Summary
Neste vídeo demonstramos como isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos com encefalomielite autoimune experimental.
Abstract
Se estudar uma doença auto-imune direcionada para o sistema nervoso central (SNC), tais como encefalomielite autoimune experimental (EAE, 1), ou a resposta imunológica a uma infecção do SNC, tais como poliomielite, neuroborreliose Lyme, ou a neurossífilis, é muitas vezes necessário isolar as células do SNC infiltrantes imunológico.
Neste vídeo protocolo demonstramos como isolar células mononucleares (MNCs) a partir do SNC de um rato com EAE. O primeiro passo deste procedimento requer uma perfusão cardíaca dos roedores com uma solução salina para assegurar que nenhum sangue permanece nos vasos sanguíneos que nutrem o SNC. Qualquer contaminação do sangue vai aumentar artificialmente o número de aparente CNS-infiltrando multinacionais e pode alterar a composição aparente do sistema imunológico se infiltrar. Nós, então, demonstrar como remover o cérebro ea medula espinhal do rato para dilaceração subseqüentes para preparar uma suspensão de uma única célula. Esta suspensão é separado em um gradiente de Percoll duas camadas para isolar as multinacionais. Após a lavagem, estas células são, então, pronto para passar por qualquer procedimento necessário.
Células mononucleares isoladas usando este procedimento é viável e pode ser usado para eletrofisiologia, citometria de fluxo (FACS), ou bioquímica. Se a técnica é realizada sob condições estéreis (utilizando instrumentos esterilizados em uma capa de cultura de tecidos) as células podem também ser cultivadas em meio de cultura de tecidos. A população de determinada célula pode ser purificado usando procedimentos de separação magnética ou um FACS.
Protocol
- Profundamente anestesiar ratos. Pulverização com etanol 70% e fazer uma perfusão cardíaca com PBS por 10 min para remover as células dos vasos sanguíneos (corte os átrios direito e perfundir através do ventrículo esquerdo).
- Remover o cérebro ea medula espinhal e coloque em um tubo de 50 ml contendo gelada PBS. Cortar o cérebro ea medula espinhal em um coador de células 70 milímetros colocado em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de PBS gelado. Pressione cada pedaço de órgão através do filtro de células usando as costas de um êmbolo da seringa estéril 1 ml. Recolher a suspensão única célula em um tubo de 50 ml no gelo. Lavar o filtro de células com PBS e adicionar ao tubo até que a solução é clara.
- Centrifugar por 80-10 min a 390 g.
- Ressuspender as células em 20 ml Percoll PBS + 30% e sobreposição em 10 ml de PBS Percoll + 70%.
- Centrifugar a 390 g por 20 min em temperatura ambiente.
- Retire a gordura na parte superior do tubo. Coletar as células a partir da interface e lavar duas vezes com PBS. Count.
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Discussion
Este procedimento, como todos os procedimentos envolvendo animais vivos, deve ser aprovada pelo uso de sua instituição animal e comissão de cuidado. Recomendamos que um veterinário ou um técnico veterinário estar presente ao executar o primeiro perfusões cardíaca para garantir um nível suficiente de anestesia é dada ao animal antes e durante o procedimento, e que os animais não sofrem dores ou aflições desnecessárias.
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.