Protocol
1. Vorbereitung Materialien
- Herstellung von 10 mM HEPES-Puffer. Den pH-Wert auf 7,0 bei RT und fügen NaCl auf 0,9%.
- Bereiten Sie 5% Alginat-Lösung und 10 mM EDTA-Lösung durch Mischen von HEPES-gepufferte Kochsalzlösung in 1.1 vorbereitet. Man stellt den pH auf 7,0 bei RT.
- Autoklaven werden die Reagenzien (1.1, 1.2) für 20 Minuten bei 121 ° C.
- Vorbereitung Gelatine beschichteten 60 mm-Schalen mit 1,2 geschichtet - 2,0 × 10 6 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Zellen, die als Feeder-Zellen durch Inkubation in DMEM, das 10% ES-qualifizierte FBS und 10 ug / ml Mitomycin C für 90 behandelt werden, - 120 min.
- Aufrechterhaltung der Maus induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Zellen auf der Schale mit der Feeder-Zellen in Gegenwart von 5 ml DMEM mit hohem Glucose mit 20% ES-qualifizierte FBS, 50 uM 2-Mercaptoethanol, nicht-essentielle Aminosäure und Antibiotika ( 100 Einheiten / ml Penicillin G Natrium, 100 & mgr; g / ml Streptomycinsulfat, und 250 ng / ml amphotericin B).
- Seed 4 x 10 5 Zellen auf einer iPS Gelatine beschichteten 60 mm-Schale und inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Sie das Kulturmedium täglich während der Inkubation. Nach 3-4 Tagen Kultur trypsinize Zellen für 1 min mit 500 ul 0,05% Trypsin, enthaltend 0,02% EDTA bei 37 ° C und 5% CO 2. Danach lösen Zellen durch Antippen der Kulturschale zehnmal.
- In 2,5 ml DMEM mit 10% der ES-qualifizierte FBS und Antibiotika (nach Dissoziation Maus iPS-Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren mit 1000 ul Mikropipette dreimal) Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 3 min und entfernen Überstand und zählen Sie die Zellen . Nach Zellzählung, ein erneutes Seeding der gesammelten Zellen auf einem mit Gelatine beschichtete Schale und Inkubation für 30 min, um die iPS-Zellen aus den MEF-Zellen zu isolieren. Nach dem Zählen der Zellen (in der Regel 1 bis 3 x 10 6 Zellen / Schale gesammelt werden kann), reseed 4 × 10 5 Zellen auf iPSder Teller.
2. Zell Encapsulation in Alginat-Hydrogel-Kapseln
- Sammeln Sie die Zellen, die durch in 1.5 und 1.6 beschrieben das gleiche Verfahren. Nach der Zentrifugation bei 160 × g für 3 Minuten, waschen Sie die iPS-Zellpellet mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung dreimal. Nach Resuspendieren der Zellen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, Filtern der Zellsuspension durch ein 40 & mgr; m Zellsieb um große Aggregate, die andernfalls die Düse verstopfen können.
- Mix 2 ml der Zellsuspension in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung und 3 ml 5% Alg-Na-Lösung. Schließlich 5 ml Zellsuspension innerhalb von 3% Alg-Na-Lösung erhalten wird. Zelldichte ist wünschenswerterweise mehr als 10 6 Zellen / ml.
- Nach dem Sammeln der Zellsuspension in eine 5-ml-Spritze, installieren Sie eine koaxiale Düse (1A, B) auf der Spritze und setzen Sie sie auf Spritzenpumpe. Emit N 2 -Gasstrom (niedriger als 1 l / min) durch die äußere Nadel des koaxialen Düse undvertreiben die Zellsuspension durch die innere Düse.
- Sammeln Tröpfchen in 250 ml einer 0,5% CaCl 2 -Lösung und warten 10-20 min zur Gelbildung unter Rühren bei 60-90 Umdrehungen pro Minute.
3. Behandlung von Alginat-Kapseln (optional)
- Alg-Ca Kapseln Inkubieren in 0,05% (w / v) Poly-L-Lysin (PLL) Lösung für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nach dem Waschen der Kapseln mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, inkubieren in DMEM enthaltend 10% FBS, um die elektrische Ladung auf ihrer Oberfläche zu neutralisieren. Nutzen sie als überzogene Kapseln (Abbildung 1c).
- Inkubieren der Kapseln in HEPES-gepufferter Salzlösung, enthaltend 10 mM EDTA für 5 min. Die EDTA-behandelten Kapseln sind als Hohlkapseln (1C) eingesetzt.
4. Kultur und sammeln Zellen in Alginat-Kapseln
- Die eingekapselten Zellen mit 75 UpM mit inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 Schüttelnfür 10 Tage.
- Sammeln und inkubieren der Kapseln in 10 mM EDTA bei 37 ° C und 5% CO 2 für 10 min. Sammeln Zellen aus den Alginatkapseln ohne PLL-Behandlung durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 3 min.
- Wenn Alginat Kapseln mit PLL behandelt, brechen die Alg-PLL Membran durch Auf- und Abpipettieren rund zehnmal mit einer Nadel an einer Spritze und Zentrifuge es bei 1000 angebracht - 5.000 × g für 5 min. Nadeldurchmesser sollte niedriger sein als Kapselgröße und 25 g (260 & mgr; m) Nadeln werden in diesem Experiment verwendet werden (600 um)
- Nach dem Zentrifugieren sammeln Zellpellet strikt von gebrochenen Alg-PLL-Membranen, wenn Sie mRNA Proben von Zellen zu sammeln möchten. Verbleibende Alg-PLL Membranen möglicherweise verhindern, dass mRNA Reinigung.
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Representative Results
Bei Protokoll 2.5, die vertrieben Alginat-Lösung bildet sofort eine Kugelform nach Vertreibung (2A - H). Wenn die Suspension mit einer N 2 Durchflussrate von weniger als 1 l / min ausgestoßen, der Größe der Tröpfchen einheitlicher (2I). Wenn die N 2 -Strom größer ist als 1 l / min, unterbricht jedoch die Tröpfchen unten (Figur 2G, weiße Pfeile) und die Größe der Tröpfchen heterogen (2J). Angesichts dieser Tatsache ist es schwierig, Tröpfchen kleiner als 500 um unter Verwendung dieses Verfahrens herzustellen.
Gelieren Verfahren (Protokoll 2.4), Alg-Na gebildeten Tröpfchen Kugelform Alg-Ca Kapseln in CaCl 2 -Lösung, wenn die Konzentration von Alg-Na (mehr als 3%) genügt (3E-H, K, I). Allerdings niedrige Konzentration von Alg-Na (unter 3%) bewirkt nicht sphärischen und nicht-glatte Form von Kapseln (3A-D, I), dieein Problem in Beschichtungsverfahren. Auch wenn Alg-Na-Konzentration ist nicht genug, können kugelförmige Kapseln durch Erhöhung CaCl 2 -Konzentration (3J) gebildet werden. Etwa 50 mM CaCl 2 ist jedoch für die Verkapselung geeigneten da eine zu hohe Konzentration von CaCl 2 nimmt das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit (Daten nicht gezeigt). Nach dem Fallenlassen in CaCl2-Lösung, gegebenenfalls die Sie für ein paar Minuten zum Gelieren warten können, aber wir empfehlen, Kommissionierung bis Kapseln von CaCl 2 -Lösung, weil zu lange Inkubation in CaCl 2 wirkt manchmal das Zellwachstum. Manchmal erhalten Sie nicht-kugelförmige Kapseln, selbst wenn die Konzentrationen sind genug. Das liegt wahrscheinlich daran Waschen zelluläre Pellet ist nicht genug, vor resuspendieren Zellen in Alg-Na-Lösung. Restreagenzien wie Serum möglicherweise verhindern, Gelieren.
Eingekapselten Zellen können in den Kapseln aber zellulären Leck wachsen (siehe Pfeil in Fig4A) können in Kapseln ohne Alg-PLL-Beschichtung (4A) auf. In dem Fall von Maus-iPS bilden die Zellen scheibenförmige Aggregate jeweils Alg-Ca Kapsel (4B), während die Zellen zusammenklumpen und bilden einzelne sphärische Aggregate in jedem Hohlkapsel (4C). Anfängliche Zelldichte hat keinen Einfluss auf die Größe der Aggregate in Kapseln, aber niedrige Zelldichte (10 5 Zellen / ml Gel) bewirkt, dass das Versäumnis, erwachsen zu werden (Daten nicht gezeigt). Somit ist 10 6 Zellen / ml Gel wünschenswert, einzukapseln.
Beim Sammeln von Zellen, die aus Kapseln, können Alg-Ca Hydrogel mit Alginat-Lyase oder Chelatisierungsreagenzien gelöst werden, obwohl die Alg-PLL-Beschichtung schwierig ist, mit Enzymen oder Chemikalien aufzulösen. Alg-PLL ist daher physikalisch Pipettieren aufgeteilt werden, zum Beispiel. Gebrochene Membranen können aus den Zellen durch Zentrifugation getrennt werden.
Abbildung 1. Bilder Encapsulation System und Kapseln. (A) Ein Bild von der Kapselung System für Alg-Ca Verkapselung auf eine saubere Bank. (B) Schematische Darstellung einer koaxialen Düse zur Kapselung. (C) Die drei verschiedenen Arten von Kapseln in diesem Bericht erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Wirkung des N 2 Durchfluss auf die Morphologie der Kapseln kontinuierlichen Bildern (A - H). Und Aussehen (I, J) der Tröpfchenbildung von 3% Alg-Na-Lösung aus einer koaxialen Düse in N 2fließen bei 1 l / min (A - D, I) und 2 l / min (E - H, J). Kontinuierliche Bilder wurden von hallo-Speed-Kamera eingefangen. Hydrogel Kapseln werden in 0,5% CaCl 2 ausgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Wirkung der Alg-Na und CaCl 2 -Konzentration auf die Morphologie der Kapseln kontinuierlichen Bildern (A - H). Und Aussehen (I - L) des Alg-Na Tröpfchen geliert in CaCl 2 -Lösung. In kontinuierlichen Bildern, Tröpfchen mit unterschiedlicher Konzentration Alg-Na, 2% (A - D) und 3% (E - H), werden in 50 mM CaCl 2 Lösung geliert. Kontinuierliche Bilder sind hallo erfasst-Blitzer. Optik-Bilder zeigen die morphologische Differenz Alg-Ca Kapseln durch unterschiedliche Konzentrationen der Alg-Na, 2% (L, j) und 3% (K, L) und CaCl 2, 50 mM (L, K) und 500 mM gebildet (J, L). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Figur 4. Morphologie Encapsulated Maus iPS Zellaggregate in den Kapseln Schliffbilder von iPS-Zellen Aggregate für 4, 6, 8 und 10 Tage lang kultiviert (1 - 4 jeweils) in drei verschiedenen Arten von Kapseln: (A) nackt ( B) beschichtet ist, und (C) Hohlkapseln. Bitte klickenSie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Encapsulation Kultur kann mit direktem Suspensionskulturen verglichen werden. Suspensionskultur ist eine einfachere Methode, um große Mengen von pluripotenten Stammzellen als Einkapselungsverfahren erhalten. , Steuerung der Aggregation von Zellen in Suspensionskultur ist jedoch immer noch eine Herausforderung. Im Verkapselungsverfahren wird Zellaggregation in Kapseln beschränkt und kann daher gut kontrolliert werden. In einer früheren Publikation zeigte, dass eingekapselten Zellen gebildeten Aggregate von einheitlicher Größe, während große Zellklumpen in einem Freisuspensionskultur 7 erschienen. Darüber hinaus zeigte eine frühere Bericht, dass starke Unruhe verursacht Zelltod in direkten Suspensionskulturen von PS-Zellen; macht es erforderlich eine begrenzte Bewegungsgeschwindigkeit. Im Gegensatz dazu ist die Kapselung in der Lage, Zellen von Scherbeanspruchung auch bei Suspensionsbedingungen zu schützen. Die Kapselung Methode ermöglicht daher eine Flexibilität in den Betriebsbedingungen, wenn wachsende Zellen in Suspension.
ove_content "> Encapsulation ist ein nützliches Tool sowohl für die Stammzellforschung sowie Änderung der Massenproduktion. Die Verkapselung von Stammzellen ist sinnvoll, in der Erforschung der Stammzellnische, einschließlich der extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren. Einige Forscher haben nachgewiesen, dass die Verkapselung von Maus-ES-Zellen in VEGF-konjugierte Agarose Hydrogele förderte die Differenzierung von Zellen in die Blutvorläuferzellen 8.Dieser Artikel zeigt, wie der Maus iPS-Zellen in Größe gesteuerten Alg-Ca Kapseln kapseln einfach mit koaxialen Düse und einem N 2 -Strom. Obwohl es einige Verkapselungsverfahren mit verschiedenen Werkzeugen, wie peristaltische Pumpe 9 und elektrische Spannung 10 ist die Verkapselung unter Verwendung von N & sub2; -Fluß eine einfachere und sicherere Methode als andere Verfahren. Außerdem können mit diesem Verfahren kleiner (ungefähr grßer als 600 um) Kapseln als das Verfahren mit Schlauchpumpe zu bilden(Ungefähr grßer als 3 mm). Große Kapseln nehmen Sie längere Zeit zum Gelieren vollständig und lange Inkubation in CaCl2 möglicherweise beeinflusst Zelleigenschaften. Weiterhin großen Kapseln möglicherweise auch ein Problem des Stoffübergangs der Nährstoff oder Abfall, wie Glucose und Sauerstoff. Daher ist die Größe der Kapseln durch N 2 -Strom (600 -1000 um) gebildet ist ideale Größe, um Zellkultur innerhalb.
Diese Methode ist nicht geeignet, um kleine Kapseln herzustellen und präzise zu steuern, die Größe. Wegen der Aufteilung der Tröpfchen ist dieses Verfahren nicht geeignet, um Kapseln von kleiner als 500 um herzustellen. Außerdem sind nur die visuelle Beobachtung können die Größe der Kapseln zu bestimmen, ist es daher schwierig, die Größe der Kapseln, die durch dieses Verfahren zu steuern. In diesem Fall ist die Verwendung von Mikrofluidvorrichtungen können möglicherweise diese Probleme 11 zu lösen. Allerdings tritt manchmal Verstopfung in Kleinst weil Alg-Na Gele unmittelbar nach Erfüllung CaCl2 solutIon.
Obwohl Alginat ist nicht geeignet für die chemische Modifikation wegen ihrer hohen Viskosität ist es in der Lage Hybridkapseln mit Hydrogel, das, wie PEG, ist auch schwierig, für die Einkapselung zu bilden. In einer früheren Publikation zeigte, dass die Einkapselung von iPS-Zellen der Maus in einer RGD-Peptid-konjugierten PEG-Alg Hybrid-Hydrogel-Kapsel verbessert das Zellwachstum 12. Ohne chemische Modifikation würde die Verkapselung von Zellen in nur Hydrogel-Kapseln erwartet, dass die Stammzellnische durch Halte sezerniert Faktoren verändern. Tatsächlich bisherigen Forschung gezeigt, dass die sezernierten Wachstumsfaktoren, in einem Mikrobioreaktor gehalten, waren wirksam bei der Kontrolle der Stammzell Schicksal 13,14.
Die Sammlung von Zellen, die aus Kapseln ist nach wie vor ein ungelöstes Problem in Bezug auf die Anwendung der Verkapselung Methode auf die Massenproduktion von pluripotenten Stammzellen. Ein früherer Bericht zeigte, dass die PLL-Beschichtung ist notwendig, keep Maus iPS-Zellen innerhalb 7. Wenn Alg-Ca-Hydrogel-Kapseln sind mit einem Polykation, wie PLL (Protokoll von 3,1 bis 3,2) beschichtet ist, wird es schwierig sein, die Kapseln entweder durch Enzym oder Chelatisierungsreagenzien brechen. In diesem Fall ist ein mechanisches Verfahren, wie Pipettieren von der Nadel erforderlich (Protokoll 4.3). Die gesammelten Zellen können aus gebrochenen Membranen bei Zentrifugation größer als 5.000 × g isoliert werden, obwohl Zentrifugation möglicherweise Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen aufgrund des hohen G-Kraft. Somit ist eine Technik der sanft Entfernen von Trümmern aus den Zellen als auch das Brechen der Kapseln in den Entwicklungs Verkapselungstechnologie wichtig. Obwohl einige weitere Entwicklung ist erforderlich, um diese Methode, um die Massenproduktion von Zellen gelten, ist die Kapselung eine vielversprechende Technik sowohl für die Massenproduktion und Stammzellenforschung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
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