Summary
Receptor trafficking modulerer signalering og cellenes respons på ligander og er, i seg selv, som reagerer på celle forhold, blant annet ligandindusert signalering. Her beskriver vi en kraftig og fleksibel teknikk for kvantitativt vurdere legemiddelindusert reseptor trafficking ved hjelp immunolabeling og colocalizational analyse.
Introduction
Reseptorer, spesielt G-protein koblede reseptorer (GPCR), blir rutinemessig trafikkert intracellulært, til og fra celleoverflaten 1. Disse complexly orkestrert og tett kontrollert prosesser diktere cellenes tilgjengelige reseptor utfyller og regulere reseptor tidsmessig aktivitet, desensitivisering, og resensibilisering 2 - 4. Viktigere, disse prosessene er lydhør overfor cellulære miljøer, inkludert legemiddelindusert reseptor aktivitet eller inaktivitet. Som er, kan handlingene til ligander på reseptorer endre intracellulær trafficking av disse reseptorene, og dermed endre cellerespons. På denne måte eksterne ligander utøve enda flere effekter på celle-funksjon, også utover klassiske messenger-til-effektor kaskader 5,6.
Undersøke slike endringer i indusert reseptor trafficking er vanskelig. Alle tilgjengelige teknikker innebærer begrensninger. Biotin beskyttelse analyser har blitt brukt til Monitor overflatereseptorer populasjoner. Disse reseptorene er biotinylert og en tidsforløpet av immunoutfellinger er utført for å kvantifisere reduksjons i biotinylerte reseptorene over tid. Denne teknikken overvåker hovedsakelig den gradvise nedbrytning av en innledende, merket, populasjon av 7-reseptorer, og er svært nyttig i å lage tidsforløp i denne prosessen. Dessverre er denne analysen ikke i stand til å overvåke en hvilken som helst annen enn nedbrytning av den opprinnelige pool av reseptorer, slik som internalisering, gjenvinning, eller nye reseptorer prosess. Dessuten kan tilsetningen av et antistoff i 150kDa området til en reseptor på 50 kDa området forandre reseptorens handelen 8,9, og denne teknikk kan være vanskelig å bruke med lave nivå reseptorer.
Andre prosedyrer bruke ulike metoder for å identifisere intracellulære smugler avdelinger (f.eks endosomer, etc.) og vurdere deres colocalization med reseptorene av interesse. Dette inkluderer osse av heterologe systemer uttrykker fluorescerende protein-merket kimære konstruksjoner av reseptorene og kupé markører (f.eks Rab-familien GTPases). Dette gjør potensielt bruk av levende-cell imaging, fjerne problemstillinger knyttet til fiksering og permeabilization. Mens kraftig, lider en slik strategi fra de samme begrensningene av heterologe systemer generelt: Tag og ekspresjonsnivået effekter på oppførsel handel og inkompatibilitet med flere fysiologisk representative celletyper. Mer populært, er fargestoffer som brukes for enkelt å merke intracellulære (f.eks lysosomer, tilsynelatende) 10. Fargestoffer, men kan mangle spesifisitet (alle sure organeller i tilfelle av fargestoffer for lysosomer) og ikke vurdere menneskehandel gjennom andre avdelinger. Likevel, disse teknikkene tillater betydelig kontroll over systemet og eksperimentelle forhold og kan dra nytte av colocalization analysemetoder som presenteres her, nedenfor.
Metoden we tilstede her foredler sporing av reseptoren trafficking av colocalization. Ved å bruke immunocytokjemi (ICC) å merke egnede markører, er det mulig å identifisere flere forskjellige intracellulære. Dette tillater også bruk av fysiologisk relevante primære cellekulturer på plass av heterologe systemer. Denne ICC-protokollen innebærer fikse cellene av interesse før merking; Dette tillater merking på et bestemt endepunktet etter behandling (er). Dette gir et øyeblikksbilde av globale reseptor-kupé foreninger på det endepunktet. Med flere tidspunkt, kan en tidsforløpet av trafikkendringer også bygges.
Kort, celler er narkotika behandlet, merket for reseptoren og intracellulære rommet av interesse, confocally avbildes, og photomicrographs analyseres for matematisk kvantifisere colocalization av reseptoren og rommet 11. I vår bruk, undersøkte vi colocalization av en reseptor med Rab5, Rab11, og lysosomal-assosiert membran protein 1 (LAMP1). Disse markørene identifisere tidlige endosomer, resirkulering endosomes og lysosomer, hhv. Disse colocalization tiltakene fungerer som stedfortredere for de overordnede prosesser av internalisering, gjenvinning og degradering 12.
Som med alle teknikkene, skal noen begrensninger tas i betraktning. På grunn av behovet for å avbilde hver enkelt neuron analysert, kan denne teknikken bli ganske arbeidskrevende, avhengig av antall av tilstander og tidspunkter som er involvert. All immunolabeling må også kjempe med effekter på celle ultrastructure, protein lokalisering, og epitope tilgjengelighet forårsaket av fiksering og permeabilization 13.
Selv om det opprinnelig optimalisert for bruk med primærkulturer av primære sensoriske neuroner, er denne metoden i stor grad er kompatibel med andre monolagsbelagt kultur modeller.
Bruken av en matematisk kvantifisert Målte av colocalization er, spesielt, langt mer metodologisk stringente enn tidligere teknikker som brukes for å vurdere reseptor trafikkendringer, som ofte har støttet seg på vage, subjektive tiltak som visuelt inspisert flerkanals overlegg 14.
Denne teknikken er spesielt nyttig for sin brede kompatibilitet med in vivo intervensjoner (før primærkultur generasjon), in vitro intervensjoner (under kultur vekst), og ulike merking er rettet mot 15. Som sådan kan den bli tilpasset til mange forskjellige problemstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Denne protokollen er bredt kompatibel med ulike monolagsbelagt celle / vevskulturstudier modeller, behandlingsregimer og merking mål. Dermed er i bruk, vil mange spesifikke parametre variere basert på eksperimentell design. Her referanser til disse brukerdefinerte parametere er generiske. Eksempel betingelser, som anvendes for å oppnå de representative resultater er angitt i kursiv.
1. Solutions
- Forbered vasking buffer ved å blande 0,1M Tris-bufret Hyperton (300 mm) Saline og 0,05% polysorbat 20; pH 7,4 ved RT.
- Forbered blokkering buffer. 0,05 M Tris-bufret Hyperton (300 mM) Saline legge 0,05% polysorbat 20, 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% kald fiskeskinn gelatin og justere pH til 7,4 ved romtemperatur.
- Forbered antistoff-fortynningsmiddel ved tilsetning av 0,05% Polysorbat 20, 1% BSA, 0,1% kald fiskeskinn gelatin til 0,05 M Tris-bufret Hyperton (300 mM) Saline, og justere pH til 7,4 ved 4 o C.
Merk: pH i Tris buffer er temperaturavhengig. Det vil si at en endring i temperatur vil forandre oppløsningens pH-verdi. For konsistens, bør disse buffere alltid være pH-justert ved den temperatur ved hvilken de skal brukes.
2. Cell Culture
Merk: Passende protokoller cellekultur vil variere basert på celletype (r) som brukes. Disse prosedyrene må optimaliseres separat. Detaljerte cellekultur metoder er lett tilgjengelige, inkludert 16. En lignende prosedyre ble benyttet for å oppnå de representative resultater, med de viktige forskjeller:
- Kultur rygg root ganglia nerveceller fra voksne dyr som beskrevet 12. Voksen-neuron vekstmedium å dyrke cellene. Reduser glial celletettheten ved forhåndspåleggingen, i stedet for glutamat. Dette resulterer i en blandet nevron-glial kultur dyrket på 12-runde dekkglass med minst 30-60 neuroner per plate og tilhørende gliaceller dyrket til omtrenteligely 40% confluency. Det bør bemerkes at nevroner i en primær kultur ikke vil replikere og bli presset ut av platen ved hjelp av ko-dyrket glia hvis glia får lov til å vokse for mye. For å unngå at det påvirker nervecellene, er fysisk reduksjon av glial tall foretrekke fremfor kjemiske / farmakologiske metoder.
Merk: Ved anvendelsen av denne protokollen, antar vi at cellene av interesse er vokst til sin eksperimentelt ønsket tilstand og enkeltlag belagt. Vi finner at platekledning på 12-runde dekkglass i 24 brønners plater for å være mest praktisk. Alle volumer og prosedyrene som er beskrevet er egnet for en dekkglass i en brønn av en 24-brønners plate.
3. Drug Behandling av dyrkede celler
Merk: Flere sekvensiell eller overlappende, medikamentell behandling er mulig. Legemidler, doser / konsentrasjoner, og varigheten av eksponering brukes vil avhenge av den spesifikke forsøket.
- Fjern den opprinnelige vekstmedium 16 Merk: Det er viktig at hver uavhengig replikere (vanligvis en enkelt 24-brønns plate kultur) inneholder samme felles kontroll tilstand. Dette vil tillate normalisering av data på tvers av gjentak, som korrigerer for inter-rettssaken variabilitet.
- Cellene inkuberes i de opprinnelige vekstbetingelser 16 i 48 timer.
- For påfølgende medikamentell behandling, gjenta trinn 3.1 og 3.2 med Deltorfin 1fiM, SNC80 1fiM, eller kjøretøy og inkuberes i 60 min 12. Oppløse Deltorfin II i vann og oppløseliggjøre SNC80 ved 10 mM i 40 mM HCl og sonikere, fortynnet til 1 mM i vann.
Merk: Denne protokollen forutsetter stoffet (e) har blitt oppløst, slik at de kan bli oppløst ved den ønskede konsentrasjon (er) i det valgte vekstmediet. Hensiktsmessige prosedyrer forslik solubilisering vil variere avhengig av medikamentet i spørsmålet og må optimaliseres hver for seg. - Vask cellene forsiktig, tre ganger, med ~ 1 ml vaskebuffer per vask. Utføre hver vask ved forsiktig aspirering av væske fra brønnen, så raskt som mulig, og forsiktig, etterfylling av godt med frisk oppløsning, som ønsket (i dette tilfellet med vaskebuffer).
4. Fiksering og Immunocytochemistry
Merk: De spesifikke merking målene vil variere etter eksperimentet. I vår bruk, vi merket delta opioidreseptorer (DOR) og Rab5, Rab 11, og LAMP1, som omtalt. De spesifikke antistoffer som anvendes vil avhenge av den spesifikke forsøket. Optimale merkingsbetingelser er avhengig av det spesifikke antistoff (er) som benyttes. En mye fyldigere diskusjon om dette emnet er under.
- Fiksere cellene ved nedsenking i ~ 300 ul 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfat-bufret saltløsning i 10 minutter ved 37 ° C.
Merk: Det er viktig at 4% paraformaldehyd være tilberedes på grunn av autofluorescens som skyldes bruk av tidligere frosne paraformaldehyd. - Vask cellene forsiktig, tre ganger, med ~ 1 ml vaskebuffer per vask, som beskrevet i 3.3.
- Cellene inkuberes i 300 ul blokkeringsbuffer i 2 timer ved RT.
- Cellene inkuberes med primære antistoffer i 300 ul av antistoff-fortynningsmiddel i 48 timer ved 4 ° C. I vår bruk, primære antistoffer mot dor (kanin-anti-dor) og en av: Rab5 (mus anti-Rab5), Rab 11 (muse-anti-Rab11), og LAMP1 (geite-anti-LAMP1).
- Vask cellene forsiktig, tre ganger, med ~ 1 ml vaskebuffer per vask, som beskrevet i 3.3.
- Cellene inkuberes med sekundære antistoffer konjugert til forskjellige fluoroforer (se omtale nedenfor) i 300 ul av antistoff-fortynningsmiddel i 1 time ved RT. I denne og alle etterfølgende trinn, beskytter cellene mot lyse. For å oppnå de representative resultater ved å bruke grønn-utslipp fluorophore-konjugert anti-kanin og either en rød-emitterende fluorofor-konjugert anti-mus eller røde mitterende fluorofor-konjugert anti-geit.
- Vask cellene forsiktig, tre ganger, med ~ 1 ml vaskebuffer per vask, som beskrevet i 3.3.
- Fjerne 12-runde Dekk fra 24 brønners plater ved å forlate ~ 1 ml vaskebuffer i hver brønn, holder platen på ~ 45º, og spaken dekkglass ut av brønnen gulvet med fin pinsett. Dekkglass vil komme til å hvile mot brønnveggen, hvorfra det lett kan fjernes ved hjelp av tang.
- Monter Dekk, celle-side-ned, på objektglass med anti-falming monteringsmedium.
5. Mikroskop Innstillinger
- Ved hjelp av en høy forstørrelse objektiv (100X), først finne en representant celle som skal avbildes med epifluorescence.
- Konfigurer bildeopptaksinnstillinger for å spille inn 8-bits ukomprimert TIFF-bilder av hvert merket kanal (for deteksjon av hver fluorophore brukes f.eks, 488 nm og 594 nm), å avbilde hver kanal sekvensielt (enten ved linje eller ramme), og gjennomsnittlig 4 til 6 søker etter det endelige bildet. Optimal oppløsning vil være mikroskop-spesifikk, men 1024 x 1024 vanligvis gir gode resultater.
- Bytt til det konfokale avbildnings banen og fokus til et z-plan gjennom sentrum av cellen.
- Optimalisere pinhole (vanligvis 1 Airy enhet), laser makt, og fotomultiplikatorrør spenning (gain) og utlignet for hver kanal. Lagre / spille inn disse innstillingene. Bruk de samme objekt innstillinger for avbilding av alle celler merket for hvilken som helst gitt target par i samme replikere.
Merk: Denne prosessen vil vanligvis resultere i en tilstrekkelig fotobleking at denne cellen ikke skal bli avbildet for analyse.
6. Imaging
- Ved hjelp av en høy forstørrelse objektiv (f.eks 100X), først finne en celle som skal avbildes med epifluorescence.
- Bytt til det konfokale avbildnings banen og fokus til et z-plan gjennom sentrum av cellen. Jegf tilgjengelig, bruke programvare zoom / crop å begrense skanneområdet til cellen av interesse.
- Ta bilder for hver merket kanal med de innstillingene som tidligere er etablert. Gjenta trinn 06.01 til 06.03 til bilde 15 eller flere celler per tilstand per replikere for å sikre et tilstrekkelig antall deltakere.
7. colocalization Analyse
- Åpne par bilder (f.eks, "grønn" og "rød") i en celle i ImageJ. Bruk bilde> Farge> Merge Kanaler ... kommandoen for å generere et RGB-bilde.
- Tegn en markering rundt cellen av interesse. Bruk ImageJ plugin "PSC colocalization" (11, tilgjengelig fra https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) å kvantifisere colocalization av målene i den valgte cellen.
- Spill ønsket colocalization tiltaket (typisk Pearsons r 17). Gjenta trinn 7.1 til 7.3 for hver avbildes celle. 8. data Normalisering
- Beregn middelverdien av de registrerte colocalization verdiene av de felles styre forholdene for hvert replikat av hver merking tilstand.
Merk: For eksempel, gjennomsnittet av de colocalization verdier av nevronene i "48-timers kjøretøy, 60-min kjøretøy" medikament tilstand i hver av tre uavhengige replikater på hver av tre merkingsbetingelser (reseptor og hver av tre kamrene). - Multiplisere de midler (-1) for å gi offset for hvert replikere i hver merking tilstand. Legg forskyvningen for hver gjenskape i hvert merking tilstanden til hver colocalization verdi i at replikere.
Merk: Dette vil normalisere dataene slik at middel colocalization mål for felles kontroll tilstanden er 0 i hvert replikat av hvert merking tilstand. - Pool data fra alle replikater av hver merking tilstand.
Merk: Endringer i colocalization kan nå bli analysert over replikater. Statistiske analysis vil avhenge av eksperimentell design, men vil typisk innebære analyse-of-varians (ANOVA) etterfulgt av hensiktsmessige post-hoc tester (f.eks Tukey). For statistiske ressurser, se for eksempel 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne teknikken, er det mulig å kvantifisere endringer i reseptor etterinternhandel følgende både kroniske / langvarig og akutte medikamentell behandling. Etter medikamentelle behandlinger, fiksering og merking, er høyoppløselige tokanals photomicrographs fanget av hver celle av interesse. Representative bilder kan kombineres med falske farger colocalization å generere illustrerende tall (figur 1). Påfølgende colocalizational analyse, som beskrevet, gi kvantitative score til target-target colocalization (f.eks reseptor-kupé markør). Disse dataene kan deretter brukes til å sammenligne endringer i, i dette tilfelle reseptor handel indusert av medikamentbehandling (er) (figur 2).
Figur 1. Representative photomicrographs av reseptor og kupé-markør merking med false-farge colocalization kart. Primære kulturer av dorsal root ganglia sensoriske nevronene ble utsatt for langvarig (48 timer) og akutt (1 time) medikamentelle behandlinger (venstre akse etiketter). Bare én langvarig tilstand vises som representative resultater. Cellene ble deretter immunolabeled for delta opioidreseptorer (DOR) og en markør for resirkulering endosomes (Rab 11) med distinkt primær-sekundær (fluorophore konjugert) antistoff par (topp akseetiketter). Cellene ble fotografert ved to-kanals sekvensiell konfokal mikroskopi (venstre kolonne og midtsøylen). Representative bilder viser de to merkede mål i to nerveceller. En nervecelle ble behandlet med forlenget morfin etterfulgt av akutt kjøretøy (øverst). Den andre nervecellen ble behandlet med forlenget morfin etterfulgt av akutt Deltorfin II (DELT, en DOR agonist, nederst). I tillegg til påfølgende kvantitative colocalizational analyse, ble disse representative bilder behandlet for å generere falske farge colocalization kart (høyre kolonne). Skala barer show 10 mikrometer. Tilpasset fra 12 henhold til bestemmelsene i CC BY-NC 3.0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kvantitative colocalization score kan brukes til å sammenligne endringer i reseptor etterinternhandel. Primære kulturer av dorsal root ganglia sensoriske nevronene ble utsatt for langvarig (48 timer) og akutte (1 time) medikamentelle behandlinger (x-aksen etiketter). Bare én langvarig tilstand vises som representative resultater. Cellene ble deretter immunolabelled for DOR og markører for tidlige endosomer, resirkulering endosomes og lysosomer. Etter bildebehandling colocalization score ble bestemt, normalisert, og samlet over 3-4 uavhengige replikater. Data ble deretter analysert ved to-veis analyse av varians (ANOVA) med Tukey HSD post-hoc. Data er presentert som gjennomsnitt +/- 95% konfidensintervall. * Angir p <0,05. Som det fremgår, denne teknikken tillot identifisering av endringer i DOR post-internhandel indusert av akutt behandling med Deltorfin II, men ikke SNC80 (to forskjellige DOR agonister). Tilpasset fra 12 henhold til bestemmelsene i CC BY-NC 3.0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har optimalisert denne protokollen for analysen av primærkulturer av voksen dorsal root ganglion neuroner (primære sensoriske nevroner). Den kan også brukes, med liten eller ingen modifikasjon, for monolagsbelagt dyrkede celler bredt. Den colocalizational analyse er også mulig i vevssnitt og andre slike preparater 11, men de behandlings og vev fiksering / håndtering av komponenter ville ikke være passende.
Av interesse, kan ICC-metodene som presenteres her også benyttes, med passende fiksering og vevspreparat, for å utføre dobbelt-merket immunhistokjemi i vevssnitt, uavhengig av påfølgende analyse (for eksempel 19).
Denne protokollen er grovt kompatibel med forskjellige merke mål. Hver dekk av belagt cellene vil være dobbelt-merket. Typisk vil dette være for reseptoren av interesse, og en markør for et av kamrene av interesse. Dervil typisk være flere merkingsbetingelser for å undersøke reseptor colocalization med flere forskjellige avdelinger.
Antistoffer er iboende variabel. Passende merking protokoller vil variere mellom ulike antistoffene. Dette inkluderer passende antistoffkonsentrasjoner, buffer oppskrifter, og tidspunkter. Det skal også bemerkes at forskjellige partier av samme antistoffet er best anses å være forskjellige antistoffer. Som sådan bør merkingsmetoder og antistoffspesifisitet bli validert, og om nødvendig optimalisert, for hver kombinasjon av antistoff og målvevet. Metodene som brukes her er et nyttig utgangspunkt. Når validere merking, er det viktig å utføre hensiktsmessige kontroller: Dette omfatter prøvene behandlet uten tilsetning av sekundære antistoffer (for å kontrollere for autofluorescens) og uten primære antistoffer (for å kontrollere for ikke-spesifikk sekundær merking).
Det er mange faktorer som påvirkerutformingen av merkemetoder. Noen betraktninger av note påvirker metodene som presenteres her inkluderer bruk av Tris buffere, hypertont saltvann, polysorbat, BSA, og kaldt fiskeskinn gelatin. Fosfatbuffere kan føre til høyere ikke-spesifikk merking og kan samhandle med noen mindre brukte antistoff-konjugater. Imidlertid, tris-buffere, som nevnt, temperaturfølsom. Hypertoniske saltkonsentrasjoner redusere ikke-spesifikk merking ved å forstyrre ioniske interaksjoner. Det er mulig å ytterligere øke saltkonsentrasjonen utover det som er angitt i denne protokoll, om ønskelig. Polysorbat 20 blir brukt som en forholdsvis skånsom surfaktant / detergent. Dette er foretrukket fremfor Triton X-100, som har blitt rapportert å vesentlig forstyrre eller til og med oppløses, membraner og dermed forvrenge subcellulære struktur. Inkludering av lav konsentrasjon Polysorbat 20 i alle buffere er nyttig for å redusere ikke-spesifikk merking, som det forbedrer den grundighet av vasker. BSA er en vanlig brukt blokkerende middel beregnetå oppta ikke-spesifikke proteinbindingsseter i målvevet. Noen har rapportert at BSA kan aggregere og føre til ikke-spesifikk punktformet merking. Hvis dette problem oppstår, er det mulig å erstatte BSA med ikke-fettholdig tørrmelk eller ekstra kald fiskeskinn gelatin. Cold fiskeskinnet gelatin er et ikke-pattedyrproteinkilden også beregnet på å oppta ikke-spesifikke proteinbindingssteder mens presentere lav reaktivitet til antistoffer rettet mot 20 pattedyrproteiner.
Selv om det ikke er spesifisert i denne protokollen, er det vanlig å legge til, til den blokkerende buffer, normalt serum fra arter som det sekundære antistoff ble hevet. Typiske konsentrasjoner er 1 - 3%. Som omtalt nedenfor, må vare i utvalget arter utvises for å unngå kryssreaktiviteter.
Ved detektering av to eller flere fluoresceinmerkede mål, er spesielt viktig valg av passende kombinasjoner fluoroforen. Det er viktig å ha god spektral SEPArasjon for å unngå krysstale. Videre vil valget av fluoroforer avhenge av konfigurasjonen av mikroskop som skal brukes (som er tilgjengelige filtre, laserlinjer, etc.). Fluorophore-konjugert antistoff leverandører vil tilby råd om de beste kombinasjonene av sine produkter (for eksempel 21). Vi finner 488 nm- og 594 nm-glade fluoroforene å være best pair for dobbel-merking og colocalizational analyse.
Sekundære antistoffer er vanligvis arts reaktiv. Det vil si, de vil merke eventuelle antistoffer produsert av målarten. Dobbel-merking ICC krever derfor at man være forsiktig ved valg av vertsarten av de primære og sekundære antistoffer for å unngå kryss-reaktivitet. For eksempel, hvis primærvalg er oppvokst i kanin og geit, ville det ikke være hensiktsmessig å bruke en geit-hevet sekundær. Hvis antistoff tilgjengelighet ikke tillater slike arter separasjon, er det protokoller tilgjengelig for å oppnå merking med multiple same-verts primære antistoffer (f.eks 22), men vesentlig mer optimalisering og validering bør forventes.
Da denne metoden kvantifiserer colocalization i mikrofotografiene, er det grunnleggende nødvendig at alle mikros være konsekvent, av høy kvalitet, og nøyaktig representative for prøvene avbildes. Dette omfatter både maskinvare som brukes (optikk kvalitet, etc.) og de spesielle fremgangsmåter og parametere valgt. Det er gode ressurser tilgjengelig for veiledning om riktig mikros 23,24, inkludert mikros spesielt for colocalizational analyse 11,17,25.
Selv med betydelig metodisk overlegenhet til visuelle overlegg metoder gir kvantitative mål på colocalization ikke så pent egner seg til produksjon av illustrerende tall for publisering. Slike illustrerende tall er ofte nyttig for leserne og deres fravær kan bli kritisert av reviewers. Vi har funnet ut at inkludering av falske farger 'heatmaps' visual colocalization å være nyttig i å lage figurer. Den ImageJ plugin "colocalization palett" (tilgjengelig fra https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) er nyttig i å generere disse bildene. Det er viktig å merke seg at disse bildene vil være strengt illustrerende i forbindelse med den teknikk som er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra CIHR (MOP394808) og Canada Research Chair å CMCEWO var mottakeren av en Post-Graduate Scholarship fra NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J.
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
