Protocol
Adulte (3-4 mois) sur des souris mâles un mixte C57BL / 6 fond ont été utilisés dans ce protocole. Les animaux ont été maintenus sur un cycle de 12 heures de lumière / obscurité, et ont permis l'accès libre à la nourriture et de l'eau. Toutes les procédures effectuées dans ce protocole ont été menées selon des protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation Drexel University animaux dans les institutions.
1. Préparation zone chirurgicale
- Désinfecter table chirurgicale avec 70% d'éthanol, puis couvrir l'ensemble du banc chirurgicale avec des tampons absorbants et d'organiser les instruments chirurgicaux adjacent à stéréotaxique.
- Mettre en place l'équipement stéréotaxique sans bras manipulateur. Disposer le coussin chauffant sur la stéréotaxique et mettre à 37 ° C. Éviter la surchauffe de l'animal en plaçant un petit morceau de serviette en papier ou un tampon chirurgical entre l'animal et le coussin chauffant.
- Avec des ciseaux autoclave, couper des petits morceaux de gelfoam autoclave dans une boîte de Pétri stérile contenant une solution saline à 0,9% stérile jusqu'à ready à l'emploi.
Remarque: Maintenir un environnement de travail stérile en utilisant des instruments à l'autoclave et des fournitures chirurgicales stériles. Re-stériliser des instruments chirurgicaux au cours de la procédure ou entre les animaux par trempage dans un stérilisateur à billes pendant 10 à 15 secondes, selon les besoins. Maintenir des gants propres tout au long de la procédure en frottant les mains avec de l'éthanol 70%, au besoin, à désinfecter.
2. Prepping souris pour la chirurgie
- Retirer la souris de la maison cage et peser (g).
- Placez la souris dans la chambre de l'induction de l'isoflurane et définir l'oxygène à 2 L / min et du vaporisateur isoflurane à 5 pour induire un plan chirurgical d'anesthésie, environ 3-5 min. Surveiller les ralentissement de la respiration et de l'immobilisation. Vérifiez que la souris est entièrement sous sédation en utilisant le réflexe orteil de pincement.
- Lorsque la souris est entièrement sous sédation, placer dans un cadre stéréotaxique, sécuriser le nez dans le cône de nez, qui est attaché avec des tubes à l'isoflurane. Insérez barres d'oreilles dans le canal auditif et serrer, assurant la tête est stable.
- Raser la tête de l'oreille à l'oreille, et d'entre les yeux derrière les oreilles.
- Stériliser la peau avec des lingettes alternées de l'alcool isopropylique et une solution d'iode bétadine, trois fois chacun.
- Appliquer des larmes artificielles pour les deux yeux pour les empêcher de se dessécher pendant la procédure chirurgicale.
3. Procédure chirurgicale
- Surveiller la profondeur de l'anesthésie en pinçant l'orteil ou la queue. La souris est dans le plan chirurgical approprié lorsqu'il n'y a pas de réponse, et la respiration est lente et uniforme.
- Faire une incision de la peau parasagittale partir juste derrière les yeux à peu près entre les oreilles en un seul mouvement ferme à l'aide d'une lame de bistouri n ° 11. Déplacez la peau de côté et le clip côté droit avec hémostatique.
- Effacer le crâne de la membrane recouvrant utilisant le côté mat de la n ° 11 scalpel et applicateurs coton-tige. Eventuellement, essuyez le crâne avec du coton-tige trempé dans une solution saline à 0,9%. Laisser sécher complètement.
- Nousing une petite règle, marquer le bord antérieur de la craniotomie à 1 mm caudale à la suture coronale, et le bord gauche de la craniotomie à 1 mm latéral à la suture sagittale (Figure 1), avec un marqueur permanent. Ensuite, marquez les bords droit et caudales de la craniotomie à 4 mm des sutures sagittale et coronale, respectivement (figure 1).
- Utiliser un foret de 0,5 mm, commencer à faire craniotomie en perçant lentement en suivant le contour de marqueur permanent. Soyez sûr de ne pas briser le crâne complètement. Appuyez doucement sur la pièce isolée de l'os pariétal avec n ° 5 forceps, les zones de faiblesse cédera à la pression. Lorsque l'os amincie est suffisamment faible tout au long du périmètre, le morceau d'os est prêt à être retiré.
NOTE: Si l'expérience d'enquêteur des difficultés à retirer l'os dans une seule pièce, ce qui suggère que l'os n'a pas été suffisamment éclairci au cours du forage. Considérez le forage du crâne en outre chez les animaux ultérieures facilitaenlèvement facile te de la pièce d'os. - Utiliser une seringue de 10 ml munie d'une aiguille 23 G, appliquer une petite quantité de solution saline 0,9% à tremper l'os isolé et zone percée.
- Fixez le bras manipulateur à l'équipement stéréotaxique. Fixez une nouvelle lame de bistouri n ° 11 à la porte de la sonde avec le côté tranchant de la lame face rostralement.
Remarque: bien que les tissus rostrale et caudale expérience des arêtes vives et émoussée de la lame, respectivement, les dommages mécaniques induites par la blessure pénétrante est comparable tout au long de l'étendue de la lésion. Nous observons aucune différence appréciable dans les grandes caractéristiques de gliose réactive, y compris la régulation positive de l'expression de la GFAP ou la prolifération, entre les sections rostrale et caudale. - Garder le bras manipulateur de la route, soulevez délicatement l'os isolé en utilisant une pince à angle 5/45. Insérez le bout de la pince dans le côté de l'os et un ascenseur isolé, en utilisant l'effet de levier pour retirer le morceau d'os laissés dans un full mouvement.
NOTE: Attention à ne pas poignarder le cerveau ou perturber la dure sous le crâne. - Prenez un petit morceau de la mousse de gel absorbable trempé et le placer sur le cerveau à découvert pour l'empêcher de sécher et absorber le sang qui pourrait être présente.
- Une fois la mousse de gel est en place, balancer le bras manipulateur en place et régler la lame au centre de la craniotomie sur la mousse de gel. Retirez la mousse de gel et abaisser la lame jusqu'à ce que la pointe touche la dure sans perforation de la dure-mère. Mark dorsale / ventrale coordonnées en utilisant le vernier sur le bras vertical de la stéréotaxique.
- Utilisation du bras manipulateur, abaissez lentement la lame précisément 3 mm dans le cerveau. Ceci est réalisé à l'aide des graduations coulisse sur le bras de manipulateur. Laisser la lame de rester en place pendant 5-10 sec. Déplacez le bras stéréotaxique avec l'attachement de lame rostrale à caudale trois fois la lame permettant d'atteindre les limites rostrale et caudale de la craniotomie avant de passer à l 'oppositionte fin.
REMARQUE: La dure-mère est pas éliminé avant l'insertion de la lame. A la différence de la dure-mère chez le rat, qui est d'environ 80 um d'épaisseur 7, la dure-mère de la souris est considérablement plus mince (quelques couches de cellules d'épaisseur) et ne produit pas une résistance appréciable à la lame de scalpel pendant l'insertion. Utiliser une nouvelle lame de scalpel pour chaque souris pour que chaque animal reçoit une blessure cohérente. - Soulevez lentement le bras stéréotaxique, retirer la lame du cerveau. Après le retrait de la lame, placer immédiatement un autre morceau de gelfoam sur la surface du cerveau d'absorber toute l'excès de sang ou de liquide.
- Pendant ce temps, retirez le bras stéréotaxique et de disposer de la lame de bistouri n ° 11. Une fois que le saignement a cessé, retirez le gelfoam.
- Fermer la plaie par suture la peau avec une suture non résorbable, comme Ethilon ou prolène. Sutures doivent être retirés 9-10 jours après la chirurgie.
- Retour de la souris à sa cage, et laissez la souris pour récupérer lentement sur une heatinpad g et moniteur pour des signes de détresse. Récupération de l'anesthésie induite isofluorane-se produit généralement dans les 2-5 min après le retrait de la isofluorane. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait retrouvé décubitus sternale.
- Administrer 0,5-1 ml de lactate sous-cutanée de la solution de Ringer pour assurer une hydratation.
4. Soins post-opératoire
- Surveillez attentivement les animaux post-opératoire jusqu'à la récupération de l'anesthésie avant de retourner à la colonie.
- Pour réduire la douleur et l'inconfort post-opératoire, administrer 0,05-0,1 mg / kg buprénorphine par injection ip immédiatement après la procédure.
- Observez les animaux pendant 2-3 jours après l'opération pour des signes graves de détresse tels que les mouvements limités, absence de toilettage, ou la perte de poids. Euthanasier des animaux qui présentaient une de ces signes de détresse et de retirer de l'étude.
- Pour examiner l'histopathologie des tissus blessés, euthanasier les animaux par stanperfusion intracardiaque dard.
- En bref, anesthésier les animaux avec une surdose de kétamine / xylazine, puis intracardiaque perfusé avec 15 à 20 ml de NaCl à 0,9%, ou jusqu'à ce que le foie est effacé de sang, suivie de 60 ml de paraformaldehyde à 4% à la fin de l'expérience.
- Disséquer le cerveau et post-correctif pour 2-4 heures dans 4% de paraformaldehyde avant de transférer à la solution de saccharose à 30%. Section cerveaux sur un cryostat à 40-60 um, et le processus de procédures histologiques ou immunohistochimiques standard, ou comme décrit dans Garcia 8,9.
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Representative Results
Parce que les animaux soumis à cette procédure ne nécessitent pas de périodes de survie soins post-opératoires spécialisés, à court ou à temps à long terme sont facilement incorporés dans l'étude, en fonction de la nécessité d'étudier la pathologie aiguë ou chronique suite à une blessure. Principales caractéristiques de gliose réactive, tels que la régulation positive de la GFAP et l'hypertrophie du soma, peuvent être observés dès 2-3 jours après la blessure. La phase pic de la prolifération des astrocytes réactifs est pendant les jours suivants 3-5 blessures 10. Les résultats ci-dessous sont représentatives d'animaux qui ont reçu une lésion de coup de couteau sept jours plus tôt.
La morphologie générale et cytoarchitecture du cerveau antérieur après une lésion du cerveau antérieur de couteau peuvent être visualisées par coloration de Nissl (figure 2). Bien que le morceau de lame est la plus importante à travers le centre de la lésion, la cytoarchitecture cortical révèle l'ampleur perturbé rostral et caudal du t endommagéquestion. Astrocytes réactifs peuvent être observés par immunohistochimie pour GFAP (Figure 3). Notez que de nombreux astrocytes corticales ne présentent pas de niveaux détectables de GFAP par immunohistochimie en l'absence de blessure. Toutefois, l'expression GFAP est régulée à la hausse de façon spectaculaire dans le ipsilatéral de l'hémisphère à la blessure tout en restant à des niveaux relativement bas dans l'hémisphère controlatéral (Figure 3), ce qui suggère que les astrocytes réactifs sont limitées à l'hémisphère ipsilatéral. Notez que bien que l'ipsilatéral tissu cortical à la lésion montre une régulation positive marquée de GFAP, d'autres marqueurs astrocytaires, comme S100β sont constitutivement exprimé en l'absence d'une blessure (figure 4), et de maintenir les niveaux d'expression similaires après une blessure (figure 4). En plus d'augmentation de l'expression de la GFAP, astrocytes réactifs subissent hypertrophie cellulaire. Les corps cellulaires et des processus deviennent élargie et montrent une coloration intense pour GFAP (Figure 3).
La prolifération des astrocytes réactifs peut être observé par l'administration de la thymidine analogique, le 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU), ou par immunocoloration pour les marqueurs de prolifération Ki67 ou PCNA. Nous administrons régulièrement 200 mg / kg de BrdU, ip, à des animaux pendant les jours 3-5 après une blessure, le pic de gliose réactive 10 (Figure 3). Cependant, le dosage précis et la synchronisation de BrdU doivent être considérés de manière indépendante pour chaque étude, en gardant à l'esprit que BrdU va marquer de manière permanente les cellules subissant une prolifération, ainsi que leur descendance, au moment de l'administration, mais que les cellules qui entrent dans le cycle cellulaire avant BrdU commence, ou après l'administration de BrdU est terminée, ne sera pas marquée. Dans la figure 4, nous montrons une vaste co-localisation entre GFAP et BrdU à des blessures de poste 1 de la semaine, ce qui indique que de nombreux astrocytes réactifs ont proliféré au cours du temps de l'administration BrdU. Notez que proliferating astrocytes réactifs sont principalement localisées adjacent au noyau de la lésion, alors que les astrocytes réactifs localisés distale à partir du noyau de la lésion sont en grande partie non-prolifération (Figure 4).
Figure 1:. Schématique du crâne de la souris, montrant la zone de la craniotomie lignes bleues représentent les premières marques d'identification des limites de la zone à percer. Les marques haut et gauche sont évalués à 1 mm en dessous ou latéral pour les sutures coronale ou sagittale, respectivement. Les marques de fond et droite sont mesurés à 4 mm par rapport aux sutures coronale et sagittale, respectivement. La craniotomie est effectuée par le forage d'un cercle à l'intérieur des limites marquées (en pointillés), la création d'une craniotomie qui est d'environ 3 mm de diamètre (ligne pointillée). Le schéma est pas à l'échelle.
Figure 2: coloration de Nissl dans toute l'étendue rostral-caudal du volume de la lésion. (A - C) tranches coronales de cerveaux blessés 1 semaine après blessure, montrant l'hémisphère ipsilatéral à la lésion. Encadrés dépeignent des images agrandies des régions encadrées. La piste de la lame est le plus important dans le centre de la lésion, ~ 2,5 mm de Bregma (flèche en B). Notez la cytoarchitecture perturbé corticale (les encarts) dans les sections antérieure (A) et postérieure (C) au centre de la lésion. Barre d'échelle de 500 um, encart, 250 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: strong> Brightfield immunohistochimie pour GFAP 1 semaine après une blessure du cerveau antérieur de couteau. (A - B) images de faible grossissement de GFAP coloration dans la controlatéral (A) et ipsilatéral (B) hémisphères de la même coupe de tissu provenant d'un animal blessé. Le site de la lésion est indiquée en (B), et la région correspondante dans l'hémisphère controlatéral intact est représenté en (A). La barre d'échelle, 100 um. (C - D) des images à fort grossissement de la normale (C) et réactives (D) astrocytes des hémisphères controlatéral et ipsilatéral, respectivement. Notez l'hypertrophie dramatique du corps et les processus de astrocytes réactifs dans la cellule (D), par rapport à (C). La barre d'échelle, 10 um.
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Figure 4: les astrocytes réactifs prolifèrent suite à une blessure du cerveau antérieur de couteau. (A - B) La coloration par immunofluorescence pour BrdU (rouge) et GFAP (vert) dans indemne, contrôle (A) et (B) blessés cerveaux, 1 semaine après une blessure poignarder. (C - D) Immunofluroescent coloration pour BrdU (rouge) et le marqueur astrocytaire S100β (vert) dans le indemne (C) et de blessés (D) hémisphères, 1 semaine après une blessure poignarder. Les animaux ont reçu BrdU au fil des jours 3-5 après la lésion. Notez que de nombreux astrocytes prolifèrent au site de la lésion dans le cortex lésée (B et D, encarts, têtes de flèche), alors que les astrocytes dans le cortex intact ne prolifèrent pas (A et C, encarts). Contre-coloration avec DAPI (bleu). Les barres d'échelle, 100 um, médaillon, 25 um.
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Discussion
Il est essentiel que le crâne ou de la dure sous-jacent ne sont pas endommagés pendant le forage. Utilisez une légère pression pendant le forage pour assurer le crâne est pas percé. En outre, il faut prendre soin tout en soulevant la pièce de crâne pour assurer la dure-mère n'a pas décollé avec l'os.
La blessure du cerveau antérieur de couteau décrit ici des modèles d'une blessure pénétrante au SNC. Bien que moins traduisible cliniquement que les modèles de TBI tels que FPI ou de la CCI, le modèle de lésion du cerveau antérieur de couteau est un outil utile pour un large éventail d'études visant à étudier divers événements biochimiques, cellulaires ou moléculaires déclenchés par une insulte discrète CNS. Bien que les déficits cognitifs ont été rapportés chez des rats, 3 semaines après une blessure bilatérale de couteau 11, il convient de noter que le modèle de lésion de poignarder unilatérale, comme décrit ici, est le mieux adapté pour les études portant sur la réponse cellulaire à une lésion. Aspects fondamentaux de divers processus neuropathologiques, tels que regliose active et la formation de cicatrices peuvent être facilement observés et étudiés. Contrairement aux FPI ou de la CCI qui produisent neuropathologie diffuse et généralisée, l'activation gliale localisée et la pathologie, de faciliter les comparaisons intra-animaux, entre les hémisphères blessés et non blessés. En outre, l'infiltration de cellules méningées dans le SNC au site de la lésion présente une occasion d'étudier les interactions entre ces cellules et les astrocytes réactifs locales. En effet, ces interactions sont essentiels à la formation de tissu cicatriciel, et il a été démontré pour réguler négativement les propriétés permissives d'astrocytes réactifs pour 12 la régénération axonale.
Ici, nous utilisons des procédures immunohistochimiques standard pour démontrer certaines des principales caractéristiques de astrogliose réactive telles que l'hypertrophie des organes et des processus cellulaires, augmentation de l'expression de la GFAP, et la prolifération blessures induites. Notez que bien que les cavités ne sont pas observées chez les souris à 1-2 semaines folmugissement cette procédure, des études sur des rats rapportent la formation de cavités, trois semaines suivant l'accident 11. Les différences dans la neuropathologie entre les souris et les rats sont également observées dans les blessures de la moelle épinière. Considérant que les rats subissent une lésion de la moelle épinière kystes d'exposition ou la formation de la cavité au niveau du site de lésion, de telles cavités ne se forment pas dans les souris 13,14.
La procédure est simple, fiable, facilement reproductible, et nécessite un minimum d'équipement. Il peut être facilement modifié pour réaliser des études de rat ou de souris. En particulier, l'utilisation de ce modèle avec diverses lignées de souris transgéniques ou dans les études pharmacologiques peut fournir un nouvel aperçu des mécanismes de régulation de la réponse à une lésion du système nerveux central. La taille des lésions et la gravité peuvent être modifiées par le réglage de la profondeur de la distance de la lame et Voyage du bras stéréotaxique maintien de la lame pour produire crevaisons discrets plutôt que de lésions mécaniques longitudinales. Ainsi, le coup de poignard modèle de lésion du cerveau antérieur peut servir comme un excellent experimental plateforme avec laquelle d'étudier des aspects spécifiques de diverses réponses neuropathologiques aux blessures.
Blessure de la CNS déclenche une réponse complexe qui est dynamique et multicellulaire 6. En plus d'astrocytes réactifs, les microglies mobiliser rapidement pour phagocyter les débris et d'initier les deux cascades de signalisation pro et anti-inflammatoires 15-18. Microglie et les macrophages activés envahisseurs produisent des cytokines et des chimiokines, la création d'un environnement hostile pour la fonction cellulaire normale et la survie 19-21. La matrice (ECM) des molécules extracellulaires, tels que la chondroïtine sulfate protéoglycane (CSPG), sont produites à partir d'une variété de types de cellules, y compris les astrocytes réactifs et les fibroblastes, et de créer un environnement hostile pour la régénération et la réorganisation structurelle de neurones survivant 22,23. Ici, nous démontrons quelques-unes des principales caractéristiques du astrogliose réactif qui surviennent après un traumatisme du cerveau antérieur de couteau. La régulation positive de f intermédiaireilaments tels que GFAP, la prolifération des astrocytes, et la formation de cicatrice gliale, suivie de remodelage tissulaire subséquente sont facilement évalués en utilisant des procédés immunohistochimiques standard.
Il convient de noter que, bien que certaines caractéristiques de la gliose réactive sont mis en évidence ici, gliose réactive dépend fortement contexte, avec différentes caractéristiques et des profils d'expression génique qui émergent en fonction de la gâchette 24 spécifique. Néanmoins, un certain nombre de propriétés fondamentales concernant la réponse du système nerveux central à des blessures et tentatives de réparation peut être modélisé et étudié dans le cerveau antérieur poignarder tissus lésés. En effet, il a été montré que l'ablation de la prolifération des astrocytes réactifs cible suite à une lésion du cerveau antérieur stab entraîne une augmentation de l'infiltration de leucocytes dans le SNC et l'augmentation de la dégénérescence neuronale, ce qui démontre les propriétés neuroprotectrices des astrocytes réactifs 2. Plus récemment, les astrocytes réactifs isolés après une lésion coup pénétrant, but pas une blessure non-invasive, de démontrer le potentiel de cellules souches neurales in vitro 25,26. Ainsi, le coup de poignard du cerveau antérieur est un modèle de lésion puissant pour étudier un large éventail d'événements biochimiques, cellulaires et moléculaires déclenchés par une blessure au SNC. La facilité et la simplicité de ce modèle de lésion faciliteront d'autres études qui peuvent conduire à de nouveaux aperçus sur la réponse du système nerveux central à des mécanismes de blessures et de réparation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
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