Protocol
混合C57BL / 6バックグラウンド上の成体（3-4ヶ月齢）雄マウスは、このプロトコルで使用しました。動物は、12時間の明/暗サイクルで維持し、食物および水に自由にアクセスさせました。このプロトコルで実行されるすべての手順は、ドレクセル大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行いました。
1.手術領域の準備
- 吸収パッドで全体の外科ベンチをカバーし、定位に隣接する手術器具を配置し、その後、70％エタノールで手術台を消毒。
- マニピュレータアームなし定位装置を設定します。定位の加熱パッドを配置し、37℃に設定してください。動物と加熱パッドとの間のペーパータオルの小片または外科パッドを配置することによって、動物の過熱を防ぎます。
- オートクレーブはさみを使用して、REAまで0.9％滅菌生理食塩水を含む滅菌ペトリ皿にオートクレーブゲルフォームの小片をカット使用するためにDY。
注意：オートクレーブ処理機器および無菌手術用消耗品を使用して滅菌作業環境を維持します。必要に応じて、10〜15秒間ビーズ滅菌器に浸漬することにより、動物の間で処置中または手術器具を再滅菌します。消毒するために、必要に応じて、70％エタノールで手を擦ることによって作業中は清潔な手袋を維持します。
外科2.プレッピングマウス
- ホームケージからマウスを削除し、（g）を量ります。
- 場所イソフルラン誘導チャンバ内にマウスや麻酔の外科的平面、約3〜5分を誘導するために2〜5 L /分およびイソフルラン気化器に酸素を設定します。緩徐呼吸や固定化のために監視します。マウスが完全につま先ピンチ反射を使用して鎮静されていることを確認してください。
- マウスが完全に鎮静されると、イソフルランにチューブが取り付けられているノーズコーンに鼻を確保、定位フレームに配置します。外耳道に耳棒を挿入し、締め、頭が安定して確保します。
- 耳にし、目の間から耳の後ろに耳から頭を剃ります。
- 、イソプロピルアルコール及びベタジンヨウ素溶液のワイプを交互に3回ずつ肌を殺菌。
- 外科手術中に乾燥からそれらを防ぐために、両眼に人工涙液を適用します。
3.手術手順
- つま先や尾をつまんで麻酔深度を監視します。応答がないとき、マウスは、適切な外科的な平面であり、呼吸がゆっくりとさえあります。
- ちょうどほぼ11番手術用メスの刃を使用して、単一の、しっかりした動きで耳の間に、目の後ろから矢状皮膚切開を行います。脇の皮膚を移動し、止血剤で右側をクリップ。
- 11番メスと綿の鈍い側を使用して、上層膜の明確な頭蓋骨は、アプリケーターをひっくり返しました。必要に応じて、0.9％の食塩水に浸した綿先端のアプリケーターで頭蓋骨を拭きます。完全に乾燥することができます。
- 米国小さ な定規をる、1ミリメートルの冠状縫合の尾、および恒久的なマーカーと矢状縫合（ 図1）に対して横1ミリメートル、で開頭の左端に開頭術の前縁をマーク。そして、矢状および冠状縫合、それぞれ（ 図1）から4ミリメートルで開頭術の権利と尾側の境界をマークします。
- 0.5ミリメートルドリルビットを使用して、恒久的なマーカーアウトライン次ゆっくり穿孔することによって開頭を作るために開始します。完全に頭蓋骨を突破しないように注意してください。を押して、優しく第5鉗子で頭頂骨の孤立片に、弱さの領域は、圧力に道を譲るだろう。薄くなった骨が周囲全体に十分に弱い場合、骨片を除去するための準備ができています。
注：調査員が困難一体に骨を除去するが発生した場合、これは、骨が十分に掘削時に間引かれなかったことを示唆しています。 facilita以降の動物で、さらに頭蓋骨をドリル考えてみましょう骨片を容易に除去するTE。 - 23 G針を装着した10mlシリンジを用いて、単離された骨と掘削面積を浸して0.9％生理食塩水を少量を適用します。
- 定位機器にマニピュレータアームを取り付けます。吻方面した刃の鋭い側とプローブホルダに新しい11番手術用メスの刃を取り付けます。
注：吻側および尾側の組織が刃の鋭く尖っていないエッジを経験しているが、それぞれ、貫通損傷によって誘発される機械的な損傷は、病変の程度全体に匹敵します。私たちは、頭側と尾部の間、GFAP発現または増殖のアップレギュレーションを含む反応性神経膠症の主な機能にはかなりの違いを観察していません。 - 邪魔にならないようにマニピュレータアームを保ち、慎重5/45角度のついたピンセットを用いて、単離された骨を持ち上げます。 FUL 1に残さ骨の一部をやってのけるレバレッジを使用して、孤立した骨やリフトの側面に鉗子の先端部を挿入Lの動き。
注：脳を刺すか、頭蓋骨の下に硬膜を乱さないように注意してください。 - 浸した吸収性ゲルフォームの小片を取り、乾燥からそれを防止し、存在する可能性のある血液を吸収するために覆われていない脳に置きます。
- ゲルフォームが適所に配置されると、所定の位置にマニピュレータアームを揺動し、ゲルフォーム上に開頭の中央にブレードを調整します。ゲルフォームを取り外し、先端が硬膜を穿刺せずに硬膜に接触するまで、ブレードを下げます。定位の垂直アームのバーニアスケールを使用してマーク背/腹座標。
- マニピュレータアームを使用して、ゆっくりと脳にブレード正確に3ミリメートルを下げます。これは、マニピュレータアームにバーニヤ目盛りを使用することによって達成されます。ブレードは5〜10秒のための場所に滞在することができます。ブレードはopposiに移動する前に、開頭の吻側および尾側の境界に到達することを可能にする3回尾側するブレード取付吻側に定位アームを移動TE終了。
注：硬膜は、ブレードを挿入する前に除去されていません。厚さ7〜80μmであるラットの硬膜とは対照的に、マウスの硬膜がかなり薄くなっている（わずか数細胞層の厚さ）、挿入時のメスの刃にかなりの抵抗を生成しません。各動物が一貫性の損傷を受けることを確実にするために、各マウスのための新しい手術用メスの刃を使用してください。 - ゆっくりと脳からブレードを取り外し、定位アームを持ち上げます。ブレードを除去した後、すぐに余分な血液や体液を吸収するために、脳の表面にゲルフォームの別の部分を配置します。
- 一方、定位アームを取り外し、11番手術用メスの刃を処分。出血が停止した後、ゲルフォームを削除します。
- このようなethilonまたはプロレンとして、非吸収性縫合糸で皮膚を縫合することによって傷を閉じます。縫合糸は、手術後9-10日に削除する必要があります。
- そのホームケージにマウスを返し、マウスがheatinにゆっくりと回復することができます苦痛の兆候がないかのGパッドとモニター。イソフルラン誘発性の麻酔からの回復は、典型的には、イソフルランから除去した後、2〜5分以内に発生します。それは胸骨recumbancyを取り戻したまで無人動物を放置しないでください。
- 水和を確実にするために乳酸リンゲル液の皮下0.5〜1 mlで管理します。
4.手術後のケア
- 密接植民地に戻る前に麻酔から回復するまで、手術後の動物を監視します。
- 、術後の痛みや不快感を軽減直ちに手順に従って、腹腔内注射により0.05〜0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィンを投与すること。
- このような制限された運動、グルーミングの欠如、または体重減少などの苦痛の重症徴候について術後2〜3日間動物を観察します。苦痛のこれらの兆候のいずれかを実証する動物を安楽死させると研究から取り外します。
- 損傷組織の病理組織学的検査を検討するために、スタンにより動物を安楽死させます準の心臓内灌流。
- 簡単に述べると、ケタミン/キシラジンの過剰摂取で動物を麻酔し、心臓内の0.9％NaCl 15〜20ミリリットルで灌流、または肝臓、実験の終了時に4％パラホルムアルデヒドの60ミリリットル、続いて血液のクリアされるまで。
- 30％ショ糖溶液に移す前に、4％パラホルムアルデヒド中で2〜4時間、脳とポストフィックスを分析。セクション40〜60ミクロンで、クライオスタットの脳、および標準的な組織学的または免疫組織化学的手順による処理、またはガルシア8,9に記載されているように。
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Representative Results
この処置を受けた動物は、専門的な術後のケアを必要としないので、短期または長期の時間の生存期間は容易に損傷後の急性または慢性の病状を調査する必要性に応じて、試験に組み込まれています。このようなソーマのGFAPおよび肥大のアップレギュレーションのような反応性神経膠症の主要な特徴は、早ければ、損傷後2〜3日のように観察することができます。反応性星状細胞のための増殖のピーク位相は、傷害10次の日3-5中です。以下に示す代表的な結果は7日早く刺し傷病変を受けた動物からのものです。
前脳刺し損傷後の前脳の一般的な形態および細胞構築はニッスル染色（ 図2）によって可視化することができます。ブレードトラックが病変の中心を通して最も顕著であるが、破壊された皮質細胞構築は、損傷を受けたTの吻側および尾側の程度を明らかに問題。反応性星状細胞は、GFAP（ 図3）のために免疫組織化学によって観察することができます。多くの皮質星状細胞は、傷害の非存在下でのGFAPの免疫組織化学的に検出可能なレベルを示さないことに注意してください。対側半球（ 図3）において比較的低いレベルで維持しながら、しかし、GFAP発現は劇的に反応性星状細胞は、同側半球に制限されていることを示唆し、負傷半球同側に上方制御されます。病変への皮質組織の同側はGFAPの顕著なアップレギュレーションを示しているが、このようなS100βなど、他の星状細胞のマーカーは、構成的に損傷が存在しない（ 図4）で表され、損傷（ 図4）は、以下の同様の発現レベルを維持していることに注意してください。増加したGFAP発現に加えて、反応性星状細胞は、細胞の肥大を受けます。細胞体とプロセスが（拡大となり、GFAPのための強い染色を示し、図3）。
反応性星状細胞の増殖、または増殖マーカーであるKi67またはPCNAの免疫染色により、チミジン類似体、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）を投与することによって観察することができます。私たちは日常的に200ミリグラム/ kgのBrdUを、損傷後の日3-5中の動物に腹腔、反応性神経膠症のピーク10（ 図3）を管理します。しかしのBrdUの正確な投与量およびタイミングは、独立したBrdUを永続的に投与時に、増殖を起こしている細胞、ならびにそれらの子孫をラベルすることを念頭に、各研究のためと考えられるが、すべきことは、BrdUの前に細胞周期に入る細胞開始、またはBrdUの投与が完了した後、マークされません。 図4では、私たちは多くの反応性星状細胞は、BrdUの投与の時間経過の間に増殖していることを示す、1週間後の負傷でGFAPとのBrdUの間に大規模な共局在を示します。そのPRに注意してくださいoliferating反応性星状細胞は、反応性星状細胞は、病変のコアから遠位にローカライズされたのに対し、主に、病変コアに隣接してローカライズされた、主に非増殖（ 図4）されています。
図1：マウスの頭蓋骨の図、開頭術の面積を示す青い線は、地域の境界を特定する初期マーキングを掘削することが示しています。上部と左のマークは、それぞれ、以下の1ミリメートルで測定または冠状又は矢状縫合の側方にしています。下と右のマークは、それぞれ、冠状および矢状縫合から4ミリメートルで測定されます。開頭術は、直径（破線）で約3 mmの開頭術を作成する、顕著な境界（点線）内の円を掘削することによって行われます。回路図は、縮尺通りではありません。
図2：病変体積の吻側-尾側全体にニッスル染色 。 （A - C）病変に半球の同側を示す損傷した脳の冠状切片を1週間後損傷、。挿入図は箱入りの領域の画像にズーム示します。ブレードトラックはブレグマから病変、〜2.5ミリメートル（Bの矢印）の中心に最も顕著です。病変中心にセクション前方（A）と後部（C）において破壊皮質細胞構築（インセット）に注意してください。スケールバーは500μm、インセット、250ミクロン。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3： strong>の前脳刺し損傷後のGFAP 1週間明の免疫組織化学 。 （A - B）負傷した動物からの反対側（A）におけるGFAP染色と同側（B）は、同じ組織切片の半球の低倍率画像。病変部位は、（B）に示され、そして無傷の対側半球の対応する領域（A）に示されています。スケールバーは100μm。 （C - D）は、それぞれ通常の高倍率画像（C）と対側と同側の半球からの反応性（D）アストロサイト、。 （C）と比較して、細胞体および（D）中の反応性アストロサイトのプロセスの劇的な肥大を、注意してください。スケールバーは10μm。
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図4：反応性星状細胞は、前脳刺し損傷後の増殖 。無傷の、コントロール（A）及び損傷（B）脳、刺し、損傷後1週間でのBrdUのための免疫染色（赤）およびGFAP（緑） - （B A）。 （C - D）のBrdUのためImmunofluroescent染色（赤）とアストロサイトマーカーS100β（緑）非損傷（C）で負傷した（D）半球、刺し、損傷後1週間。動物は日3-5損傷後の上にBrdUを受けました。無傷の皮質のアストロサイトは、（AとC、インセット）を増殖していないのに対し、多くの星状細胞は、損傷した皮質（BとD、インセット、矢じり）での損傷部位で増殖していることに注意してください。 DAPI（青）と対比。スケールバーは100μm、インセット、25ミクロン。
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Discussion
それは、頭蓋骨や、基礎となる硬膜を掘削中に損傷していないことが重要です。頭蓋骨がパンクされていないことを確認するために掘削しながら、軽い圧力を使用してください。硬膜が骨にリフトオフされていないことを確認するために頭蓋骨片を持ち上げながら加えて、注意が必要です。
前脳刺し損傷はこちらCNSへの浸透傷害モデルを説明しました。このようなFPIやCCIなどTBIモデルよりも少ない臨床的に翻訳可能なものの、前脳刺し病変モデルは、様々な生化学を調査することを目的とした研究、携帯電話、または個別のCNS傷害によってトリガー分子事象の広い範囲のための有用なツールとして機能します。認知障害は、3週間の両側性スタブ11損傷後、ラットで報告されているが、片側刺し病変モデルことに留意すべきである、ここに記載されるように、損傷に対する細胞応答に対処する研究に最適です。このような再などの様々な神経病理学的プロセスの基本的な側面、アクティブグリオーシスおよび瘢痕形成が容易に観察され、研究され得ます。拡散し広範囲の神経病理を生成FPIまたはCCI、ローカライズされたグリア活性化および病理学とは対照的に、イントラ動物の比較を容易にし、負傷し、無傷の半球間。また、病変部位でのCNSへの髄膜細胞の浸潤は、これらの細胞とローカル反応性星状細胞間の相互作用を調査する機会を提供します。実際に、このような相互作用は、瘢痕組織の形成において重要である、負軸索再生12に反応性星状細胞の寛容な性質を調節することが示されています。
ここでは、そのような細胞体およびプロセスの肥大、増加したGFAP発現、および傷害誘導増殖のような反応性アストログリオーシスの主要な機能のいくつかを示すために、標準的な免疫組織化学的手順を使用します。空洞は1〜2週間でマウスで観察されていないがFOLことに注意してくださいこの手順を牛の鳴き声、ラットを用いた研究では、空洞形成、傷害11次の3週間を報告しています。マウスおよびラットの間の神経病理の違いはまた、脊髄損傷で観察されます。脊髄損傷の展示嚢胞または病変部位での空洞形成を受けたラットのに対し、このような空洞は、マウス13,14で形成されません。
手順は、単純な信頼性の高い、容易に再現可能であり、最小限の設備を必要とします。これは、簡単に、ラットまたはマウスの研究を実行するように修正することができます。具体的には、様々なトランスジェニックマウス系統を伴うまたは薬理学的研究では、このモデルの使用は、損傷に対するCNS応答を調節するメカニズムに新たな洞察を提供することができます。病変のサイズおよび重症度は、離散的な穿刺なく縦機械的損傷を生成するためにブレードを保持する定位固定アームのブレードと走行距離の深さを調整することによって変更することができます。したがって、前脳刺し損傷モデルは、優れたエクスペリとして機能することができます負傷して様々な神経病理学的応答の特定の側面を研究するとLプラットフォーム。
CNSへの傷害は、ダイナミックで6多細胞である複雑な応答を引き起こします。反応性星状細胞に加えて、ミクログリアは、破片を貪食し、プロおよび抗炎症性シグナル伝達カスケード15-18両方を開始するために迅速に動員します。活性化ミクログリアと侵入マクロファージは、正常な細胞機能および生存19-21のための敵対的な環境を作成、サイトカインおよびケモカインを産生します。このようなコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）のような細胞外マトリックス（ECM）の分子は、反応性星状細胞および線維芽細胞などの細胞型の様々なから製造され、ニューロン22,23の生存再生及び構造的再組織化のための敵対的な環境を作成しています。ここでは、前脳刺し損傷後に発生する反応性アストログリオーシスの主要な機能のいくつかを示しています。中間体Fのアップレギュレーションその後の組織の再構築に続いて、このようなGFAP、星状細胞増殖、およびグリア瘢痕形成などilamentsは、容易に標準的な免疫組織化学法を用いて評価されています。
これは、反応性神経膠症の一部の機能がここで強調しているが、反応性神経膠症が変化する機能と特定のトリガー24に応じて出現する遺伝子発現プロファイルと、非常に文脈に依存することに留意すべきです。それにもかかわらず、損傷および修復の試みに対するCNS応答に関する基本的なプロパティの数は、組織病変前脳刺しでモデル化し、研究することができます。実際に、前脳穿刺損傷はCNSへの白血球浸潤の増加につながり、反応性星状細胞2の神経保護特性を実証する、神経変性の増加を次の反応性星状細胞増殖の除去を標的することが示されています。最近では、反応性星状細胞は、貫通刺し病変、b。次の単離されましたUTない非侵襲的損傷は、 インビトロ 25,26 における神経幹細胞の可能性を示します。したがって、前脳刺しは、CNSへの損傷によって引き起こさ、生化学的な細胞および分子事象の広い範囲を研究するための強力な損傷モデルです。この損傷モデルの使いやすさとシンプルさは、損傷および修復メカニズムの中枢神経系の応答に新たな洞察につながる可能性がさらに研究を促進します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
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