Abstract
Zwangerschap wordt gekenmerkt door de infiltratie van leukocyten in de reproductieve weefsels en de maternale-foetale interface (decidua basalis en decidua parietalis). Deze interface is de anatomische plaats van contact tussen moeder en foetale weefsels; Daarom is het een immunologisch werkingsplaats tijdens de zwangerschap. Infiltreren leukocyten bij de moeder-foetale-interface spelen een centrale rol in de implantatie, zwangerschap onderhoud, en de timing van de levering. Daarom zal fenotypische en functionele karakteriseringen van deze leukocyten inzicht in de mechanismen die leiden tot zwangerschap stoornissen. Verscheidene protocollen zijn beschreven om te isoleren infiltrerende leukocyten uit de decidua basalis en decidua parietalis; echter, het gebrek aan consistentie in de reagentia, enzymen en tijden van incubatie is het moeilijk deze resultaten te vergelijken. Hierin beschreven is een nieuwe benadering die het gebruik van zachte mechanische en enzymatische diss combineertociation technieken om de levensvatbaarheid en integriteit van extracellulaire en intracellulaire markers in leukocyten geïsoleerd uit menselijke weefsels op de maternale-foetale-interface behouden. Afgezien van immunofenotypering, celcultuur en celsortering, de toekomstige toepassingen van dit protocol zijn talrijk en gevarieerd. Na dit protocol kan de geïsoleerde leukocyten worden gebruikt om DNA-methylering, expressie van doelwitgenen in vitro leukocyten functionaliteit (dat wil zeggen, fagocytose, cytotoxiciteit, T-celproliferatie en plasticiteit, etc.), en de productie van reactieve zuurstofsoorten te bepalen de maternale-foetale interface. Bovendien, met behulp van de beschreven protocol, dit laboratorium is in staat om nieuwe en zeldzame leukocyten te beschrijven op de maternale-foetale-interface geweest.
Introduction
Zwangerschap vertoont drie verschillende immunologische fasen: 1) implantatie en vroege placentatie geassocieerd met pro-inflammatoire respons (bijv implantatie lijkt op een open wonde "); 2) het tweede trimester en de meeste derde trimester van de zwangerschap wanneer immuunhomeostase wordt bereikt door een overwegend anti-inflammatoire staat in het maternale-foetale interface; en 3) de bevalling, een pro-inflammatoire staat 1-7. Immune cellen spelen een belangrijke rol in de regulatie van de ontstekingsreactie bij de moeder-foetale interface waar hun overvloed en lokalisatie veranderingen tijdens de zwangerschap 6-9.
Bij de mens, de moeder-foetale-interface vertegenwoordigt een gebied van direct contact tussen de moeder (decidua) en foetale (chorion of trofoblast) weefsels. Deze interface bevat: 1) de decidua parietalis die lijnen de baarmoederholte niet onder de placenta en naast elkaarhet chorion laeve; en 2) de decidua basalis, gelegen in de basale plaat van de placenta indien het wordt aangevallen door interstitiële trofoblasten 10 (figuur 1). De intimiteit van deze gebieden van contact schept voorwaarden voor de foetus antigene blootstelling aan de maternale immuunsysteem 11-13. Niet verrassend, leukocyten bevatten tot 30-40% van de deciduale cellen 8,9,14,15 in aanvulling op de typische stromale-type cellen en kliercellen 8,14,16. De rol van leukocyten bij de moeder-foetale-interface omvat meerdere processen dat de beperking van trofoblastinvasie 17, herinrichting van spiraal arteriën 18,19, het onderhoud van maternale tolerantie 12,20, en initiatie van arbeid 21-26 bevatten. Leukocyten van zowel het adaptieve en aangeboren onderdeel van het immuunsysteem, dat wil zeggen, T-cellen, macrofagen, neutrofielen, B cellen, dendritische cellen en NK-cellen, geïdentificeerd in de deciduale weefsel en deverhoudingen en activatie toestand werden aangetoond in ruimte en tijd variëren gedurende dracht 6-10,12,14,24,27-30. Verstoringen in de leukocyten populatie en / of functie worden geassocieerd met spontane abortus 31, 32 pre-eclampsie, geboortegewicht 32,33 en vroeggeboorte 7,24. Daarom zal de studie van de fenotypische kenmerken en functionaliteit van leukocyten op menselijk maternale-foetale interface van de opheldering van de immunologische pathways verstoord bij zwangerschap stoornissen vergemakkelijken.
Een van de meest krachtige hulpmiddelen gebruikt om het fenotype en de functionele eigenschappen van leukocyten te bepalen wordt flowcytometrie technologie die de kwantitatieve analyse van meerdere parameters tegelijkertijd 34-36 toelaat. Leukocyten door middel van flowcytometrie geanalyseerd, wordt isolatie van de leukocyten in een enkelvoudige celsuspensie vereist. Daarom is een werkwijze te scheiden infiltreren leukocytes van de maternale-foetale interface komen hun fenotypische en functionele eigenschappen te bestuderen.
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven om leukocyten te isoleren uit de humane maternale-foetale-interface 10,14,25,27,37-39. Terwijl sommige van toepassing mechanische uitsplitsing 10,25,27,38, anderen gebruiken enzymatische afbraak 37,40 voor weefsel dissociatie. Omdat mechanische disaggregatie opbrengst wel lager en verminderde levensvatbaarheid 41 en enzymatische dissociatie kunnen levensvatbaarheid en celoppervlaktemarker retentie 42 invloed op de hierin beschreven methode combineert zachte mechanische dissociatie met enzymatische voorbehandeling om de opbrengst van geïsoleerde leukocyten verhogen zonder afbreuk cellevensvatbaarheid. Een soortgelijke combinatie van methoden is aangetoond effectief bij het isoleren van leukocyten uit het deciduale weefsel van de maternale-foetale-interface 39 zijn. Daarom is het hierin beschreven protocol omvat mechanisch disaggregatie met een automatische weefsel dissociator dat consistentie verhoogt terwijl bespaart tijd en arbeid in vergelijking met de traditionele hakken met tegengestelde scalpels, scheermesjes, of chirurgische schaar 10,28. De gekozen voor weefsel dissociatie enzym was Accutase. In tegenstelling tot veel gebruikte collagenase 43, dispase 44 en trypsine 45, Accutase (een cel onthechting oplossing) combineert zowel algemene proteolytische en collagenolytische activiteiten die bijdragen aan een efficiënte en toch zachte dissociatie 46,47. Na dissociatie, worden de leukocyten verrijkte van de totale bevolking van de decidua cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie. Verschillende dichtheidsgradiënt media zijn eerder toegepast, de meest voorkomende daarvan zijn Percoll (een suspensie van colloïdale silicadeeltjes) 48 en Ficoll (een polymeer van sucrose met een hoog molecuulgewicht synthetisch) 49. De superieure efficiency van isolatie door de sucrose polymeer previo geweestusly getoond 50 en de hierin verder beschreven protocol bewijst dat deze dichtheidsgradiënt media produceert een voldoende hoge zuiverheid van mononucleaire leukocyten.
Vandaar dat de hierin beschreven protocol combineert de mechanische weefsel disaggregatie met automatisch dissociator weefsel, enzymatische digestie met een mobiele onthechting oplossing en leukocyten scheiden met een dichtheidsgradiënt media (1,077 + 0,001 g / ml) om leukocyten uit menselijk deciduale weefsel te isoleren. Is bewezen dit protocol om celoppervlakantigenen behouden samen met levensvatbaarheid van de cellen. De geïsoleerde leukocyten kan worden gebruikt voor meerdere toepassingen immunofenotypering met flowcytometrie en functionele studies in vitro omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is geschikt voor leukocyt los van de decidua basalis en decidua parietalis ter voorbereiding immunofenotypering met flowcytometrie. Verder kunnen de geïsoleerde cellen worden gebruikt voor celsortering, celkweek, RNA-isolatie en cytologie. Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet de mens ethische goedkeuring worden verkregen van de lokale Research Ethics Committee en Institutional Review Boards. De verzameling en het gebruik van menselijke monsters voor onderzoeksdoeleinden werden goedgekeurd door de Institutional Review Boards van de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), ministerie van Volksgezondheid en Human Services (DHHS , Bethesda, MD, USA) en Wayne State University (Detroit, MI, USA). Schriftelijke toestemming is verkregen van alle zwangere vrouwen voorafgaand aan het verzamelen van weefselmonsters.
OPMERKING: Tijdens het werken met dierlijk bloed, cellen, of gevaarlende agenten als bedoeld in dit protocol, is het essentieel dat de juiste bioveiligheid en laboratorium veiligheid acties worden opgevolgd.
1. Dissectie van de Human deciduale Tissues
OPMERKING: De basale inbouwpositie bodemplaat onder en bevestigd aan de placenta en vertegenwoordigt het moederlijke oppervlak. De chorioamniotic membranen zijn de amnion en chorion. De basale plaat omvat de decidua basalis en chorion omvat de decidua parietalis (figuur 1).
- Decidua Basalis
- Ontleden een deel van de basale plaat uit één zaadlob van de placenta (Figuren 1A en 1B).
- Plaats het op een steriele snijplank met de placenta villi naar boven. De zijde met de placenta villi is meestal bloedig rood met harige weefsel in uiterlijk. De basale plaat is glad en bleek rood van kleur.
- Gebruik scherpe, fijne punt schaar en tang om de vill verwijderenlende weefsels en bloedvaten. Houd het weefsel gedrenkt in 1x PBS (Ca 2+ - en Mg 2+ - gratis) tijdens het proces (figuur 1C). Verzamel 2 tot 3 van deze stukken en spoel ze grondig met 1x PBS om het bloed (figuur 1D) te verwijderen.
- Decidua parietalis
- Ontleden een stukje chorioamniotic membranen (ongeveer 10 cm x 10 cm, Figuur 1E). Plaats het op het bord met de chorion naar boven. De chorionic kant bevat bloedige stolsels en is meestal licht gelig van kleur.
- Gebruik fijne punt tang om zoveel mogelijk van de bloedstolsels te verwijderen mogelijk (figuur 1E). Spoel het membraan in steriele 1x PBS om het overtollige bloed te reinigen van het membraan totdat het 1x PBS loopt duidelijk.
- Gebruik een steriele celschraper om voorzichtig schrapen de deciduale laag van het membraan. Breng steriel 1x PBS op de membrane bij het invullen van dit proces (Figuur 1F). Verzamel de deciduale weefsel en plaats ze in een 50 ml plastic buis met steriel 1x PBS (figuur 1G).
2. Mechanische Disaggregatie en enzymatische afbraak
- Was het weefsel losgesneden van de decidua basalis (uit stap 1.1.3) of decidua parietalis (uit stap 1.2.3) met steriele 1x PBS in een 50 ml plastic buis. Verzamel materiaal pellets door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant boven het weefsel pellet zich voorzichtig, zonder de pellet te verstoren.
OPMERKING: Op dit punt, de pellets zeer losse omdat rode bloedcellen bevat. Als het volume van de pellet ongeveer of minder dan 3 ml, resuspendeer de pellet in 6 ml cel losraken oplossing voorverwarmd tot 37 ° C. Indien de pellet groter is dan 3 ml volume, voeg meer mobiele onthechting oplossing (voeg ongeveer 2 maal the volume van de weefselmonsters). - Breng de gehomogeniseerd weefsels (decidua basalis + cel onthechting oplossing of decidua parietalis + cel onthechting oplossing) om een C buis.
- Plaats de C buis in de automatische dissociator en voer het desbetreffende programma.
OPMERKING: Het programma voor de decidua basalis loopt voor 17 sec met 668 totale rondes per run. Het programma voor de decidua parietalis loopt voor 37 sec met 235 totale rondes per run. Deze programma's zijn aangepast aan leukocyten te isoleren van de decidua basalis of decidua parietalis met goede opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen. - Na de mechanische disaggregatie van het weefsel, verteren van de weefsels door een commercieel verkrijgbare cel losraken oplossing zoals Accutase; (A cocktail die proteolytische en collagenolytische enzymen bevat) gedurende 45 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden.
3. Isolatie van Leukocyten
- Na incubatie, voeg 10 ml van 1 x PBS om de DIGEbrande resten mengsel en doorgeven door een 100 urn zeef cel in een 50 ml plastic buis. Afhankelijk van de kleverigheid van het digestiemengsel mogelijk dat één tot enkele cel zeven gebruiken om een mengsel.
- De buis met 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de 1x PBS boven de celpellets zorgvuldig en resuspendeer de pellets met 5 ml ijskoude FACS buffer.
OPMERKING: Om de polymorfonucleaire en mononucleaire leukocyten samen studeren, ga dan naar stap 6.1; aan de mononucleaire leukocyten bestuderen, verder met stap 3.3. - Voeg 5 ml van 20% dichtheidsgradiënt media (1,077 + 0,001 g / ml) in een 15 ml plastic buis langzaam overlay de celsuspensie bovenop de dichtheidsgradiënt media. Hoewel lagen van het monster, is het belangrijk de dichtheidsgradiënt media niet te mengen met de celsuspensie.
- Centrifugeren met een swing-out rotor bij 500 xg gedurende 30 min bij 4 ° C zonder rem. Het is belangrijk de rem uit te schakelen om te voorkomen dat het mengen van de cellen en losing het verloop. Leukocyten worden in het grensvlak tussen de dichtheidsgradiënt media en FACS buffer.
- Verwijder de bovenste laag die de FACS buffer en celresten bevat zeer voorzichtig met een pipet. De band bij het grensvlak bevat deciduale mononucleaire cellen en een gedeelte van de polymorfonucleaire leukocyten.
- Overdracht van de cellen op het grensvlak volledig in nieuw 15 ml plastic buis. Voeg minstens 3 maal volume van FACS-buffer.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelletiseren. Zuig het supernatant en was de cellen met FACS-buffer. Pelletiseren de cellen met andere centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Om de celkweek te voeren, zie Stap 4. Om celsortering uit te voeren, zie Stap 5. immunofenotypering voeren, zie stap 6.
4. Toepassingen - Celcultuur
- Resuspendeer de cellen van stap 1 in 3,7 ml RPMI 1640 kweekmedium Tel het aantal levensvatbare cellen using een automatische cel balie of een hemocytometer en een trypan blauwe oplossing 0,4%.
- Tel de hoeveelheid RPMI cultuurmedium tot een celconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml te maken. De cellen zijn nu klaar voor cultuur.
5. Toepassingen - Isolatie van macrofagen voor Primary Cell Culture
- Om CD14 + cellen te isoleren, magnetisch labelen van de cellen van stap 3.7 met CD14 microkorrels (parels per 20 gl 10 7 cellen), incubeer 15 min bij 4 ° C en gescheiden CD14 + cellen uit andere soorten cellen door toepassing van een magnetisch veld. Na 2 wassingen met MACS buffer en verwijdering van het magnetische veld, elueren de magnetisch vastgehouden CD14 + cellen met MACS buffer.
- Na centrifugatie, resuspendeer de celpellets in kweekmedium RPMI 1640. De cellen zijn klaar voor plating (figuur 2).
6. Toepassingen - Immuunfenotypering
- Om de cellen voor immunophenot gebruikenyping, resuspendeer de cellen van stap 3.7 in 1 ml 1x PBS. Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een automatische celgetalmeter of een hemocytometer en een trypan blauwe oplossing 0,4%.
- Label de cellen met een fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof (Figuur 3). Was de cellen tweemaal met FACS buffer en resuspendeer de cellen in vlekken buffer. Incubeer een FcR blocker gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Voeg extracellulaire antilichamen geconjugeerd met fluorochromen. Bijvoorbeeld, in dit protocol, gebruikt anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 en anti-CD56-antilichamen (Tabel 1). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Na 2 wasbeurten met 1x PBS, de cellen worden geanalyseerd in 500 pl buffer vlek met een flow cytometer. Een weergave van de gating strategie gebruikt om de leukocyten subpopulaties in de deciduale weefsel analyse wordt getoond in figuur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. De ontleding van menselijke weefsels op de maternale-foetale interface (decidua basalis en decidua parietalis) wordt in figuur 1 Deze werkwijze omvat het ontleden van de basale plaat, waarbij de decidua basalis (Figuur 1A - D) omvat. De decidua basalis wordt verkregen door verwijdering van de placenta villi (foetale zijde) van de basale plaat (figuur 1C). De decidua parietalis wordt verzameld door voorzichtig schrapen het chorion membraan (Figuur 1E - F). Figuur 2 toont de morfologie van geïsoleerde macrofagen (CD14 +) vanuit het decidua parietalis in een term zwangerschap behulp van magnetische celsortering. Geïsoleerde macrofagen behouden het vermogen om cytokinen na 3 dagen kweken (data niet getoond). De opbrengst van levensvatbare cellen geisoleerd uit de decidua basalis en decidua parietalis wordt getoond in figuur 3, en het is meer dan 90% in beide.
Figuur 1. Human maternale-foetale interface:. Placenta en chorioamniotic membranen (A) Basale plaat wordt ontleed uit de placenta; (B) de basale plaat gescheiden van de placenta villi; (C) villi placenta wordt getrimd van de basale plaat waaronder de decidua basalis; (D) decidua basa lis is gespoeld in 1x PBS; (E) een fragment van het chorion membraan wordt verkregen en bloedstolsels worden voorzichtig verwijderd; (F) decidua parietalis wordt voorzichtig afgeschraapt; en (G) decidua parietalis (stippellijn) is gescheiden van de chorionic membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. deciduale macrofagen in de cultuur. Macrofagen (CD14 + cellen) werden geïsoleerd van de decidua parietalis op termijn zwangerschap. Macrofagen werden uitgezet in plastic kamer dia's met RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicilline-streptomycine + 50 ng / ml MCSF. Foto's werden genomen op het uitplaten (A) en na 3 dagen in kweek (C).3 / 52863fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Totaal cellevensvatbaarheid. Levensvatbaarheid van totale cellen geisoleerd uit de decidua basalis en decidua parietalis bepaald volgende dichtheidsgradiënt met een fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof (stap 6.2). Levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen is> 95% volgens de levensvatbaarheid levend / dood celkleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Gating strategie voor deciduale leukocyten subpopulaties. Leukocyten werden omheind met FSC en SSC. Levende cellen werden daarna afgesloten volgens de levensvatbaarheid gate (Live). Levensvatbare cellen werden gescheiden in neutrophils (CD15 +) en macrofagen (CD14 +). De CD14-CD15- populatie werd vervolgens verder gescheiden in NK-cellen (CD3-CD56 +), NKT-cellen (CD3 + CD56 +), T-cellen (CD3 +) en B-cellen (CD19 +). Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
. Figuur 5. Leukocyte subpopulaties in de deciduale weefsels neutrofielen (CD15 +) en macrofagen (CD14 +) werden afgesloten binnen de levensvatbaarheid poort; T-cellen (CD3 +) en B-cellen (CD19 +) werden afgesloten binnen de CD14-CD15- poort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Rare leukocyten subpopulaties in de decidUAL weefsels. NK-cellen (CD56 +) en NKT-cellen (CD56 + CD3 +) werden afgesloten binnen de CD14-CD15- poort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam lijst | Bedrijf | Catalog No. |
| BD Pharmingen Anti-humaan CD56-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557.747 |
| BD Horizon Anti-menselijke CD15-BV605 | BD Biosciences | 562.980 |
| BD Horizon Anti-menselijke CD14-BUV395 | BD Biosciences | 563.561 |
| BD Horizon Anti-menselijke CD19-BUV737 | BD Biosciences | 564.303 |
| Brilliant Violet 650 Anti-humaan CD3 antilichaam | Biolegend | 317.323 |
Tabel 1. Lijst van antilichamen gebruikt voor leukocyten deelverzameling immunofenotypering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisering van het functionele en fenotypische eigenschappen van infiltrerende leukocyten op menselijk maternale-foetale interface is essentieel voor het begrip van de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap aandoeningen. Er zijn verschillende technieken beschreven om leukocyten uit de humane maternale-foetale-interface isoleren gedurende de zwangerschap 10,14,25,28,37,42,43. Echter, elk van deze technieken verschilt, gebruikt verschillende enzymen of enzym-combinaties, vereist verschillende dissociatie tijden, geen hoeveelheden weefsel te specificeren, en vooral, niet steeds de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen te specificeren. De hierin beschreven protocol maakt de isolatie van infiltrerende leukocyten op menselijk maternale-foetale interface (decidua basalis en decidua parietalis) resulteert in een hoge opbrengst van levensvatbaarheid en geeft gedetailleerde informatie over de commerciële reagentia, buffervoorbereiding, tissue hoeveelheden en incubatietijden validated in ons laboratorium.
De eerste cruciale stap van de leukocyten isolatie proces is weefsel dissociatie; deze stap gaat mechanische desegregatie en / of enzymatische dissociatie. Mechanische desegregatie wordt met succes uitgevoerd door het afschrapen van de chorion toen het isoleren van de decidua parietalis (Figuur 1F) en door het trimmen van de placenta villi van de basale plaat als het isoleren van de decidua basalis (figuur 1C) 10,28. Daarom is het hierin beschreven protocol omvat zowel procedures als initiële stappen. Het is echter belangrijk om te overwegen dat de basale plaat (maternale weefsels) en placenta villi (foetale weefsels) nauw met elkaar verbonden, die een verontreiniging van foetale leukocyten kan veroorzaken bij het isoleren van leukocyten uit de decidua basalis. Foetale besmetting te voorkomen, het protocol hierin adviseert het wassen van de bijgesneden basale plaat twee of drie keer (figuur 1D). Na cel schrapen of trimmenvan de decidua basalis of decidua parietalis, heeft een extra stap voor mechanische weefsel disaggregatie aanbevolen 39. Deze stap wordt aanbevolen omdat de infiltrerende leukocyten in de maternale-foetale-interface express adhesiemoleculen die hen stevig aan de extracellulaire matrix 6,7. Daarom is de hierin beschreven protocol omvat de mechanische uitsplitsing met een automatische weefsel dissociator dat consistentie verhoogt terwijl bespaart tijd en arbeid in vergelijking met de traditionele hakken met scalpels, scheermesjes, of chirurgische schaar 10,28.
Een tweede belangrijke stap in het weefsel dissociatie proces is enzymatische dissociatie. Single enzymen en een combinatie van verschillende enzymen zijn toegepast om infiltrerende leukocyten te isoleren van de decidua basalis en decidua parietalis 10,14,25,28,37,42,43. In veel gevallen, die enzymen bereid een bepaalde concentratie met de hand in het laboratory kan onderhevig zijn aan menselijke fouten. Hier, in plaats daarvan, een kant-en-klare gezuiverd collagenase / neutrale protease cocktail, Accutase, is in het laboratorium zijn uitgevoerd; als commercieel enzym werd aangetoond betrouwbare resultaten in celkweek 51 verschaffen. Accutase (een cel onthechting oplossing) is bekend om effectief macrofagen uit kweekplaten los zonder schrapen en, belangrijker nog, zonder verlies van oppervlakte-antigenen 51. Deze bereide enzym is ook gebruikt voor de digestie van menselijke en dierlijke zenuwstelsel weefsel, wat resulteert in levensvatbare geïsoleerde cellen die duurzaam gedurende een langere periode, in de tijd, waardoor zij celcultuur 52. Bovendien is deze oplossing bewaart ook CD24 antigeniciteit in cellen geïsoleerd uit het centraal zenuwstelsel weefsel 52. Vergeleken met Liberase-1, een cocktail van collagenase en neutrale protease noch Accutase of Liberase-1 te genereren vrij DNA pellet; echter Accutase is gEntler dan Liberase-1 tijdens weefsel dissociatie 52. Hierdoor hoeft Accutase niet celaggregaten dissociëren na digestie 52. Om deze beperking te overwinnen, het hierin beschreven protocol omvat de automatische weefsel disaggregatie van de decidua basalis en decidua parietalis voordat het weefsel dissociatie met de oplossing. Accutase heeft ook aangetoond zijn superioriteit aan trypsine in het behoud van CD44, een celoppervlak kanker stamcellen marker 53. Studies ons laboratorium hebben consequent opgemerkt dat de onthechting oplossing behoudt de oppervlakte-antigenen. Inderdaad geven de verschillen tussen zwangerschapsziektes en normale zwangerschappen gevonden in de expressie van verscheidene extracellulaire en intracellulaire merkers in macrofagen (CD14 + cellen), neutrofielen (CD15 + cellen), T-cellen (CD3 + cellen), en B-cellen (CD19 + cellen), waaronder CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3 en RORγt, en cytokine afgifte. Daarom is het hierin beschreven protocol is optimaal voor immunofenotypering infiltratie van leukocyten op menselijk maternale-foetale interface in de representatieve resultaten.
Een belangrijk voordeel van de hierin beschreven protocol is dat het voor de isolatie van leukocyten met een hoge opbrengst van levensvatbare cellen. De representatieve gegevens tonen dat> 90% van de geïsoleerde cellen levensvatbaar. Dit is van groot belang omdat dit protocol kon de studie van de functionele eigenschappen van de cellen geïsoleerd uit menselijke weefsels op de maternale-foetale interface. Zo zijn culturen van de deciduale macrofagen en de studie van cytokine afgifte gestimuleerd worden uitgevoerd met dit protocol.
Om succesvolle resultaten met de beschreven protocol te realiseren, is het belangrijk de volgende factoren in overweging: 1) tissue collectiOp moet binnen 1-2 uur na aflevering, en deze weefsels in een container met 1x PBS geplaatst bij 4 ° C om de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen te behouden; 2) mechanische weefsel disaggregatie moet worden uitgevoerd met een automatische homogenisator ten tijde bevestigd, zoals beschreven in dit protocol; 3) de duur van incubatie met de cellen loslaten oplossing moet minder dan 1 uur, aangezien zijn activiteit na deze tijd vermindert zijn; 4) de temperatuur van incubatie met de cellen loslaten oplossing moet bij 37 ° C worden gehouden om een optimale activiteit van dit enzym te verkrijgen; 5) celpellet manipulatie moet voorzichtig worden gedaan met gebruik van micropipetten vanwege de vortex de integriteit van de cellen kunnen beschadigen (herinneren dat geïsoleerde cellen zijn gedifferentieerd en abrupt manipulatie kunnen hun levensvatbaarheid te verminderen); 6) buffer en centrifuge temperaturen moeten op dezelfde temperatuur als de celsuspensie worden gehouden; 7) geïsoleerde cellen moeten worden verwerkt voor immunofenotypering of onmiddel gebruiktlijk als hun levensvatbaarheid verkleint snel; en 8) bij het uitvoeren van immunofenotypering, monsters moeten worden verkregen met behulp van een flowcytometer meteen voor het beste resultaat.
Een van de beperkingen van dit protocol is de kostprijs van Accutase, die duurder dan andere enzymen met vergelijkbare functies, bijvoorbeeld trypsine, dispase II en collagenase. Echter, de voordelen die displays boven die enzymen Accutase zijn superieur. Een tweede beperking van het protocol is de eis van een automatische weefsel dissociator, die geen gemeenschappelijk laboratoriuminstrument en daarom kan kostbaar zijn. Om deze beperking te overwinnen, kan het weefsel desegregatie ook worden uitgevoerd met behulp van kleine chirurgische schaar; nochtans, kan deze stap niet overschrijden 3-5 minuten sinds langere tijd is aangetoond dat de opbrengst van levensvatbare cellen te verminderen. Alle dissociaties moet worden uitgevoerd door dezelfde onderzoeker van de variabiliteit te minimaliseren.
Samengevat, het protocol heeft hierin een nieuwe benadering die het gebruik van zachte mechanische en enzymatische dissociatie tissue technieken combineert om de integriteit van de extracellulaire en intracellulaire markers in leukocyten geïsoleerd uit menselijke weefsels op de maternale-foetale-interface behouden. Afgezien van immunofenotypering, celcultuur en celsortering, de toekomstige toepassingen van dit protocol zijn talrijk en gevarieerd. We zijn met succes met dit protocol te deciduale leukocyten in vitro studies van leukocyt functionaliteit (dat wil zeggen, cytotoxiciteit, T-celproliferatie en plasticiteit, etc.), en de productie van reactieve zuurstofsoorten in de leukocyten geïsoleerd uit decidua weefsels (data niet isoleren getoond). Sterker nog, het gebruik van de beschreven protocol, ons laboratorium is in staat om nieuwe en zeldzame leukocyten te beschrijven op de maternale-foetale-interface geweest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH / DHHS. Dit werk werd ook ondersteund, gedeeltelijk, door de Wayne State University Perinatale Initiative in Maternal, Perinatale en Child Health. Wij dankbaar erkennen Maureen McGerty (Wayne State University) voor haar kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
