Introduction
1973年以来、マウスにおける腎移植モデルは、貴重な研究ツールとなっているが、技術的な問題は、その広範な使用を妨げてきました。年間でいくつかの論文は、この手順の改善/改良を詳細に公開されています。主に血管新生した固形臓器移植のモデルとして、この手順は、また、1973年6でラッセルの研究所で考案された異心臓移植モデルにおそらく秒です。どちらのモデルも、同種異系拒絶反応、遅延移植片機能の開発に検索するには自分自身を貸しますそして、虚血再灌流障害。
腎臓移植に報告するための最も一般的な問題の一つは、我々はまた、我々の研究室で経験した動脈血栓症4,5,7の比較的高い発生率です。そこで我々は、血栓形成の文献レビューを行い、場合によっては、この技術的な問題の原因を見つけるために着手したとも考案します可能な解決策。血栓症の最も可能性の高い原因は、血液がドナー腎動脈の上、次にドナー腎大動脈に、受信者の大動脈から取り多少曲がりくねった道です。この経路は、血小板活性化および血栓形成を引き起こし得る、腎動脈の乱れを引き起こします。最近の観察と関連文献8-14の検索に基づいて、我々は0％に血栓症を減少させた新しい技術を思い付きました。
ここに記載の技術は、施設は、血流を改善し、動脈ヒールアンドトウカフの形成以前に報告の手法によって異なると著しく血栓形成を減少させます。カフ未満45 O大動脈（ 図1Aおよび1B）の長手方向軸に対してある角度で、腎動脈口の面を横切る赤外線の腎動脈を分割して形成されています。この長さは約2ミリメートルカフをもたらします。静脈カレルパッチをrを横断することによって形成されますIVCにエナール静脈ことにより、カフの直径を増加させます。赤外線腎ドナー腹部大動脈ヒールアンドトウカフは、レシピエントの腹部大動脈およびドナー腎静脈/ IVCパッチに吻合端側である受信者の腹部下大静脈（IVC）に吻合端側であります。尿管は、その後に導入され、Hanら3に記載されているように、膀胱に固定されます。
この研究のためにのみ温虚血時間（ すなわち 、ノー冷たい虚血）で処理されていない移植が比較されます。この場合、暖かい虚血は、レシピエント（ステップ以下2.11）、ドナーの腎臓を通る血流の停止（以下ステップ1.11）、および移植片の再潅流からの時間を指します。冷虚血は、腎臓を灌流されていないインプラント手順の開始まで冷蔵で維持される時間を指します。
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Protocol
全てのマウスは、ジャクソン研究所（バーハーバー、メイン州）から購入し、NIHガイドラインとコロラド州デンバーIACUCの大学の承認を得て応じコロラド州デンバー、バーバラ・デイビス・センター動物施設の大学で病原体を含まない条件下で飼育しました。
1.ドナー腎臓収穫
- 、すべての楽器を滅菌手順を通して滅菌手袋を着用し、無菌領域を維持します。手術用顕微鏡を用いて、すべての手術を行ってください。
- 外科ペントバルビタール麻酔（60mgの/ kgのIP）のドナーからのマウスドナーの腎臓を削除します。つま先ピンチによって麻酔の深さを確認し、呼吸数を観察します。
- 4ウェイの制約により、マウスを固定化後、ファークリップ。ポビドンヨードで皮膚を準備し、無菌の方法で、マウスを羽織ります。
- 2cmの正中線垂直腹部切開を行い、腹腔を入力してください。上方腸を撤回し、それを外部化胸の上。手順を通して無菌湿ったガーゼに包まれた腸を保管してください。
- 大きな腹部の血管を識別し、それらを動員、任意の腰椎枝を特定し、焼灼または10/0ナイロン縫合糸でそれらを連結のいずれか。
- 左腎血管へのすぐ遠位約2ミリメートル以上の鈍的切開によって離れて下大静脈（IVC）と腹部大動脈（AA）をいじめます。 10/0ナイロンで結紮し、腎血管から小動脈および静脈枝を分けます。
- 今これらの構造の鈍的切開によって慎重に腎動脈から腎静脈を分離。これは、受信者IVCに端側吻合を形成するために使用される腎静脈の近位端にカレルパッチの正確な作成を可能にします。
- 特定し、ライゲーションし、左副腎血管を分割します。これは、副腎大動脈へのアクセスを許可し、6-0絹縫合糸を結紮の準備のために大動脈の周りに配置されますが、この時点で結ばれていません。 周囲フェーシャから腎臓、血管および尿管を動員。右と連結するために腎臓を回す/任意の後方分岐を分けます。その後、左に腎臓を返します。
- 今尿管に注意を向けます。腎門部を乱すことなく、尿管、血管を維持するために世話をして、周囲のfaciaから尿管を解放します。精管のレベルで尿管を分割します。腎臓は現在回復するための準備ができました。
- ゆっくりと、それによってドナーをheparinizing遠位IVCへのヘパリン300単位を注射します。副腎AAの周りに配置され、6-0絹縫合糸を下に結ぶとヘパリン生理食塩水（100 U / ml）を0.8ミリリットル遠位腹大動脈を介して、左腎臓を灌流。
- 灌流は静脈カレルパッチを作成して停止した後はすぐに腎臓に逆流を排除します。 AAと下の腎動脈を明らかにし、腎臓に向かって腎静脈を撤回。
- 腎動脈に隣接する大動脈かかととするの作成を分割図1に示すように、電子カフ。ドナーから腎臓、血管および尿管を外します。
- 移植時まで事前に準備された受信者（0分冷 虚血時間）に直接腎臓を削除するか、事前に決められた時間のための最適なソリューションで4 O℃で保存しました。 exsanguanationと頸椎脱臼によってドナーを安楽死させました。ドナー腎臓を回復するための合計時間は約です。 15〜20分。
2.腎臓インプラント技術
- ペントバルビタールでレシピエントマウスを麻酔（60mgの/ kgのIP初期投与量、25mgの/ kgのIP補足用量必要な場合）。つま先ピンチによって麻酔の深さを確認し、呼吸数を観察します。 4ウェイの制約により、マウスを固定化し、眼に眼軟膏を適用し、その後の毛皮をクリップ。ポビドンヨードで皮膚を準備し、無菌の方法で、マウスを羽織ります。
- 2cmの正中線垂直腹部切開を行い、腹腔を入力してください。腸を撤回上方と胸へ外部化。手順を通して無菌湿ったガーゼに包まれた腸を保管してください。
- このとき、右腎摘出を行います。 6-0絹縫合糸で腎動脈と静脈を結紮。縫合糸に腎遠位を切り出します。 6-0絹糸で尿管を結紮した後、腎臓の近位に分割します。
- 腎血管下の腹部大動脈と下大静脈（IVC）を分離します。吻合部位に比べて劣っその後大動脈の周りに4-0綿の絆を置き、IVCが優れました。 10-0ナイロン縫合糸でフィールド内の任意の腰椎血管を識別し、連結。
- コットンネクタイ、優れ続く最初の劣る結び目。このように、いくつかの血液が大動脈切開を作るより簡単に大動脈内に保持されています。
- 大動脈の内腔を入力するように30G針を用いて大動脈切開を形成します。約2ミリメートルの長さを微マイクロハサミで切開を拡張します。
- ドナー大動脈ヒールアンドトウカフの端部から側部に到る吻合を作ります以下の方法で受信者の大動脈。ドナー大動脈および受信者の大動脈とネクタイの切開部の下角に10-0ナイロン縫合糸滞在ステッチを配置します。
- ドナー大動脈と腹部大動脈とネクタイの切開部の優れたコーナーの最初の反対の第2の10-0ナイロンを配置します。大動脈の側壁に劣るよりも優れてから実行している縫合線を作成し、以前に配置された滞在ステッチに対して結びます。そして、実行中のファッションやタイで内側壁を縫合。
- 以下の方法で受信者IVCへのドナー腎静脈の端部から側部に到る吻合を行います。 30G針でIVCを穿刺し、細かいマイクロハサミで切開を拡張します。 10-0ナイロンでIVCの切開部の下位隅にドナー腎静脈を接続します。腎静脈と下大静脈とタイの間で実行されている縫合線を作成します。
注：これは、完全な厚さは、血管adventit含む縫合針の通過することも極めて重要ですIAと内膜が達成されます。エッジの裏返しにもシールと吻合の治癒を助ける内膜ツー内膜の接触があることを保証します。止血凝固剤が漏れを減少させるために有用であることができるが、我々は、外科医が代わりに良い技術に依存していることをお勧めします。 - 吻合は「クリーン」であることを確認してください。それはステッチを配置する際に、対向壁がキャッチされていないこと、です。これは失敗した移植片および後肢麻痺に極端な例になりますことを流す重要な収縮を引き起こします。
注：別の極めて重要な要因は、吻合縫合線のテンションも最適であることを保証することです。緩すぎると不可逆的な漏れ、きつすぎるとなります流れるように狭窄があるでしょう。動脈側の場合は混雑した腎臓はなり静脈側の場合、これが、移植片の不十分な灌流になります。 - 静脈の流れを再確立遠位4-0綿のネクタイをリリース。静脈の止血たら私たちの吻合は、近位4-0綿のネクタイを緩め、止血のために動脈吻合を観察徐々に観察されています。
- 両方の吻合が安全と見なされているいったんマウスから綿の関係を削除します。ピアース二つの穴を作成し、20G針で膀胱。
- 貫通孔を湾曲した鉗子の先端を通過し、2 10-0ナイロン縫合糸で膀胱壁に固定されて尿管の近位端とピンセットで膀胱を介してドナー尿管を引っ張ります。尿管が膀胱内に撤回し、2 10-0ナイロン縫合糸で穴を閉鎖することを可能にする第二の孔から突出した尿管の余分な長さをトリミング。
- 腹部に腸を返します。実行中のファッションで5-0シルク縫合糸を使用して2つの層で腹壁を閉じます。
- 決算時に輸液蘇生などの腹部に滅菌、温かい生理食塩水1.0mlのボーラスを管理し、通常の生理食塩水を皮下術後の0.8ミリリットルを注入。他のsupportiありませんVEの対策は手術中に必要とされます。
- 温暖化の毛布の上に動物を回復します。総インプラント時間は約です。 35〜45分。このような手順の開始時と72時間後のオペアンプごとに6〜12時間でブプレノルフィン、0.05ミリグラム/キログラム、SC、0.1〜0.2ミリリットルとして鎮痛剤を投与します。
3.対側腎摘出術
- プロトコル要件に応じて、数日間は、インプラント手順の後に、イソフルラン麻酔下で対側腎摘出（誘導のための5％吸入イソフルラン、メンテナンスのための1.5から2.0パーセント）を行います。
- 腹腔を入力して、優しく、動物の右に腸を撤回。周囲の筋膜から左腎臓と鈍い解剖を公開します。
- 6-0絹縫合糸で腎動脈、静脈および尿管を結紮した後、縫合糸の上に腎臓を切除し、腎臓を削除します。総手術時間は約です。 10分。
4.グラフト評価
- メジャー血清creatiアルカリ性ピクリン酸法（ヤッフェ反応）を使用して9。
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Representative Results
この手術法は、単純な移植片生存/拒絶の研究、または非常に複雑な実験プロトコルのいずれかを可能にします。以下の図では、この改良された動脈吻合の技術を使用することの利点を実証します。この技術を用いて、我々は著しく生産性を増加させる0％と35％の動脈血栓症の発生率を減少させました。我々は維持し、同じ0％血栓症の結果で1年以上のためにこの技術を使用している。 図1は、この新しい技術の基本である動脈ヒールアンドトウカフを形成するための方法を説明します。このカフは長く吻合や腎臓へのまっすぐな血流路のために用意されています。これらの点の両方により血小板活性化および血栓形成の可能性を低減著しく小さく乱流が生じます。
2.免疫組織化学的分析を図。 （A）、過ヨウ素酸シッフは対照の非TRAのセクションを染色しますnsplanted腎臓。（B）改訂技術を使用してPOD 8で同系腎移植は、明確な細胞質と細胞の中央に円形の光核に、直方体のある通常の近位尿細管細胞を、示しています。そこ軽度の刷子縁損傷（矢印）の証拠があるが、ブラシの境界線の大半は、通常のとよく保存されています。倍率：400倍。
二つの技術の間の血栓症の発生率と暖かい虚血時間の表1の比較。すべての値は平均値±SDとして表しました。単一比較のために、正規分布データは対になっていない、両側スチューデントt検定を用いて評価され、非正規分布データは、ノンパラメトリック不対マンホイットニーU検定によって分析します。 0.05未満のP値を、統計的に考慮されるsignificanトン。
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Discussion
この移植技術をマスターすることは困難であるが、一度それは非常に強力な研究ツールで達成しました。患者外科医/研究者は小さな動物モデルでそれ以上に、任意の外科的手技を習得するための鍵である、細部および技術の整合性に注意することによって報われる。マウスの腎臓移植をマスタリングの技術的な問題は、多くのひだであり、それは他の小動物の移植モデルでの経験は、この手順に取り組む前に獲得しなければならない可能性が高いです。
それは吻合が「クリーン」であることを確認することが重要であり、特許ルーメンを維持するために、ステッチを配置するとき、すなわち、反対側の血管壁はキャッチすることはできません。それ以外の場合はその流れにかなり狭窄が存在することになる可能性が高い結果よりも失敗した移植片で、極端な場合に麻痺し、手足を後肢につながります。これは、完全な厚さは、縫合針の通過することも極めて重要ですこれは、シールと吻合の治癒を助ける内膜ツー内膜の接触があることを確実にエッジの適切evertionその結果として血管外膜と内膜を含む、達成されます。止血凝固剤が漏れを減少させるために有用であることができるが、我々は、外科医が代わりに良い技術に依存することをお勧めします。
また、注意が吻合縫合線の張力を確保に支払わなければならない、あまりにも緩い最適で、タイトな減少の流れに、不可逆的な漏れが存在することになるとなります。動脈側の場合は混雑した腎臓はなり静脈側の場合、これが、移植片の不十分な灌流になります。この正しいテンションを達成することは大きな支援になります練習や他の小動物の微小血管モデルと経験の問題です。細部への技術と揺るぎない注目のすべての一貫性の上に優れたマウスおよび移植片の生存、および腎臓移植の機能が得られます。
T ">この手法の限界は、研究者によって適用することができます使用することによってのみ支配される。任意の微小血管の手順と同様に、限り良い技術が結果が再現可能であるべき観察されます。この技術を用いて、動脈血栓症の発生率が大幅に低減されています。これは、コスト削減と生産性の向上で、その結果、使用可能なデータに潜在的な技術的障害から変換されるすべての腎臓移植の少なくとも3分の1になります。
完全に血管新生し、同所移植モデルとして将来のアプリケーションは拒否/公差研究、遅延移植片機能および虚血/再灌流傷害のメカニズムの調査の現象が含まれます。
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Acknowledgments
この作品は1R03DK096151によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
