen 4, som håller generering av DNA-brott ganska balanserade 5. Om emellertid, är balansen till förmån för DNA-brott, kan pauserna ackumulera och kommer i slutändan att bidra till utvecklingen av en sjukdom.
Vår DNA lider cirka 0.000165% skador vid en given tidpunkt 6. Enkelsträngade DNA-brott hänvisa till en defekt på en av de två strängarna av DNA-dubbelspiralmedan dubbelsträngade DNA-brott uppstår när båda strängarna av DNA-dubbelspiral är skadade. Det finns olika faktorer som kan öka den mängd av DNA-brott vid en viss tidpunkt, såsom åldern på cellen, cigarettrök, olika läkemedel eller oxidativ stress 7-9. Om alla faktorer som leder till förbättrade DNA-brott hålls konstanta, då kvantifieringen av DNA-brott genom kometanalysen är en god indirekt parameter för oxidativ stress.
Metoden för kometanalys används alltmer idag inom medicinen inklusive oftalmologi. En orsak till detta är att oxidativ stress är mer och mer erkänd som en patogen mekanism för olika sjukdomar 8-11 och komet analys är en metod med vilken oxidativ stress indirekt kan kvantifieras.
Protocol
Studier på komet analys utförs vid universitetet i Basel, var Ögonkliniken godkänts av den lokala etiska kommittén i Basel
1. Beredning av reagenser
- Förbered Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS) (Ca ++, Mg ++ fri) lösning genom att tillsätta PBS (1 L-paket) och 990 ml dH 2 O till media. Justera pH till 7,4. Förvara vid RT.
- Bered lyserande lösning: För att förbereda 1000 ml tillsätt 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) och 10 mM Trizma bas (1,2 g) i dH 2 O.
- Bered elektroforesbuffert (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) genom tillsats av 30 ml av 10 M NaOH och 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs till 1500 ml dH 2 O och blanda väl. Den totala volymen är beroende gelboxen kapaciteten. Före användning, mäta pH av bufferten för att säkerställa ett pH av> 13.
- Bered neutraliseringsbuffert innehållande 0,4 M Tris (48,5 g tillsatt ~ 800 ml dH 2 O, justera pH till 7,5), koncentrerades (& #62, 10 M HCI) i 1000 ml med dH 2 O. Förvara lösningen vid RT.
- Förbered färglösningen. Till Etidiumbromid (EtBr; 10x Lager, 20 | ig / ml) tillsätt 10 mg EtBr i 50 ml dH 2 O och lagra vid RT. För 1x Lager - Blanda 1 ml med 9 ml dH 2 O. FÖRSIKTIG! Handtag EtBr med tillräcklig försiktighet eftersom det är ett känt cancerframkallande.
2. Isolering av leukocyter
- Erhålla humana blodprover (20 ml) med anti-koagulant såsom heparin med användning av venös punktering.
- Separera lymfocyterna med hjälp av en densitetsgradient cellseparator såsom Histopaque.
- I korthet, späd blodet i förhållandet 1: 1 med PBS eller RPMI (utan FBS) och skiktet över 600 | il cellseparatorn vätska.
- Centrifugera 1800 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Aspirera "buffy" coat in 3-5 ml PBS / RPMI och centrifugerades vid 300 xg under 10 min för att pelletera lymfocyter.
- Hämta lymfocyter från strax över gränsen mellan PBS (RPMI) Och cellseparator vätska, med hjälp av en pipett. Avlägsna de leukocyt banden från gränsytan mellan plasma och cellseparatorn vätskeskikt i varje rör och samla upp i en 50 ml tub.
- Bringa den totala volymen till 50 ml med kall Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM). Tvätta cellsuspensionen tre gånger med DMEM vid 300 xg under 10 minuter.
- Räkna det totala antalet celler genom att använda en Haemocytometer. Häng cellerna i PBS och aliquote i mikrocentrifugrör vid 10 7 celler / rör.
- Pipett 0,4 ml av celler i en 5 ml plastengångs rör. Tillsätt 1,2 ml 1% låg gelbildande temperatur agaros vid 40 ° C. Blanda och snabbt och pipettera 1,2 ml av cellsuspensionen på agaros-täckta ytan av en förbelagd bild. Undvik att producera bubblor.
- Låt agarosen att gela under omkring 2 min. Var konsekvent med tiden och temperaturen som används för gelning, och se till att agarosen är helt inställd innan nedsänkning i lyslösning. Efter fullt set, dränka in lyseringslösning på ~ 4 ºC.
3. Lysis och Elektrofores
OBS: Det beskrivna förfarandet är för elektrofores under pH> 13 alkaliska betingelser.
- Efter åtminstone 2 h vid ~ 4 ° C, försiktigt bort diabilder från lyse Solution. Placera objektglasen sida vid sida på den horisontella gelboxen nära den ena änden, att skjuta dem så nära varandra som möjligt.
- Fyll buffertreservoarerna med nybakade pH> 13 elektroforesbuffert tills vätskenivån täcker bilderna (undvika bubblor över agarosen) helt.
- Låt objektglasen sitta i alkalisk buffert för 20 min för att medge avlindning av DNA och expression av alkali-labil skada.
- Slå på strömförsörjningen till 25 volt (~ 0,75 V / cm) och justera strömmen till 300 mA genom att höja eller sänka buffertnivån. Elektrofores objektglasen i 30 minuter.
- Stäng av strömmen. Lyft försiktigt bilderna från bufferten och psnöra på en dräneringstråg. Drop klokt belägga objektglasen med neutraliseringsbuffert. Låt bilderna att sitta i minst 5 minuter. Tappa diabilder och upprepa ytterligare två gånger.
- Färga glasen med 80 pl 1x Etidiumbromid (EtBr) och låt stå i 5 minuter och sedan doppa i kylt destillerat vatten för att avlägsna överskott fläcken. Placera sedan en täck över bilden och lagra dem omedelbart. Store glider i en månad vid rumstemperatur under torra förhållanden.
OBS: Andra DNA-fläckar (t.ex. SYBR-grön) kan också användas. Varning! skyddshandskar som de flesta färgämnen är mutagena.
4. Kvantifiering av DNA-brott
- För att visualisera DNA-skador, observera EtBr-färgade DNA glider under en 40X objektiv fluorescerande mikroskop.
- Bedöm DNA-skada kvantitativt i cellerna genom att mäta längden av DNA-migration och den procentuella andelen av migrerade DNA (Figur 1A). Kvantifiera DNA-skada (Figur 1B) av bak- ögonblick och Olive-Moment. Definitioner av Tail-Moment och Olive -Moment har tidigare fått 8-10.
OBS: Enligt vår erfarenhet är det tillräckligt för att hålla fast vid en av parametrarna. Cellerna fotograferas genom att ställa in automatiska verktyg som skannar över objektglas och fotografier celler. Kvantifiering av DNA-brott kan göras genom bildanalys programpaket. Det finns flera olika mjukvarupaket som är skräddarsydda för att fånga bilden av celler och kvantifiera skador på DNA. Vi rekommenderar att du använder samma programpaket hela experimentet. Den laboratorietekniker identifierar intakt cell eller komet som görs på datorn och klickar med musen på den. Kometen eller intakt cell sedan automatiskt gjorde.
Representative Results
Även om metoden för kometanalys gör reproducerbara resultat, kan den påverkas av en mängd olika faktorer. En sådan faktor är huruvida leukocyter kryokonserveras före lys och gel-elektrofores eller om det här steget utförs på nylagade leukocyter. Figur 2 visar att i grupp 2, där leukocyter kryokonserverades före lys och gelelektrofores SS DNA raster var betydligt högre än i grupp 1, där lys och gel -electrophoresis gjordes på nylagade celler.
Analysen kan också användas för att indirekt bedöma den system oxidativ stress. Tabell 1 visar deskriptiv statistik för bak- stund och oliv ögonblick hos rökare och friska försökspersoner. Data visar att rökning halv ett paket cigaretter dagligen mer än fördubblar ssDNA avbrott i de cirkulerande leukocyter 9.
Figur 1. (A) visar mikroskopet används under comet assay analys. (B) Δ visar en typisk "komet" med en ljus huvud och svans (skadad mindre DNA-fragment). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. ssDNA raster var betydligt högre när leukocyter kryokonserverades (grupp 2) än när nylagade leukocyter användes före lys och gel-elektrofores.
Discussion
Svenska forskare Ostling och Johanson var först i sitt område att använda komet analys för att kvantifiera DNA-skador i celler 1. De neutrala betingelser att de två forskarna använt emellertid endast tillät detektion av dubbelsträngade DNA-brott. Singh et al. Anpassades senare analysen för användning under alkaliska betingelser, vilket gav en känslig version som kan bedöma dubbel- och enkelsträngade DNA-brott och upptäcka alkali-labila platser 12. Sedan dess initiala utvecklingen har analysen ändrats på olika åtgärder för att göra den lämplig för att bedöma typer av DNA-skador i olika celltyper 13-15.
Som med alla tekniker är viktigt att betala strikt uppmärksamhet på tekniska detaljer för att få korrekta resultat 16. Baserat på vår erfarenhet, de bästa resultaten uppnås om varje metod steg från lösning förberedelse till kometen kvantifiering-utförs av expertlaboratorie teknicians. Användningen av färsk och korrekt förberedda media, lämpliga pipetteringsteknik, exakta tidpunkten och (som tidigare nämnts i avsnittet resultat) användningen av nylagade leukocyter är avgörande för lys och gelelektrofores för att få korrekta resultat 17.
Alla de enskilda stegen i denna analys är lika viktiga för att få tillförlitliga resultat. 16 I allmänhet bäst resultat uppnås om varje enskild metod steg från lösning förberedelse till komet kvantifiering utförs av expert lab technicians.Important verkar användningen av färska och korrekt förberedda media , lämpliga pipetteringsteknik, exakta tidpunkten och som redan nämnts i resultatavsnittet användning av nylagade leukocyter för lys och gel-elektrofores för att få tillräckliga resultat från analysen 17.
Som gör andra metoder, har kometen analysteknik dess Advanlar och nackdelar. Att vara en känslig metod, är analysen sårbar för faktorer (t.ex. UV-ljus) som kan förstärker DNA-brott och därmed påverka resultatet. Varje faktor som kan öka oxidativ stress, utom det som är forskat, bör undvikas. Stressfaktorer kan öka graden av oxidativ stress, inte bara i leukocyter utan även i alla andra blod medier och lymfocyter. Som tidigare nämnts finns det många olika och mer direkta sätt att mäta oxidativ stress 18,19. Kometen analys är en av många metoder som har vissa fördelar. Dessa inkluderar dess relativa låga kostnad, det lilla antalet celler som krävs (<10.000 celler) och därmed de små prover av blod som krävs per patient, den relativa korta tidsperiod som krävs för att kvantifiera DNA-skador i celler (ca 3 dagar), dess känslighet och dess utbredda tillämplighet att bedöma DNA-skador i olika celltyper. Förr i tiden väljer vi att arbeta med leukocyter eftersom vi hade erfarenhet av dettacelltyp och det var tillämplig för särskild studie planeras. En annan fördel med den kometanalysen är att den kan användas för att detektera olika typer och nivåer av DNA-skador och kan således tillämpas i olika andra områden av studier förutom oxidativ stress såsom DNA-reparationsstudier, tillskott prövningar eller genotoxicitetsstudier.
Oxidativ stress är nu erkänd som att spela en kritisk roll vid patogenesen av flera sjukdomar. Kometen analysmetod, medan ett av många sätt att mäta oxidativ stress 18,19, är relativt enkel, mångsidig och billigt. När behärskar, kan denna metod användas i alla områden inom medicinen, där oxidativ stress spelar roll 8-10,20,21.
Disclosures
Inga.
Acknowledgments
Vi vill tacka FFA Stiftung i Triesen Liechtenstein, för ekonomiskt stöd till vår forskning på oxidativ stress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol - Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides | |||
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).
- Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity. Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).
- Bartsch, H., Nair, J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).
- Martin, L. J. DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).
- Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure. Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).
- Mozaffarieh, M., et al. Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients. Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).
- Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).
- Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).
- Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women. Reprod Sci. , (2014).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells). Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).
- Gaivão, I., Sierra, L. M. Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives. Front Genet. 5, 304 (2014).
- Zhang, J., et al. DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients. Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).
- Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity. Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).
- Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial. Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).
- Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).
- Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress. BioMed Res Int. , 157-547 (2013).
- Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus. Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).
- Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station. Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).
- Cabarkapa, A., et al. Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes. Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).
