Introduction
Hücrelerdeki nükleik asitlerin transfeksiyonu, bilimsel araştırma, çeşitli uygulama vardır. Örnekler (1) raportör genler, gen ekspresyonunda farklı gen elemanları rolünü incelemek için (2) protein ekspresyon plazmidleri ilgili proteini aşın ifade etmek üzere, (3) küçük bir müdahaleci RNA gen ifadesinin aşağı da içermektedir. Belirli genlerin ekspresyon seviyesi manipüle ve bu manipülasyonlar ayırıcı etkisini ölçerek, araştırmacılar, seçilen biyolojik sistemlerde gen işlevlerini ortaya çıkarabilir. Tüm transfeksiyon yöntemleri, aynı transfeksiyon verimliliği sağlar ve hatta aynı transfeksiyon yöntemi, aynı 1 tüm hücre tiplerinin transfeksiyonu etmez. Bu nedenle, farklı transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat yöntemi, DEAE dekstran, katyonik lipit transfeksiyon, katyonik olmayan lipit polimer, transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofection 2,3 gibi geliştirilmiştir.
Makrofajlar içine Transfeksiyon bilhassa olduğunulikle zor dolayı makrofajlar (metıle) DNA 4 türetilen bakteriler de dahil olmak üzere yabancı maddelere karşı çok duyarlıdır profesyonel fagositler olmasından. Yabancı DNA'nın sokulması, sitokinler ve nitrik oksit 5,6 üretimine yol açan Toll-benzeri reseptör 9 (TLR9) yolunun aktive eder. Bu aktive makrofajlar daha sonra araştırmacılar incelemek niyetinde tedaviye daha az duyarlı olabilir.
Bizim laboratuvar rutin lusiferaz raportör genleri ile RAW264.7 makrofaj hücre hattı transfects ve biz arka planda önemli ölçüde daha yüksek lusiferaz sinyal yeterince sağlam bir protokol geliştirdi, ancak makrofajlar istirahat durumuna kalması için yeterli de nazik var. Transfekte edilmiş hücrelerin davranışları IκBζ (pGL3- IκBζ) promoter bölgesini barındıran bir ateş böceği lusiferaz raportör geni ile değerlendirildi. IκBζ ekspresyonu, bakteriyel hücre duvarı bileşeni, dudak ile üst-düzenlenmektediropolyssacharide (LPS) 7,8, ve anti-iltihabik sitokin ile baskılanmış, İnterlökin-10 (IL-10) 8. Kuyular arasındaki transfeksiyon varyasyon hesaba katmak için, normalleştirme amacıyla Renilla lusiferaz gen (örn phRL-TK) ihtiva eden bir kontrol plasmidi-transfekte co. Açıklanan protokol DNA plazmid çeşitli transfeksiyon zamanlaması, transfeksiyon reaktifleri tipi, transfeksiyon reaktifleri ve plasmid DNA miktar dahil olmak üzere parametreler, hem de transfeksiyon reaktifi oranı test edildikten sonra optimize edilir. Bu protokolde yer alan iki transfeksiyon reaktifleri (1), bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi ve (2) bir protein / poliamin bazlı transfeksiyon reaktifi bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plazmid DNA Saflaştırma
- Üreticinin protokolüne göre bir maxiprep kiti kullanılarak plazmid DNA ekstrakte edin. TE tamponu, 500 | il yeniden süspanse plazma DNA.
- Kloroform: Bir fenol gerçekleştirin izoamil alkol çıkarma ve izopropanol yağış kalan bakteri kirleri çıkarmak. LPS varlığı transfeksiyon 9 engeller.
- Plasmid DNA (1, pH 8: 25: 24) ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır izoamil alkol: kloroform: Fenol 500 ul ekle. Fenol Ciddi yanıklara neden olur ve ağır hasar olduğu kadar yanıklar hep hissettim değildir bu yüzden bir anestezik olduğunu. Davlumbaz izoamil çıkarma ve dikkatli kullanın: kloroform: fenol gerçekleştirin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle 13,000 x g'de santrifüjleyin. Yeni bir 1.5 ml'lik bir toplama tüpü içinde, üst sulu faz 350 ul aktarın.
- Alt organik faz içeren tüp TE tamponu, 350 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin. Aynı 1.5 ml toplama tüpüne üst sulu faz 350 ul aktarın.
- 3 M sodyum asetat (pH 5.2), 70 ul ilave edin ve iyice karıştırın. % 100 izopropanol, 700 ul ekle. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. 10 minat 4 ° C için 13.000 xg'de Santrifüj. Süpernatantı.
- Pelet% 75 etanol içinde 500 ul ekle. Vorteks örnekler 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 5,000 x g de karıştırılır ve santrifüjlenir için. Süpernatantı. DNA pelet olduğunu.
- Tüpün kapağını açın ve hava 5 RT'de pelet kurulayın - 10 dk. Pelet saydam hale gelmelidir. DNA pelletini TE tamponu, 500 ul ekle. 50 ısı - 10 dakika süreyle 60 ° C'de DNA pelet çözülmesi için.
- 260 nm (A260) ve bir spektrometre ile 280 nm (A280) absorbans ölçün. 50 ng / ul A260 değeri çarpılarak DNA konsantrasyonu hesaplayın. Calculatin DNA'nın kalitesini değerlendirmekg A260 / A280 oranı. 2.0 - yüksek kalite ile DNA 1.8 bir A260 / A280 oranı vermelidir.
2. Hücre Kültürleme ve Tohum
- DMEM içinde kültür RAW264.7 hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde% 9 fetal dana serumu (DMEM /% 9 FCS) ile takviye edilmiştir. Her geçiş sırasında, bir Pasteur pipeti kullanarak sürekli pipetleme hücreleri plakadan ayırın. Passage hücreleri 2 günde, 1,5 tohum - stok olarak 10 cm doku kültürü tedavi yemeğin 2 milyon hücre. 6 hafta - hücrelerin her 5 yeni stok çözülme.
- Transfeksiyondan bir gün, DMEM /% 9 FCS 500 ul bir hacim içinde, 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 200,000 hücre tohum. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 4 saat inkübe hücreleri.
- Transfect hücreleri ya da lipid bazlı tepkime maddesi (aşama 3.1) ya da protein / poliamin-bazlı tepkime maddesi (aşama 3.2).
3. Transfeksiyon
- Lipid bazlı transfeksiyon:
- Transfeksiyon REAGEN Isınmat karanlıkta oda sıcaklığına kadar. Serum-barındırmayan ortam, DMEM /% 9 FCS, 37 ° C'ye kadar ısıtın.
- 1.5 ml bir tüp içinde, serum-içermeyen ortam içinde plasmid DNA, 0.5 ug ila 50 ul ekle. Sıvı yüzeyinin altında pipet ile transfeksiyon reaktifi 2 ul ekle. 6 saniye vorteksleyin.
- 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta reaktif / DNA karışımı bırakın.
- 30 dakika inkübasyon sırasında, kuyudan ortamını çıkarın ve her bir oyuğa taze DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin.
- 30 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın.
- Her kuyu seyreltilmiş karışımın 300 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde 4 saat - 2 inkübe edin.
- Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. Hücre uyarma önce 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin.
- Protein / poliamin bazlı transfeksiyon:
- Isınma serum serbestorta ve 37 ° C'ye kadar, DMEM /% 9 FCS.
- Serum-barındırmayan ortam 18.75 ul transfeksiyon reaktifi 0.75 ul ekleyin. Vortex kısaca karıştırın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Seyreltilmiş transfekte reaktifi içine 1 ug / ul DNA 0.5 ul ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- 10 dakika inkübasyon sırasında, 24 oyuklu plakanın her bir mesafede ortamını çıkarın ve her bir oyuğa 250 ul taze DMEM /% 9 FCS ekleyin.
- 10 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı halinde, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin.
- Oyuğuna seyreltildi karışımın 270 ul ekle. 4 saat - 2 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir.
- Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin.
4. Hücre Uyarım ve Lusiferaz Deneyi
- Taze DMEM /% 9 FCS iyi 250 ul medya değiştirin.
- 50 LPS'nin ul veya LPS + IL eklemeKuyusuna istenilen konsantrasyonlarda -10. 37 ° C'de,% 5 CO2 kuluçka plaka dönün. 6 saat - 2 için uyarır.
- , Aspirasyon yoluyla uyarma çözümü çıkarın buz PBS ile yıkayın ve 1x Pasif Lizis Tampon 200 ul ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sallayın. Pençe ve 1.5 ml tüpler lizat transferi ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır.
- Aktarım, üreticinin protokolüne uygun olarak lusiferaz sinyallerin saptanması için beyaz, şeffaf dipli, 96 oyuklu plakaya temizlenir lizat (süpernatant) 40 ul.
- Tüm görünür ışık spektrumu boyunca bir lüminometre ile lusiferaz sinyalini okuyun.
5. Veri Analizi
- Her kuyudan Renilla lusiferaz değerlere göre ateşböceği lusiferaz bireysel değerleri bölerek Renilla oranı: firefly hesaplayın.
- Tarafından iyi muamele ve Renilla oranı: firefly bölerek katlık değişime hesaplayınmuamele edilmemiş kuyunun bu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, RAW264.7 iki transfeksiyon reaktifleri transfeksiyon verimini karşılaştırır. protein / poliamin bazlı transfeksiyon yaklaşık% 5 verim (Şekil 1A) ile sonuçlanırken, lipit bazlı reaktif tipik olarak yaklaşık% 25 transfeksiyon oranı vermiştir. Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık pGL3-IκBζ promotör muhabir (Şekil 1B) ile transfekte RAW264.7 hücrelerde lusiferaz sinyaller gözlenmiştir. Bu transfekte edilmiş hücrelere LPS ilave ateşböceği lusiferaz sinyali IκBζ promotör raportör artmış transkripsiyon aktivitesi dair doğrudan bir göstergedir artmıştır. Diğer bir deyişle, sonuçlar, LPS önceki raporlarda 7,8 ile tutarlı IκBζ geninin ekspresyonunu yukarı regüle önerdi. 2 deneylerde elde edilen tipik sonuçlar göstermektedir, örnek olarak lipit bazlı transfeksiyon kullanılarak. Fi bireysel sinyal değerlerini aldıktan sonrarefly lusiferaz ve Renilla lusiferaz (Şekil 2A ve 2B), ateşböceği lusiferaz sinyalleri Renilla lusiferaz sinyali (Şekil 2C) için normalize edildi. Normalleştirme bağlı Transfeksiyon etkinliğindeki iyi-oyuk varyasyon önerilir. Işleme koşulları (LPS veya LPS + IL-10) ateşböceği haberci sinyalleri değiştirilmiş belirlemek için: Renilla oranı (yani, normalize edilmiş sinyaller) tedavi grupları tedavi edilmemiş (uyarılmamış) bir numunesi (Şekil 2D ile karşılaştırıldı ). Verilerimiz, LPS ile muamele RAW264.7 hücreleri LPS IκBζ genin transkripsiyonunun seviyesini artış gösteren, pGL3-IκBζ promotör raportör aktivitesini yukarı regüle gösterdi. IL-10 varlığında, IκBζ promotör raportör, IL-10 IκBζ geninin LPS ile indüklenen transkripsiyonunu inhibe etmek için mümkün olduğunu göstermektedir, düşük aktiviteye sahiptir. protein / poliamin bazlı transfeksiyon genellikleateşböceği lusiferaz ve Renilla lusiferaz sinyalleri hem düşük değerlerini vermiştir. 3 transfeksiyon ve stimülasyon (24 saat veya 48 saat) arasında kalan süreyi karşılaştırır ve lusiferaz sinyalleri zamanla azaldığını göstermektedir. lipit bazlı transfeksiyon reaktifi (Şekil 3A) kullanıldığı zaman sinyal azalması veri yorumlama müdahale etmedi; IL-10 ile LPS ve inhibisyonu ile endüksiyon de geri kalan 48 saat sonra gözlenmiştir. Protein / poliamin bazlı transfeksiyon reaktifi (Şekil 3B), özellikle Renilla lusiferaz sinyalleri kullanılmıştır, ancak sinyal azalma daha belirgindi. Bunun bir sonucu olarak, tedavi grupları arasındaki fark, 48 saatlik bir dinlenme sonra gözlenmedi.
Apoptoz derecesi her bir transfeksiyon yöntemi etkisi değerlendirildi şekilde transfeksiyon bir istenmeyen etki, hücre ölümüdür. Hücreler transfekte edilmiş, veya ve Annexin-V ve propidyum iyodür tabi tutuldu (PI)boyanması. Bu hücrelerden hazırlanan lizatlar, aynı zamanda sağlam ve klivaj poli ADP riboz polimeraz (PARP) proteinin varlığı için analiz edilmiştir. Annexin-V / PI boyanan hücrelerin akış sitometrik analizi, transfekte edilmemiş hücrelere kıyasla, protein / poliamin bazlı transfeksiyon (Şekil 4A) ise gelmediğini lipit bazlı transfeksiyon hafif Anneksin-V pozitif hücrelerin oranını önerdi . Benzer şekilde, protein / poliamin bazlı transfeksiyon (Şekil 4B) ise gelmediğini klivaj olmuş PARP oranı artmış hafif transfekte lipit bazlı. Bununla birlikte, apoptotik hücrelerin yüksek sayılar rağmen, ışık mikroskobu ile hücrelerinin morfolojisi (Şekil 4C) değişmemiştir. Daha da önemlisi, lipid bazlı transfekte edilmiş hücrelerin transfekte edilmemiş hücrelerden biyolojik tepki (Şekil 4D), özdeş kalmıştır. Hücreler ^ IL-10 ± LPS ve TNF miktarları ile uyarıldı5; Kültür süpernatanı içine salgılanır ELISA ile ölçüldü. Hem edilmemiş ve lipid bazlı transfekte edilmiş hücreler, LPS'ye yanıt olarak TNFa benzer miktarlarda yapılan ve IL10 ilavesiyle inhibe edilmiştir. Hücreler uyarılmış olup tutulduğu zaman hiç bir TNFa yapıldı (Şekil 4D) hücreleri transfeksiyondan sonra saf kaldığını göstermektedir.
Lipit bazlı transfeksiyon 1. Şekil protein / poliamin bazlı transfeksiyon daha yüksek transfeksiyon verimi vermiştir. (A), RAW264.7 hücreleri ya da lipid bazlı ya da protein / poliamin bazlı transfeksiyon tepkin maddeler ile bir GFP-ifade eden plazmid ile transfekte edildi. GFP sinyali sitometri 24 saat sonra akış ile ölçülmüştür. (B) RAW264.7 hücrelerinin pGL3-IkBζ promotör raportör ile transfekte edilmiştir. 48 saat dinlenme, c sonraarşın 6 st için LPS ile stimüle edildi. Firefly lusiferaz sinyal üreticinin talimatlarına göre ölçülmüştür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tipik lusiferaz deney verileri. RAW264.7 hücreleri TK-Renilla ve IkBζ promotör raportör ile transfekte edilmiştir. 24 saat bekletildikten sonra hücreler, 2 saat süre ile, IL-10 ± LPS ile stimüle edildi. (A), ateş böceği lusiferazı (B) Renilla lusiferaz sinyalleri lusiferaz deneyi üreticinin talimatlarına uygun olarak ölçüldü. (C) Haberci aktivitesi TK-Renilla sinyaline normalize edilmiştir ve ateş böceği / Renilla oranı olarak çizilmiştir. (D) katlı değişim bölünmesiyle hesaplanırateşböceği:. unstimulated örnek bu tarafından uyarılan numunelerin Renilla oranı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lusiferaz sinyalinin gücü Şekil 3. zamana bağlıdır. (A) lipid tabanlı bir transfekte edilmiş ve (B) protein / Poliamin tabanlı transfekte edilmiş hücreler için dinlenmiş 24 saat veya 48 saat önce, IL-10 ± LPS ile uyarılması ya 2 saat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
protokol sadece transfeksiyon verimliliği odaklanmak değil Burada anlatılan, ancak hücrelerin fizyolojik devletlerin verimlilik ve korunması arasında bir denge amaçlamaktadır. Özellikle, bizim prosedür transfeksiyon reaktif toksisitesini en aza indirmek ve lusiferaz sinyali maksimize başarır.
Protokolünde bir kritik adım hücrelerinin sağlıktır. Büyümüş kültürler fizyolojik değişiklikleri ve aynı zamanda hücrelerin, 10 fenotip ve işlevini değiştirmek uzun bir süre için RAW264.7 hücrelerinin sürekli bir kültür olarak transfeksiyon için uygun değildir. Bir düşük geçiş numarası taze çözülmüş hücreler transfeksiyon için kullanmak tavsiye edilir.
Bir başka önemli husus transfeksiyon reaktif seçimdir. Lipid bazlı transfeksiyon reaktifleri tipik olarak kullanım ve ticari temin kolaylığı araştırma kullanılır. Bununla birlikte, bu reaktiflerden bazıları unintende nedenD (ve genellikle istenmeyen) transfekte edilmiş hücrelerin 11,12 küresel gen ekspresyonu değişir. Bu sorunu çözmek için, hücreler, yalnızca bunun yerine tipik bir O / N birkaç saat transfeksiyon reaktifleri ile inkübe edilir, ya da olmayan bir lipid bazlı reaktif transfeksiyonu için seçilir. Transfeksiyon reaktifi ile daha uzun inkübasyon süresi transfeksiyon verimi artar, ancak aynı zamanda, deneysel tasarım engelleyebilir, her ikisi de, hücre ölümünü ya da hücre aktivasyonunun neden olan hücreler ya da zararlı olabilir. Protein / polyamine- bu 4A ve 4B, Şekil göre transfeksiyon transfekte edilmemiş hücrelere kıyasla, apoptoz veya nekroza neden olmamıştır. lipit bazlı transfeksiyon, daha kısa bir kuluçka süresi ile, hücre ölümü daha yüksek bir seviyeye neden oldu. Bu lipit bazlı transfeksiyon reaktifi yüksek transfeksiyon verimi ile korele edilir. Transfekte hücreler mikroskop altında incelendiğinde, ancak, herhangi bir kayda değer morfolojik değişiklik vardıs (Şekil 4C). Aktive makrofajlar, genellikle yayılan bir şeklinin benimsenmesi, ancak her ikisi de transfekte edilmemiş ve transfekte hücreler kendi dinlenme devletlerde olduğu gösteren, stimülasyon öncesi aktivasyonu işaretleri göstermemiştir. Buna ek olarak, transfekte edilmiş hücreler, transfekte edilmemiş hücrelere (Şekil 4D) ve LPS ve IL-10 uyarılmaya benzer biçimde karşılık verdi. Bu gözlemler topluca bu transfeksiyon prosedürü hücrelerinin doğal davranışını değiştirmez göstermektedir.
transfeksiyon ve deneysel tedavi (dinlenme zamanı) arasındaki zaman da çok önemlidir. Yeterli zaman ifade lusiferaz genlerin ve onların istirahat devlet yeniden kurmak hücreler için verilmesi gereken; Bununla birlikte, çok uzun bir kuluçka transfeksiyon verimi yüksek değildir, özellikle lusiferaz sinyalleri azaltabilir.
Burada prosedür laboratuarımızda kullanılan özel lusiferaz raportör geni için de geçerlidir. Minör ayarlamalar nee olacakded bir haberci kullanıldığı zaman. Renilla lusiferaz oranı, transfeksiyon ve tedavi, tedavi koşulları arasında dinlenme zamanı: test edilmesi gereken parametreler farklı ateşböceği lusiferaz muhabiri bulunur. 50: pGL3-IκBζ 1 oranı: phRL-TK, tipik olarak kullanılır, ancak bu oran 1 arasında olabilir: 1: 1-100. Bu hücrelerden transfeksiyon solüsyonu çıkarılması ve deneysel tedavinin başlangıcı arasında bir 24 saat geri kalanı en iyi sinyal verdiği bulunmuştur. 48 saat sonra, lusiferaz sinyalleri düşmeye başladı ve tedavi grupları arasındaki farklılıklar azaltılabilir, hatta ortadan kaldırılmıştır.
tarif edilen transfeksiyon prosedürü lusiferaz raportör tahlilleri ile sınırlı değildir. Homojen bir nüfus gerekmez Diğer deneysel tasarımlar yararlanmış olacak; Örneğin, bireysel hücrelerden gözlemlere dayanır floresan mikroskopi için. Tek dezavantajı untransfected meslektaşları arasında başarıyla transfekte hücrelerin bulmak olacak, amadaha az zaman alıcı ve emek-yoğun daha arzu edilebilir olmanın faydaları. Stabil hücre hatları tercih edilir durumda, protokol kararlı hücre çizgileri oluşturulur zaman deneysel prosedür optimize edilebilir olan başlangıç deneyleri için bir araç sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
