Introduction
Siden 1973 nyretransplantasjon modellen på mus har vært et verdifullt forskningsverktøy, men tekniske problemer har hindret utbredt bruk. Gjennom årene flere artikler er publisert detaljering forbedringer / forbedringer til denne prosedyren. Som en modell av primært vaskulariserte solid organtransplantasjon denne prosedyren er trolig andre bare til heterotop hjertetransplantasjon modell som også ble utviklet av Russell laboratoriet i 1973 seks. Begge modellene egner seg til forskning på allogene avvisning reaksjoner, utvikling av forsinket organfunksjon og iskemi reperfusjonsskade.
En av de vanligste problemene som skal rapporteres med nyretransplantasjon er den relativt høy forekomst av arteriell trombose 4,5,7 som vi også opplevde i vårt laboratorium. Derfor setter vi ut for å utføre en litteraturgjennomgang av trombedannelse og muligens finne årsaken til dette tekniske problemet, og å også tenke ut enmulig løsning. Den mest sannsynlige årsaken til blodpropp er den noe kronglete sti blodet tar fra mottakeren aorta, inn i donor nedsatt aorta deretter videre til donor nyrearterien. Denne banen bevirker turbulens i nyrearterien, som kan lede til blodplateaktivering og trombedannelse. Basert på de siste observasjoner og et søk av relevant litteratur 8-14 kom vi opp med en ny teknikk som har redusert trombose til 0%.
Teknikken som er beskrevet her, varierer fra tidligere rapporterte teknikker i dannelsen av en arteriell hæl-og-tå mansjett som anlegg forbedret blodstrøm og reduserer trombedannelse. Mansjetten er dannet ved å dele den infra-nyre aorta over flaten av renal arterielle ostium i en vinkel mindre enn 45 o til lengdeaksen av aorta (figur 1A og 1B). Dette resulterer i en mansjett omtrent 2 mm i lengde. En venøs Carrel patch er dannet av transecting renal vene inn i IVC og dermed øke diameteren av mansjetten. IR-nyre donor abdominale aorta hæl-og-tå mansjetten er ende-til-side anastomoseres til mottakeren abdominal aorta og donor nyrevenen / IVC patch er ende-til-side anastomoseres til mottakeren abdominale vena cava inferior (IVC) . Ureter blir deretter innført i og forankret til blæren, som beskrevet av Han et al tre.
For denne studien ubehandlede transplantasjoner med varm iskemi eneste ganger (ie., Ingen kald ischemi) er sammenlignet. I dette tilfellet varm ischemi refererer til tiden fra opphør av blodstrømmen gjennom nyrene donor (trinn 1.11 nedenfor) og reperfusjon av graftet i mottakeren (trinn 2.11). Cold iskemi henviser til den tid som nyrene ikke er perfunderes og holdes i kald lagring inntil begynnelsen av implantasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble kjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og ble holdt under patogen frie forhold ved University of Colorado Denver, Barbara Davis Senter Animal Facility ifølge NIH Retningslinjer og med godkjenning av University of Colorado Denver IACUC.
1. Donor Nyre Harvests
- Sterilisere alle instrumenter, slitasje sterile hansker hele prosedyren og opprettholde et sterilt felt. Utføre alle operasjoner ved bruk av et operasjonsmikroskop.
- Kirurgisk fjerne mus donor nyrer fra pentobarbital-bedøvd (60 mg / kg IP) givere. Fastslå dybde av anestesi ved tå-klemme, og observere respirasjonsfrekvens.
- Klippet pelsen så immobilisere musen ved 4-veis begrensninger. Forbered huden med povidon-jod og drapere musen i en steril måte.
- Lag en 2 cm midtlinje vertikal abdominal snitt og skriv bukhulen. Trekke tarmen overlegent og externalize detpå brystet. Hold tarmen innpakket i sterile fuktig kompress gjennom hele prosedyren.
- Identifisere de store mageårene og mobilisere dem, identifisere eventuelle lumbale grener og enten cauterize eller ligate dem med 10/0 nylon sutur.
- Umiddelbart distal til venstre nyrearterier erte inferior vena cava (IVC) og abdominal aorta (AA) i filler av stump disseksjon i løpet av ca. 2mm. Ligere med 10/0 nylon og dele små arterielle og venøse grener av nyrearterier.
- Nå skille nyrevenen fra nyrearterien forsiktig ved stump disseksjon av disse strukturene. Dette gir mulighet for nøyaktig etablering av en Carrel lapp ved den proksimale enden av den renale vene, som vil bli brukt til å danne en ende-til-side anastomose for å mottakerne IVC.
- Identifisere, ligate og dele venstre adrenal fartøy. Dette gir adkomst til suprarenal aorta og en 6-0 silkesutur anbringes rundt aorta i forberedelse for ligering, men ikke er bundet på denne tiden. Mobilisere nyrene, fartøy og ureter fra omkringliggende dashbord. Roter nyre til høyre og ligate / dele noen posteriore grener. Deretter returnerer nyrene til venstre.
- Nå rette oppmerksomheten mot ureter. Uten å forstyrre nedsatt hilus frigjøre ureter fra omkringliggende dashbord ta vare å bevare de ureteric fartøy. Dele ureter på nivå med de ductus deferens. Nyrene er nå klar for å utvinne.
- Sakte injisere 300 enheter av heparin inn i bortre IVC dermed heparinisering donor. Tie ned til 6-0 silkesutur anbringes rundt suprarenal AA og perfuse venstre nyre via den distale abdominale aorta med 0,8 ml av heparin saltoppløsning (100 U / ml).
- Når perfusjon har opphørt å lage en venøs Carrel patch umiddelbart for å eliminere tilbakestrømning inn i nyrene. Kjør inn renal venen mot nyrene avslørende AA og nyrearterien under.
- Fordel aorta ved siden av nyrearterien å skape en hæl og tile mansjett som vist i figur 1. Fjern nyre, fartøyer og ureter fra donor.
- Fjern nyrene direkte til en pre-forberedt mottaker (0 min kald iskemi tid) eller lagret ved 4 o C i en løsning av valg for en forhåndsbestemt tid før tidspunktet for implantasjon. Avlives givere etter exsanguanation og halshugging. Total tid å gjenopprette donor nyre er ca. 15-20 min.
2. Kidney Implant Technique
- Bedøve mottakeren mus med pentobarbital (60 mg / kg IP initial dose, 25 mg / kg IP supplerende dose hvis nødvendig). Fastslå dybde av anestesi ved tå-klemme, og observere respirasjonsfrekvens. Klippet pelsen så immobilisere musen ved 4-veis støtter og gjelder oftalmisk salve til øynene. Forbered huden med povidon-jod og drapere musen i en steril måte.
- Lag en 2 cm midtlinje vertikal abdominal snitt og skriv bukhulen. Trekk inn tarmenoverlegent og externalize på brystet. Hold tarmen innpakket i sterile fuktig kompress gjennom hele prosedyren.
- På denne tiden utfører en riktig nephrectomy. Ligate nyrearterien og venen med 6-0 silkesuturer. Eksisere nyre distalt for sting. Ligere ureter med 6-0 silke og deretter dele proksimalt til nyrene.
- Isolere abdominal aorta og vena cava inferior (IVC) under nyrearterier. Plasser 4-0 bomullsbånd rundt aorta og IVC overlegen da dårligere til anastomosestedet. Identifisere og ligate eventuelle lumbale fartøy innenfor feltet med 10-0 nylon sutur.
- Knute bomull bånd, først dårligere etterfulgt av den overlegne. På denne måten kan noe blod holdes i aorta gjør aortotomy enklere.
- Danner aortotomy med en 30G nål å gå inn i lumen av aorta. Utvid snittet med fine mikro saks til en lengde på ca 2 mm.
- Gjør slutt på side anastomose av donor aorta hæl-og-tå mansjettenmottakeren aorta på følgende måte. Plasser en 10-0 nylon sutur opphold sting i donor aorta og til dårligere vinkel av snittet i resipienten aorta og slips.
- Sett en annen 10-0 nylon motsatt den første i donor aorta og den overlegne hjørnet av snittet i hovedpulsåren og slips. Lag en kjører sutur linje fra overlegen til dårligere i sideveggen av aorta og knytte mot tidligere plassert opphold sting. Deretter sutur mediale vegg i en løpende mote og slips.
- Gjør slutt på side anastomose av donor nyrevenen til mottakeren IVC på følgende måte. Punktere IVC med en 30G nål og forlenge snittet med fine mikro saks. Knyt donor nyrevenen til dårligere hjørnet av snittet i IVC med 10-0 nylon. Lag en kjører suturlinje mellom nyrevenen og IVC og slips.
MERK: Det er også viktig at full tykkelse går av sutur nål inkludert vaskulær adventitIA og intima er oppnådd. Eversion av kantene sikrer også at det er intima-til-intima kontakt, som hjelpemidler i tetting og helbredelse av anastomoser. Mens en hemostatisk clotting agent kan være nyttig for å redusere lekkasjer, anbefaler vi at en kirurg i stedet stole på god teknikk. - Pass på at anastomoser er "ren". Det vil si at de motsatte vegger ikke er fanget når du plasserer masker. Dette vil føre til en betydelig innsnevring til å flyte som vil resultere i en mislykket pode og i ekstreme tilfeller til baklabb lammelse.
MERK: En annen svært viktig faktor er å sikre at spenningen i anastomotisk sutur linjer er også optimal. For løst, og det vil være irreversible lekker, strammer og striktur å strømme vil medføre. Hvis på den arterielle siden dette vil resultere i dårlig perfusjon av transplantatet, hvis på den venøse side en overbelastet nyre vil medføre. - Slipp distal 4-0 bomull tie reetablere venøs flyt. Når hemostase av pulmonaloss anastomose har blitt observert gradvis løsne den proksimale 4-0 bomull uavgjort og observere arteriell anastomose for hemostase.
- Fjern de bomullsbånd fra musen når begge anastomoser anses sikker. Pierce blæren med en 20 G nål lage to hull.
- Passerer spissene buede tang gjennom hullene og trekk donor ureter gjennom blære med pinsett med den proksimale enden av ureter forankring til blæreveggen med to 10-0 nylon suturer. Trim overskytende lengde av ureter som stikker ut fra det andre hullet slik at ureter til å trekke seg tilbake i blæren og lukke hullet med to 10-0 nylon suturer.
- Returner tarmen til magen. Lukk bukveggen i to lag ved hjelp av 5-0 Silk sutur i en løpende mote.
- Administrere en 1,0 ml bolus sterilt, varm vanlig saltvann inn i magen som væske gjenoppliving ved lukking, og injisere 0,8 ml fysiologisk saltvann subkutant postoperativt. Ingen andre supportiDet kreves ve tiltak under operasjonen.
- Gjenopprette dyret på en varmende teppe. Total implantat tid er ca. 35-45 min. Administrere smertestillende som for eksempel buprenorfin, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml i begynnelsen av prosedyren og hver 6-12 timer for 72 timer post-op.
3. Kontralateralt nephrectomy
- Avhengig av protokollkrav, flere dager etter implantasjonen, utføre en kontralateral nephrectomy henhold isoflurananestesi (5% inhalert isofluran for induksjon, 1.5-2.0% for vedlikehold).
- Tast bukhulen og trekke forsiktig tarmen til dyrets høyre. Expose venstre nyre og sløv dissekere fra de omkringliggende fascia.
- Ligate nyrearterien, vene og ureter med 6-0 silkesuturer og deretter skjære nyrene over sting og fjerne nyren. Total operative tid er ca. 10 min.
4. Graft Assessment
- Mål serum kreativtni ved hjelp av den alkaliske metode pikrat (Jaffe reaksjon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne kirurgiske teknikken gjør det mulig for enten enkle pode overlevelse / avvisning studier, eller ganske komplekse eksperimentelle protokoller. I figurene nedenfor viser vi fordelene med å bruke denne forbedrede arteriell anastomose teknikk. Ved hjelp av denne teknikken vi har betydelig redusert forekomst av arteriell trombose fra 35% til 0% og dermed øke produktiviteten. Vi har brukt denne teknikken i over ett år med samme 0% trombose resultat opprettholdes. Figur 1 beskriver fremgangsmåten for dannelse av den arterielle hæl-og-tå mansjett, som er grunnlaget for denne nye teknikken. Denne mansjetten gir en lengre anastomose og en rettere blodstrømningsbane inn i nyrene. Begge disse punktene resulterer i betydelig redusert turbulens for derved å redusere sannsynligheten for blodplateaktivering og trombedannelse.
Figur 2. Immunohistokjemisk analyse. (A) perjodsyre-Schiff farget snitt av et styre ikke-transplanted nyre. (B) En syngen nyretransplantasjon ved POD 8 ved hjelp av reviderte teknikken demonstrerer normale proksimale tubulære celler, som er cuboidal, med et klart cytoplasma og en rund lett kjerne i midten av cellen. Det er bevis for mild børste grensen skade (piler), men de fleste pensel grenser er vanlig og godt bevart. Forstørrelse: 400x.
Tabell 1. Sammenligning av trombose forekomst og varme iskemi ganger mellom de to teknikkene. Alle verdier uttrykt som gjennomsnitt ± SD. For enkelt sammenligninger, er normalt fordelt data vurderes ved hjelp av uparede, to-tailed Student t-tester, og data som ikke-normalfordelt analyseres ved den ikke-parametriske uparet Mann-Whitney U-test. P-verdier på mindre enn 0,05 er ansett statistisk significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maste dette transplantasjon teknikken er vanskelig, men når oppnådd det er en svært kraftig forskningsverktøy. Pasienten kirurg / forsker vil bli belønnet med fokus på detaljer og konsistens av teknikk, som er nøkkelen til å mestre alle kirurgiske inngrep, enda mer i små dyremodeller. De tekniske vanskelighetene med å mestre mus nyretransplantasjon er mange folder, og det er overveiende sannsynlig at erfaring i andre små dyr transplantasjons modeller må oppnås før takle denne prosedyren.
Det er viktig å sikre at de anastomoser er "ren", dvs. de motsatte vaskulære veggene må ikke bli fanget når du plasserer masker for å opprettholde et patent lumen. Ellers vil det være betydelig innsnevring til å flyte som vil mer enn sannsynlig resultat i en mislykket pode og i ekstreme tilfeller føre til hind-lem lammelse. Det er også viktig at full tykkelse går av sutur nål inkludert vaskulær adventitia og intima er oppnådd som dette resulterer i riktig evertion av kantene som sikrer at det er intima-til-intima kontakt som hjelpemidler i tetting og helbredelse av anastomoser. Mens en hemostatisk clotting agent kan være nyttig for å redusere lekkasjer, anbefaler vi at en kirurg i stedet stole på god teknikk.
Også oppmerksomhet må betales til å sikre spenningen i anastomotisk sutur linjer er optimal, for løs og det vil være irreversible lekker, stram og redusert vannføring vil medføre. Hvis på den arterielle siden dette vil resultere i dårlig perfusjon av transplantatet, hvis på den venøse side en overbelastet nyre vil medføre. Å nå dette riktig spenning er et spørsmål om praksis og erfaring med andre små dyr mikrovaskulære modeller vil være til stor hjelp. Fremfor alt konsistens av teknikk og urokkelig fokus på detaljer vil gi utmerket mus og graft overlevelse, og nyretransplantasjon funksjon.
t "> De begrensningene i denne teknikken er styrt bare av bruksområdene som kan brukes av utprøver. Som med alle mikrovaskulær prosedyre, så lenge god teknikk er observert resultatene skal være reproduserbar.Forekomsten av arteriell trombose ved hjelp av denne teknikken har blitt drastisk redusert. Dette resulterer i minst 1/3 av alle nyretransplantasjoner blir konvertert fra potensielle tekniske feil til brukbare data, noe som resulterer i reduserte kostnader og økt produktivitet.
Som et fullt vascularized, orthotopic transplantasjon modell fremtidige søknader vil inkludere avvisning / toleransestudier, fenomenet forsinket organfunksjon og undersøkelser i mekanismene for iskemi / reperfusjon skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
