Summary
Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır.
Abstract
Oksijen olmadan yaşayamam yüksek ökaryotik organizmalar; Henüz, paradoksal olarak, oksijen onlara zararlı olabilir. farklı pi * Anti-yapıştırma yörüngelerde bulunan iki eşleşmemiş elektrona sahip olduğundan oksijen molekülü kimyasal nispeten atıl olduğunu. Bu iki elektron kendi eksenleri etrafında aynı yönde, yani paralel bir dönüş vardır. Oksijen molekülü değil, çok reaktif olmasının nedeni budur. Oksijen aktivasyonu iki farklı mekanizma ile ortaya çıkabilir; ya bir zaman (tek değerli azaltma) az bir elektronun yoluyla azaltma yoluyla, ya da yeterli enerji emilimi sayesinde eşleşmemiş elektronların birinin dönüşünü ters. Bu reaktif oksidatif türlerinin (ROS) üretimine yol açar. İnsan vücudu fizyolojik halde ROS ortadan kaldırır olan bir dizi yol vardır. ROS üretim onarım kapasitesi, oksidatif stres sonuçları ve zararları farklı moleküller aşarsa. Oksidatif stres beni olabilen birçok farklı yöntem vardırasured. Bu yazıda ayrıca DNA kırıkları ölçümünü sağlayan "kuyruklu tahlil" olarak bilinen hücre jel elektroforezi adlı yöntemlerden biri üzerinde duruluyor. Oksidatif stres dışında DNA hasarına yol açabildiği bilinmektedir tüm faktörler sabit tutulduğu takdirde, kuyruklu tahlili ile ölçülen, DNA hasar miktarı oksidatif stres iyi bir parametredir. prensibi basittir ve DNA molekülleri negatif yüklü gerçeği dayanır. Sağlam bir DNA molekülü bu elektroforez sırasında göç etmez böyle büyük bir boyutu vardır. DNA tatili, ancak, anoda doğru elektrik alanında hareket küçük parçalar halinde mevcut sonuç eğer. Daha küçük fragmanlar hızlı göç ederler. Fragmanları farklı boyutlara sahip olarak elektroforez nihai sonucu belirgin bir çizgi, ancak daha ziyade bir kuyruklu şekline sahip bir sürekli değildir. Sistem hücresinde DNA kırıkları ortaya çıkan "kuyrukluyıldız" ve böylece bir ölçümü sağlar.
Introduction
Comet tahlil ilk İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson 1 tarafından geliştirilmiştir. DNA, negatif yüklü bir moleküldür. Elektroforez sırasında, küçük hasarlı DNA fragmanları daha hızlı bir pozitif yüklü anot 2 doğru okuyun. DNA fragmanları küçük, anoda doğru daha hızlı göç sağlam, hasarsız DNA ve hasar görmüş DNA fragmanlarının 3 oluşan bir "kuyruk" oluşan "kafa" ile, tipik bir "kuyruklu yıldız" oluşturulur. Hasarlı DNA 5 oldukça dengeli DNA kırıkları nesil tutmak vücutta 4 farklı mekanizmalarla, tarafından tamir edilebilir. Ancak, denge DNA kırılmalarının lehine ise, sonları birikebilir ve sonuçta bir hastalığın gelişimine katkıda bulunacaktır.
Bizim DNA belirli bir zamanda 6 yaklaşık 0,000165% hasar uğrar. Tek şeritli DNA sonları DNA çift iki sarmal birinde bir arıza bakınızDNA çift sarmal her iki ip kolları hasar gördüğünde, çift iplikçikli DNA kırılmaları kaynaklanır ise. Bu tür bir hücre yaşı, sigara dumanı, çeşitli ilaç ve oksidatif stres 7-9 olarak belirli bir zamanda DNA kırılmalarının miktarını arttırmak çeşitli faktörler vardır. Geliştirilmiş DNA kırılmalarının giden tüm faktörler sabit tutulduğu, daha sonra kuyruklu testin vasıtasıyla DNA kırılmalarının miktar oksidatif stres iyi dolaylı bir parametredir.
comet yöntemi Oftalmoloji dahil tıpta giderek günümüzde kullanılmaktadır. Bunun bir nedeni, oksidatif stres daha bir yöntem, dolaylı miktarlarının saptanması için oksidatif stres ile çeşitli hastalıklar 8-11 ve kuyruklu testin bir patogenetik mekanizması olarak kabul olmasıdır.
Protocol
Basel Üniversitesi'nde gerçekleştirilen comet ile ilgili çalışmalar, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı Basel Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi
Reaktifler 1. Hazırlık
- Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS) (Ca ++, Mg ++ serbest) PBS (1 L paket) ve ortam dH 2 O 990 ml ekleyerek çözeltisi hazırlayın. 7.4'e pH ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- Yokedici çözelti hazırlayın: 1000 mi dH 2 O içinde 2.5 M NaCl (146.1 g), 100 mM EDTA (37.2 g) ve 10 mM Trizma bazı (1.2 g) ekleyin hazırlamak için
- 1500 mi dH 2 O 10 M NaOH, 30 ml ve 7.5 ml arasında 0.2M EDTA, QS ekleyerek elektroforez tamponu (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) hazırlayın ve iyice karıştırın. toplam hacim jel kutu kapasitesine bağlıdır. Önceki> 13 olan bir pH sağlamak için tampon pH ölçümü, kullanımı.
- 0.4 M Tris ihtiva eden nötralizasyon tamponu hazırlayın (& # konsantre edildi, (48.5 g ~ 800 mi dH 2, O, pH'ı 7.5'e ayarlamak üzere eklenmiştir)62; dH 2 O ile 10 M HCI) 1,000 ml Oda sıcaklığında çözelti saklayın.
- Boyama çözüm hazırlayın. Etidyum bromür (EtBr; 10x stok, 20 ug / ml), oda sıcaklığında 50 mi dH 2 O ve mağaza EtBr 10 mg ekleyin. 1x Stok - 9 ml dH 2 O ile 1 ml karıştırın DİKKATLİ! Bilinen bir kanserojen olarak yeterli önlem ile EtBr tutun.
Lökosit 2. izolasyonu
- Venöz ponksiyon ile heparin gibi bir anti-pıhtılaştırıcı, insan kan örnekleri (20 mi) elde edilir.
- Böyle Histopaque bir yoğunluk gradyan hücre ayırıcı kullanılarak lenfositleri ayırın.
- 600 ul hücre ayırıcı sıvı üzerinde 1 PBS veya (FBS'siz) RPMI oranı ve katmanın: Kısaca, 1 kan sulandırmak.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüje 1800 x g. PBS / RPMI 3-5 ml 'Buffy' kat aspire ve lenfositler pelet 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edilir.
- (Sadece PBS arasındaki sınır yukarıdan RPMI lenfositleri AlBir pipet kullanarak) ve hücre ayırıcı sıvı. Plazma ve her bir tüp hücre ayırıcı sıvı katman arasındaki ara lökosit bantları çıkarın ve bir 50 ml tüp içine toplar.
- Soğuk Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ile 50 ml toplam hacmi getirmek. 10 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu DMEM ile üç kez yıkayın.
- Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin toplam sayıları sayın. PBS hücrelerin askıya alma ve 10 7 hücre / tüp mikrosantrifüj tüpler içine veya or.
- Pipet 5 ml'lik bir plastik tek bir tüp içine hücre 0.4 ml. 40 ° C de 1.2 ml% 1 düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz ekleyin. Karıştırın ve hızlı bir şekilde ve bir önceden kaplanmış sürgünün agaroz kaplı yüzey üzerine hücre süspansiyonu 1.2 ml pipetleyin. Kabarcıklar üreten kaçının.
- Agaroz, yaklaşık 2 dakika boyunca jel izin verin. Jelleşme için kullanılan zaman ve sıcaklık ile tutarlı olun ve bu agaroz tamamen lizis çözeltisi içinde daldırarak önce ayarlanmış olduğundan emin olun. S tamamen sonraet, ~ 4 ° C'de çözüm parçalama içine daldırın.
3. Lizis ve elektroforez
NOT: açıklanan prosedür pH> 13 alkali koşullar altında elektroforez içindir.
- ~ 4 ° C'de en az 2 saat sonra, yavaşça parçalama Çözüm slaytları çıkarın. Yer mümkün olduğunca birbirine onları yakın kayma, bir ucu yakınında yatay jel kutusunun yan yana slaytlar.
- Sıvı seviyesi tamamen slaytlar (agaroz üzerinde kabarcıkları önlemek) kapsar kadar taze yapılmış pH> 13 elektroforez tamponu ile tampon rezervuarları doldurun.
- 20 dakika DNA çözülmesi ve aside karşı duyarlı bir hasar ekspresyonuna izin vermek için kızağı alkalin tampon içinde bekletin.
- 25 volt (~ 0.75 V / cm) güç kaynağı açın ve yükseltilmesi veya tampon seviyesini düşürerek 300 miliamper akım ayarlayın. 30 dakika boyunca slaytlar Electrophorese.
- Gücü kapatın. Yavaşça tamponu ve p slaytlar asansörbir drenaj tepsisine dantel. Bilge kaplamaz nötralizasyon Tampon slaytlar bırakın. Slaytlar en az 5 dakika bekletin. Slaytlar boşaltın ve iki kez daha tekrarlayın.
- 80 ul 1x Etidyum Bromür (EtBr) ile slaytlar Leke ve 5 dakika bekletin ve daha sonra fazla leke çıkarmak için soğuk distile su daldırma. Ardından slayt üzerinde bir lamel yerleştirin ve hemen saklayın. Mağaza kuru koşullarda oda sıcaklığında bir ay boyunca kayar.
Not: Diğer DNA lekeleri (örneğin, SYBR yeşili) de kullanılabilir. Dikkat! En boyalar mutajenik olduğu gibi koruyucu eldiven giyin.
DNA Breaks 4. sayısallaştırılması
- DNA hasarını görselleştirmek için, 40X objektif floresan mikroskop altında EtBr lekeli DNA slayt gözlemleyin.
- DNA göçünü uzunluğu ve göç DNA (Şekil 1A) yüzdesinin ölçülmesiyle hücrelerinde nicel DNA hasarını değerlendirmek. Bagaj an ve Zeytin-Mome DNA hasarını (Şekil 1B) ölçmeknt. Kuyruk Moment ve Zeytin -Moment tanımları önceden 8-10 verilmiştir.
NOT: Bizim tecrübelerimize göre bu parametrelerden biri tarafından sopa yeter. Hücreler mikroskop lamı ve fotoğraflar hücreleri üzerinde tarar otomatik bir araç ayarlayarak fotoğraflandı. DNA kırılmalarının Niceleme görüntü analiz yazılım paketleri tarafından yapılabilir. Özel hücrelerin görüntü yakalama ve DNA hasarı ölçmek için yapılan birkaç farklı yazılım paketleri vardır. Biz deney boyunca aynı yazılım paketini kullanmanızı öneririz. laboratuvar teknisyeni sağlam hücre veya kuyrukluyıldız bilgisayarda atılır tanımlayan ve üzerinde fare ile tıklar. kuyrukluyıldız veya sağlam hücre sonra otomatik puanlanır.
Representative Results
Kuyruklu testin yöntemi tekrarlanabilir sonuçlar vermektedir rağmen, çeşitli faktörlere göre etkilenebilir. Böyle bir faktör, lökositlerin önceden liziz ve jel elektroforez ya da bu aşama taze hazırlanmış lökositler üzerinde gerçekleştirilir olup dondurularak olsun ya da değildir. Gösterir Şekil 2 bu lökositler liziz ve jel elektroforezi p-DNA önce dondurularak saklandı, Grup 2 sonları parçalama ve jel -electrophoresis taze hazırlanmış hücreleri üzerinde yapıldığını Grup 1 daha anlamlı olarak daha yüksek idi.
Tahlil da dolaylı olarak sistemik oksidatif stresi değerlendirmek için de kullanılabilir. Tablo 1 sigara içen ve sağlıklı kişilerde bagaj an ve zeytin an için tanımlayıcı istatistikleri gösterir. veri daha fazla günlük sigara yarım paket sigara dolaşan lökositlerin 9 ssDNA sonları iki katına çıktığını ortaya koymaktadır.
Şekil 1. (A) kuyrukluyıldız tahlil analizleri sırasında kullanılan mikroskop yansıtır. (B) Δ parlak baş ve kuyruk (daha küçük DNA fragmanlarını hasarlı) ile tipik bir "kuyruklu" anlatıyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lökositler taze hazırlanmış lökositler lizis ve jel elektroforez önce kullanıldığı zaman daha (Grup 2) dondurularak zaman Şekil 2. ssDNA sonları anlamlı derecede yüksekti.
Discussion
İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson hücrelerinde 1 DNA hasarını ölçmek için kuyruklu yıldız tahlil kullanmak için kendi alanında ilk edildi. Nötr koşulların iki bilim adamı kullanılan, ancak, sadece, çift sarmallı DNA kırılmalarının saptanmasına olanak. Singh ve ark., Daha sonra, çift ve tek dallı DNA kırılmaları değerlendirmek ve aside karşı duyarlı bir sitesi 12 tespit olabilir hassas bir sürümü üretilen alkalin koşullar altında kullanım için tahlil, adapte edilmiştir. Ilk gelişimi için, deney farklı hücre tipleri 13-15 DNA hasarı türleri değerlendirmek için uygun hale getirmek için çeşitli aşamalarda modifiye edilmiştir.
Tüm teknikler ile olduğu gibi, teknik ayrıntılara titiz dikkat doğru sonuçlar elde etmek için 16 önemlidir. Bizim deneyime dayalı, en iyi sonuçlar elde edilir, eğer her metodolojik adım gelen ölçümü-bir uzman laboratuvar techn tarafından kuyrukluyıldız gerçekleştirilen çözüm hazırlığıicians. taze ve doğru bir şekilde hazırlanmış medya, yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve taze hazırlanmış lökositlerin (daha önce sonuç bölümünde belirtildiği gibi) kullanım kullanımı doğru sonuçlar elde etmek için 17 lizis ve jel elektroforezi için sırayla gereklidir.
Bu tahlilde tüm bireysel adımlar güvenilir sonuçlar elde etmek için aynı derecede önemlidir. Genel iyi sonuçlarda 16 elde edilir kuyrukluyıldız ölçümü kadar çözüm hazırlık her metodolojik adım uzman laboratuvar technicians.Important tarafından yapılırsa görünüyor taze ve doğru hazırlanmış medya kullanımı yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve zaten sonuç bölümünde tahlil 17 yeterli sonuçlar elde etmek lizis ve jel elektroforezi için taze hazırlanmış lökositlerin kullanımı olarak anılacaktır.
Diğer metodolojiler yapmak gibi, kuyruklu yıldız tahlil tekniği onun Deniz Ken vardırTages ve sakıncaları. Hassas bir yöntemle olmak, tahlil DNA kırılmaları artırmak ve böylece sonuçlarını etkileyebilecek olan faktörler (örneğin, UV ışık) savunmasızdır. Araştırılmaktadır olan hariç, oksidatif stres geliştirmek her faktör, kaçınılmalıdır. Stresörler oksidatif stres lökositlerin değil, aynı zamanda tüm diğer kan ortamlar ve lenfositlerin değil sadece seviyesini artırabilir. Daha önce belirtildiği gibi oksidatif stres 18,19 ölçme birçok farklı ve daha doğrudan yolları vardır. kuyruklu deney belli avantajlara sahiptir, birçok yöntemlerden biridir. Bunlar, nispeten düşük maliyetli, (<10,000 hücre) gerekli hücrelerin az sayıda hasta başına gereken kan dolayısıyla küçük numuneler, hücreleri (yaklaşık olarak 3 gün) DNA hasarına ölçmek için gereken zaman göreceli olarak kısa bir süre, duyarlılık içerir ve farklı hücre tipleri de eşek DNA hasarı olan yaygın uygulanabilirliği. Biz bu deneyimi vardı çünkü Geçmişte biz lökositler ile çalışmayı tercihhücre tipi ve planlanan belirli bir çalışma için de geçerlidir. Kuyruklu tahlilin diğer bir avantajı, farklı türde ve DNA hasarının düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir ve böylece bu tür DNA onarım çalışmaları, takviye çalışmalarda ya da genotoksisite çalışmaları gibi oksidatif stres yanında çalışmalar çeşitli alanlarda uygulanabilir olmasıdır.
Oksidatif stres artık birden fazla hastalığın patogenezinde kritik bir rol oynuyor olarak kabul edilmektedir. kuyruklu yıldız tahlil metodu, oksidatif stres 18,19 ölçme birçok yollardan biri ise, nispeten basit, çok yönlü ve ucuz. Hakim olduğunda, bu yöntem, oksidatif stres rol 8-10,20,21 oynadığı tüm tıp alanlarında kullanılabilir.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Biz mali oksidatif stres üzerinde araştırma desteklemek için, Triesen Liechtenstein, LHW Stiftung teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol - Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides | |||
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).
- Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity. Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).
- Bartsch, H., Nair, J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).
- Martin, L. J. DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).
- Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure. Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).
- Mozaffarieh, M., et al. Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients. Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).
- Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).
- Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).
- Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women. Reprod Sci. , (2014).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells). Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).
- Gaivão, I., Sierra, L. M. Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives. Front Genet. 5, 304 (2014).
- Zhang, J., et al. DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients. Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).
- Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity. Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).
- Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial. Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).
- Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).
- Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress. BioMed Res Int. , 157-547 (2013).
- Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus. Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).
- Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station. Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).
- Cabarkapa, A., et al. Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes. Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).
