Abstract
הריון מאופיין בחדירה של כדוריות דם לבנות ברקמות הרבייה ובממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua). ממשק זה הוא האתר האנטומי של קשר בין האם ורקמות עוברים; לכן, זה אתר חיסוני של פעולה במהלך הריון. לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי לשחק תפקיד מרכזי בהשתלה, תחזוקת הריון, ועיתוי של מסירה. לכן, אפיונים פנוטיפי ופונקציונליים של לויקוציטים אלה יספק תובנה המנגנונים המביאים להפרעות הריון. כמה פרוטוקולים תוארו כדי לבודד חדירה לויקוציטים מbasalis decidua וparietalis decidua; עם זאת, חוסר העקביות בחומרים הכימיים, אנזימים, ופעמים של דגירה עושה את זה קשה להשוות תוצאות אלו. מתואר כאן היא גישה חדשנית המשלבת את השימוש בDiss המכני והאנזימטית העדיןטכניקות ociation לשמר את הכדאיות ויושרה של סמנים תאיים ו תאיים בלויקוציטים מבודד מהרקמות האנושיות בממשק אימהי-העוברי. מלבד immunophenotyping, תרבית תאים, ומיון תא, היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם רבים ומגוונים. בעקבות פרוטוקול זה, יכולים לשמש לויקוציטים המבודדים כדי לקבוע מתילציה DNA, ביטוי של גני המטרה, במבחנה פונקציונלי יקוציט (כלומר, phagocytosis, רעיל, התפשטות תאי T, וגמישות, וכו '), והייצור של מיני חמצן מגיבים בממשק אימהי-העוברי. בנוסף, באמצעות הפרוטוקול המתואר, מעבדה זו הייתה מסוגלת לתאר לויקוציטים החדשים והנדירים בממשק אימהי-העוברי.
Introduction
הריון מאופיין בשלושה שלבים ברורים חיסוניים: 1) השתלה וplacentation המוקדם הקשורים בתגובה פרו-דלקתית (כלומר, השתלה דומה "פצע פתוח"); 2) השליש השני ורוב השליש השלישי של הריון כאשר הומאוסטזיס חיסון מושגת באמצעות מדינה בעיקר אנטי דלקתית בממשק אימהי-העוברי; והמלטה 3), מדינה פרו-דלקתית 1-7. תאים חיסוניים יש תפקיד חשוב בויסות התגובה הדלקתית בממשק אימהי-העוברי שבו השפע שלהם ושינוי הלוקליזציה במהלך הריון 6-9.
בבני אדם, הממשק אימהי-עוברי מייצג אזור של קשר ישיר בין האימהי (decidua) ועובר (סיסית או trophoblast) רקמות. ממשק זה כולל: 1) decidua parietalis שקווי חלל הרחם אינו מכוסה על ידי השליה והוא בסמיכותלlaeve סיסית; ו -2) basalis decidua, ממוקם בצלחת הבסיס של השליה שבו הוא פלש trophoblasts ביניים 10 (איור 1). האינטימיות של תחומי מגע אלה יוצר תנאים לחשיפה עוברית לאנטיגני 11-13 המערכת החיסונית של האם. שלא במפתיע, לויקוציטים מהווים עד 30-40% מתאי decidual 8,9,14,15 בנוסף לתאי סטרומה-סוג טיפוסיים ותאי בלוטות 8,14,16. התפקיד של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי כולל מספר רב של תהליכים הכוללים הגבלה של פלישת trophoblast 17, שיפוץ של עורקים סליליים 18,19, תחזוקה של סובלנות מצד 12,20, וחניכה של עבודת 21-26. לויקוציטים של שתי ההסתגלות וגפיים מולדים של מערכת החיסון, כלומר, תאי T, מקרופאגים, נויטרופילים, תאי B, תאים דנדריטים, ותאי NK, זוהו ברקמות decidual, ופרופורציות ומצב הפעלה הוכחו להשתנות מרחב ובזמן בכל הריון 6-10,12,14,24,27-30. הפרעות באוכלוסיית יקוציט ו / או הפונקציה משויכות הפלה ספונטנית 31, רעלת הריון 32, הגבלת גדילה תוך-רחמית 32,33, וצירים מוקדמים 7,24. לכן, המחקר של המאפיינים פנוטיפי והפונקציונליות של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי יאפשר הבהרת המסלולים החיסוניים dysregulated בהפרעות הריון.
טכנולוגיה אחד הכלים החזקים ביותר המשמשים לקביעת הפנוטיפ ומאפיינים פונקציונליים של לויקוציטים הוא cytometry זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים מרובים בו זמנית 34-36. כדי לנתח לויקוציטים ידי cytometry זרימה, נדרש בידוד של כדוריות דם לבנות בהשעית תא בודד. לכן, שיטה להפריד הסתננות Leuיש צורך kocytes מהממשק האימהי-העוברי ללמוד פנוטיפי ומאפיינים פונקציונליים.
כמה שיטות שתוארו לבודד את כדוריות דם לבנות מהממשק אימהי-העוברי האנושי 10,14,25,27,37-39. בעוד כמה להחיל disaggregation המכני 10,25,27,38, אחרים משתמשים עיכול אנזימטי 37,40 לניתוק רקמה. בגלל disaggregation המכני מייצר תשואה נמוכה וכדאיות מופחתת 41, וניתוק האנזימטית יכול להשפיע על כדאיות ופני תא שמירת סמן 42, בשיטה המתוארת במסמך זה משלב ניתוק מכאני עדין עם האנזימטית מראש טיפול להגדיל את התשואה של לויקוציטים המבודד מבלי להתפשר על כדאיות תא. שילוב דומה של שיטות הודגם כיעיל בבידוד של כדוריות דם לבנות מרקמות decidual בממשק האימהי-העוברי 39. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כרוך Mechadisaggregation nical עם Dissociator רקמה אוטומטי שמגדיל עקביות תוך חיסכון בזמן ועבודה בהשוואה לגנדרני מסורתי עם אזמלים מנוגדים, סכיני גילוח, או מספריים כירורגיות 10,28. האנזים שנבחר לניתוק רקמה היה Accutase. שלא כמו collagenase הנפוץ 43, dispase 44, וטריפסין 45, Accutase (פתרון ניתוק תא) משלב את שני מפרקי חלבונים כלליים ופעילויות collagenolytic שתורמות לניתוק עדיין עדין יעיל 46,47. לאחר ניתוק, לויקוציטים מועשר מהאוכלוסייה הכוללת של תאי decidual ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. תקשורת שיפוע צפיפות שונות כבר נוצלה בעבר, הנפוץ ביותר מהם Percoll (השעיה של חלקיקי סיליקה colloidal) 48 וFicoll (פולימר של סוכרוז עם משקל מולקולרי סינטטי גבוה) 49. היעילות מעולה של בידוד על ידי פולימר סוכרוז כבר previoמוצג usly 50, והפרוטוקול המתואר במסמך נוסף מוכיח שתקשורת שיפוע צפיפות זו מייצרת טוהר גבוה מספיק של לויקוציטים mononuclear.
לפיכך, הפרוטוקול המתואר במסמך זה משלב disaggregation הרקמה המכני עם Dissociator אוטומטי רקמות, עיכול אנזימטי עם פתרון ניתוק תא, והפרדה לויקוציטים עם תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) כדי לבודד לויקוציטים מרקמות decidual אנושיות. פרוטוקול זה הוכח לשמר אנטיגנים פני תא יחד עם כדאיות תא. לויקוציטים המבודד יכול לשמש ליישומים מרובים הכוללים immunophenotyping עם cytometry זרימה ומחקרים תפקודיים במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מתאים לבידוד יקוציט מbasalis decidua וparietalis decidua בהכנה לimmunophenotyping ידי cytometry זרימה. יתר על כן, התאים המבודדים יכולים לשמש למיון תא, תרבית תאים, בידוד RNA, וציטולוגיה. לפני העבודה עם הדגימות שהוזכרו בפרוטוקול זה, יש לקבל את האישור אתי אנושי מהוועדה המקומית לחקר האתיקה ולוחות סקירה מוסדית. האיסוף והניצול של דגימות אנושיות למטרות מחקר אושרו על ידי לוחות הסקירה המוסדית של המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר לבריאות ילד והתפתחות אדם (NICHD), מכון הלאומי לבריאות (NIH), מחלקת בריאות ושירותי אנוש (DHHS , Bethesda, MD, ארה"ב) והאוניברסיטה ויין סטייט (דטרויט, מישיגן, ארה"ב). נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל הנשים בהריון לפני האוסף של דגימות רקמה.
הערה: בעת שעבדה בדם של בעלי חיים, תאים, או מפגעסוכני היחידות הארגוניות כאמור בפרוטוקול זה, זה חיוני כי בטיחות ביולוגית נכונה ופעולות בטיחות במעבדה להיות אחריו.
1. Dissection של רקמות Decidual האדם
הערה: צלחת הבסיס היא הבסיס מתחת ומחובר לשליה ומייצגת את פני השטח האימהיים. קרומי chorioamniotic כוללים amnion וסיסי. הצלחת הבסיסית כוללת basalis decidua והסיסי כולל parietalis decidua (איור 1).
- Decidua basalis
- לנתח פיסת הצלחת הבסיסית מטבורית אחד של השליה (איורים 1 א ו -1 B).
- מניחים אותו על קרש חיתוך סטרילי עם villi השליה פונה כלפי מעלה. הצד מראה villi השליה הוא בדרך כלל אדום מדם עם רקמת שעיר במראה. צלחת הבסיס חלקה וחיוורת בצבע אדום.
- שימוש במלקחיים חדים, מספריים ועדין נקודה כדי להסיר את Villכלי רקמה ודם היחידות הארגוניות. לשמור על הרקמה הספוגה ב1x PBS (Ca 2 + - וMg 2 + - ללא תשלום) בתהליך (איור 1 ג). לאסוף 2-3 חתיכות אלה ולשטוף אותם ביסודיות עם 1x PBS להסיר הדם (1D איור).
- Decidua Parietalis
- לנתח פיסת קרום chorioamniotic (כ 10 סנטימטרים x 10 סנטימטר, איור 1E). מניחים אותו על הלוח עם סיסית פונה כלפי מעלה. צד השליה מכיל קרישי דם, והוא בדרך כלל אור בצבע צהבהב.
- שימוש במלקחיים עדין נקודה כדי להסיר כמה שיותר קרישי הדם ככל האפשר (איור 1E). יש לשטוף את הקרום בסטרילי 1X PBS כדי לנקות את הדם העודף מהקרום עד PBS 1x פועל ברור.
- השתמש מגרד תא סטרילי חד פעמי כדי לגרד את שכבת decidual מן הקרום בעדינות. החל סטרילי 1X PBS על ממBrane בעת השלמת תהליך זה (איור 1F). אסוף את רקמות decidual ולמקם אותם בצינור פלסטיק 50 מיליליטר עם סטרילי 1X PBS (איור 1G).
2. מכאני disaggregation ואנזימתי עיכול
- שטוף את הרקמה גזור מbasalis decidua (משלב 1.1.3) או parietalis decidua (משלב 1.2.3) עם סטרילי 1X PBS בצינור פלסטיק 50 מיליליטר. לאסוף כדורי רקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT.
- לשאוב supernatant ממוקם מעל גלולה הרקמה בזהירות מבלי להפריע גלולה.
הערה: בשלב זה, את כדורים הם רופפים מאוד משום שהם מכילים תאי דם אדומים. אם הנפח של גלולה הוא על או פחות מ 3 מיליליטר, מחדש להשעות את גלולה ב 6 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. אם גלולה היא גדולה יותר מאשר 3 מיליליטר של נפח, להוסיף עוד פתרון ניתוק תא (להוסיף על פי 2 הדואר נפח של דגימות הרקמה). - העבר את הרקמות הומוגני (basalis decidua + parietalis פתרון או decidua ניתוק תא + פתרון ניתוק תא) לצינור C.
- מניחים את צינור C בDissociator האוטומטי ולהפעיל את התכנית המתאימה.
הערה: התכנית לbasalis decidua פועלת לשניות 17 עם 668 סיבובים הכולל לטווח. התכנית לparietalis decidua פועלת לשניות 37 עם 235 סיבובים הכולל לטווח. תוכניות אלה מותאמים אישית כדי לבודד לויקוציטים מbasalis decidua או parietalis decidua עם תשואה טובה וכדאיויות תא. - בעקבות disaggregation המכני של הרקמות, לעכל את הרקמות עם פתרון ניתוק תא זמין מסחרי כגון Accutase; (קוקטייל המכיל מפרקי חלבונים ואנזימי collagenolytic) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
3. בידוד של לויקוציטים
- לאחר דגירה, להוסיף 10 מיליליטר של 1x PBS לDIGEתערובת stion ולהעביר אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור פלסטיק 50 מיליליטר. בהתאם לדביקות של תערובת העיכול, אחד ייתכן שיצטרך להשתמש בכמה מסננות תא לתערובת אחת.
- מלא את הצינור עם 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על RT. הסר את PBS 1x מעל כדורי התא בזהירות מחדש להשעות את כדורים עם 5 מיליליטר של חיץ FACS קר כקרח.
הערה: כדי ללמוד את כדוריות דם לבנות polymorphonuclear וmononuclear יחד, עבור לשלב 6.1; ללמוד לויקוציטים mononuclear, המשך לשלב 3.3. - הוסף 5 מיליליטר של 20% תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) לצינור פלסטיק 15 מיליליטר וכיסוי לאט ההשעיה התא על גבי מדיה שיפוע צפיפות. בעוד שכבות המדגם, חשוב לא לערבב תקשורת שיפוע צפיפות עם ההשעיה התא.
- צנטריפוגה עם הרוטור את נדנדה-XG ב 500 במשך 30 דקות ב 4 C ללא הבלם. זה מאוד חשוב כדי לכבות את הבלם כדי למנוע ערבוב התאים וlosing השיפוע. לויקוציטים יימצא בממשק בין תקשורת שיפוע צפיפות וחיץ FACS.
- הסר את השכבה העליונה המכילה את המאגר ופסולת תא FACS בזהירות בעזרת פיפטה. הלהקה בממשק מכילה תאי mononuclear decidual וחלק מכדוריות הדם לבנות polymorphonuclear.
- להעביר את התאים בממשק לחלוטין לצינור פלסטיק 15 מיליליטר חדש. הוסף עוד נפח לפחות 3 פעמים של חיץ FACS.
- צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות לpelletize התאים. לשאוב supernatant ולשטוף את התאים עם חיץ FACS. Pelletize את התאים עם צנטריפוגה אחרת ב XG 300 במשך 5 דקות על RT.
הערה: כדי לבצע את תרבית התאים, ראה שלב 4. כדי לבצע מיון תא, ראה שלב 5. כדי לבצע immunophenotyping, ראה שלב 6.
4. יישומים - תרבות סלולארי
- להשעות מחדש התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות RPMI 1640. ספירת תאי קיימא using דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%.
- להוסיף את הסכום של מדיום תרבות RPMI לעשות ריכוז תא של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. תאים מוכנים לתרבות החברה.
5. יישומים - בידוד של המקרופאגים לתרבית תאים ראשוניים
- כדי לבודד CD14 + תאים, מגנטי התווית התאים משלב 3.7 עם microbeads CD14 (20 חרוזים μl לכל 10 7 תאים), דגירה במשך 15 דקות ב 4 C, וCD14 נפרד + תאים מסוגים אחרים של תאים על ידי הפעלת שדה מגנטי. לאחר 2 שטיפות עם חיץ MACS וההסרה של השדה המגנטי, elute תאי CD14 + עודפים המגנטיים עם חיץ MACS.
- בעקבות צנטריפוגה, מחדש להשעות את כדורי התא בינוני תרבות RPMI 1640. התאים מוכנים לציפוי (איור 2).
6. יישומים - immunophenotyping
- כדי להשתמש בתאים לimmunophenotyping, מחדש להשעות את התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של 1x PBS. ספירת תאי קיימא באמצעות דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%.
- תווית התאים עם צבע ניתן לתקן כדאיות (איור 3). לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ FACS מחדש להשעות את התאים במאגר כתם. דגירה עם חוסם FCR במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
- להוסיף נוגדנים תאיים מצומדת לfluorochromes. לדוגמא, בפרוטוקול זה, להשתמש באנטי-CD3, נוגדנים נגד CD19, אנטי CD14, אנטי CD15, ואנטי-CD56 (טבלה 1). דגירה של 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- לאחר 2 שטיפות עם 1x PBS, התאים ינותחו ב500 μl של חיץ כתם באמצעות cytometer זרימה. ייצוג של אסטרטגית gating להשתמש כדי לנתח את תת-האוכלוסיות לויקוציטים נמצאו ברקמות decidual מוצג באיור 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. הנתיחה של רקמות אנושיות בממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua) מוצגת באיור 1 הליך זה כולל את הנתיחה של הצלחת הבסיסית, הכוללת את basalis decidua (איור 1 א - ד). Basalis decidua מתקבל על ידי הסרת villi השליה (הצד עוברי) מצלחת הבסיס (איור 1 ג). Parietalis decidua נאסף על ידי בעדינות מגרד את קרום כוריוני (איור 1E - F). איור 2 מציג את המורפולוגיה של מקרופאגים המבודדים (+ CD14) שנאספו מparietalis decidua בהריון טווח באמצעות מיון תא מגנטי. מקרופאגים מבודדים שמרו את היכולת לשחרר ציטוקינים לאחר 3 ימים של התרבות (מידע לא מוצג). התשואה של תאי קיימא מבודדים מbasalis decidua וparietalis decidua מוצגת באיור 3, והוא גדול מ 90% בשניהם.
איור 1. אדם אימהי-עוברי ממשק:. שליה וקרומים chorioamniotic () צלחת בסל היא גזור מהשליה; (ב) צלחת בסיס מופרדת מvilli השליה; villi (C) השליה חיתוך מהצלחת הבסיסית כולל basalis decidua; באסה (ד) decidua ליס הוא שטף ב1x PBS; (ה) שבר של קרום כוריוני מתקבלת וקרישי דם יוסרו בעדינות; (F) parietalis decidua הוא גרד בעדינות; וparietalis (G) decidua (קו מקווקו) מופרד מקרום כוריוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מקרופאגים Decidual בתרבות. המקרופאגים (תאי CD14 +) היו מבודדים מparietalis decidua בהריון הטווח. המקרופאגים היו מצופים בשקופיות קאמריות פלסטיק עם FBS + 10% RPMI1640 + 1% פניצילין, סטרפטומיצין + 50 MCSF ng / ml. תמונות נלקחו בעת ציפוי () ואחרי 3 ימים בתרבות (C).3 52863fig3large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. כדאיות תא סה"כ. יכולת הקיום של תאים כולל המבודדים מbasalis decidua וparietalis decidua נקבע שיפוע הצפיפות הבא באמצעות צבע ניתן לתקן כדאיות (שלב 6.2). כדאיות של תאים מבודדים היא> 95% על פי צביעת כדאיות תא החי / מת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. אסטרטגית gating לתת-אוכלוסיות לויקוציטים decidual. Leukocytes היו מגודרת עם FSC ו SSC. תאי חיים אז היו מגודר על פי שער הכדאיות (Live). תאי קיימא הופרדו לneutrophils (CD15 +) ומקרופאגים (+ CD14). אוכלוסיית CD14-CD15- הייתה אז נפרדה נוספת לתאי NK (CD3-CD56 +), תאי NKT (CD3 + CD56 +), תאי T (CD3 +), ותאי B (CD19 +). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
. איור 5. יקוציט תת-אוכלוסיות ברקמות decidual נויטרופילים (CD15 +) ומקרופאגים (CD14 +) היו מגודר בתוך שער הכדאיות; תאי T (CD3 +) ותאי B (CD19 +) היו מגודר בתוך השער CD14-CD15-. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. יקוציט נדיר תת-אוכלוסיות בdecidרקמות רע"מ. תאי NK (CD56 +) ותאי NKT (CD56 + CD3 +) היו מגודרות בתוך השער CD14-CD15-. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| רשימת נוגדן | חברה | מס 'קטלוגי |
| CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen אנטי-אנושי | BD Biosciences | 557,747 |
| CD15-BV605 BD אופק אנטי-אנושי | BD Biosciences | 562,980 |
| CD14-BUV395 BD אופק אנטי-אנושי | BD Biosciences | 563,561 |
| CD19-BUV737 BD אופק אנטי-אנושי | BD Biosciences | 564,303 |
| ויולט מבריק 650 אנטי-אנושי CD3 נוגדנים | Biolegend | 317,323 |
רשימת טבלת 1. נוגדנים מנוצלת לimmunophenotyping משנה לויקוציטים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אפיון התכונות הפונקציונליות ופנוטיפי של חדירה לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי הוא חיוני להבנה של מנגנוני החיסון שיובילו להפרעות הריון. כמה טכניקות שתוארו כדי לבודד לויקוציטים מהממשק אימהי-העוברי האנושי במהלך הריון 10,14,25,28,37,42,43. עם זאת, כל אחד מטכניקות אלה הוא שונה, שימושים שונים אנזימים או שילובי אנזים, דורש פעמים ניתוק שונות, אינו מציין כמויות של רקמה, והכי חשוב, לא תמיד לציין את הכדאיות של התאים המבודדים. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר הבידוד של חדירה לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי (basalis decidua וparietalis decidua) וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של כדאיות ומספק מידע מפורט על חומרים כימיים המסחריים, הכנת חיץ, כמויות רקמה, ופעמים דגירה validaטד במעבדה שלנו.
השלב הקריטי הראשון של תהליך בידוד יקוציט הוא ניתוק רקמות; צעד זה כרוך ביטול הפרדה מכאנית ו / או ניתוק האנזימטית. ביטול הפרדה מכאנית מתבצעת בהצלחה על ידי גירוד סיסית כאשר בידוד parietalis decidua (איור 1F) ועל ידי זמירה villi השליה מהצלחת הבסיסית כאשר בידוד basalis decidua (איור 1 ג) 10,28. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כולל שני הליכים כצעדים ראשונים. עם זאת, חשוב להביא בחשבון כי הצלחת הבסיסית (רקמות אימהיות) וvilli השליה (רקמות עובריות) מחוברים באופן הדוק, מה שיכול לגרום לזיהום של לויקוציטים העוברי כאשר בידוד לויקוציטים מbasalis decidua. כדי למנוע זיהום של העובר, פרוטוקול מסמך ממליץ לשטוף את צלחת הבסיס הגזוז שתיים או שלוש פעמים (1D איור). בעקבות גירוד תא או זמירהמbasalis decidua או parietalis decidua, צעד נוסף לdisaggregation רקמה המכני כבר המליץ 39. צעד זה מומלץ כי כדוריות דם לבנות בחדירת המולקולות אימהיות-עובריות הממשק מפורשות הידבקות תא שתוקף לצרף אותם למטריקס 6,7. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כרוך disaggregation המכני עם Dissociator רקמה אוטומטי שמגדיל עקביות תוך חיסכון בזמן ועבודה בהשוואה לגנדרני מסורתי עם אזמלים, סכיני גילוח, או מספריים כירורגיות 10,28.
שלב קריטי שני בתהליך ניתוק הרקמה הוא ניתוק האנזימטית. אנזימים בודדים ושילוב של אנזימים שונים שימשו לבודד את כדוריות דם לבנות שחדרו מbasalis decidua וdecidua parietalis 10,14,25,28,37,42,43. במקרים רבים, אנזימים אלה מוכנים לריכוז מסוים ביד בlaboraהטורים עשויים להיות כפופים לטעויות אנוש. כאן, במקום, מוכן לשימוש collagenase מטוהר / קוקטייל פרוטאז ניטראלי, Accutase, יושם במעבדה; כאנזים מסחרי, זה הוכח כדי לספק תוצאות אמינות בתא התרבות 51. Accutase (פתרון ניתוק תא) ידוע ביעילות לנתק מקרופאגים מצלחות התרבות ללא גירוד, והכי חשוב, מבלי לאבד את פני השטח אנטיגנים 51. אנזים מוכן זה שימש גם כדי לעבד את העיכול של רקמות מערכת עצבים אדם ובעלי חיים, וכתוצאה מכך תאים מבודדים קיימא שנותרו קיימא לתקופה ארוכה, לאורך זמן, מאפשר לתרבית התאים שלהם 52. יתר על כן, פתרון זה גם שומר antigenicity CD24 בתאים מבודדים מרקמות מערכת עצבים מרכזיות 52. בהשוואה לLiberase-1, קוקטייל אחר של collagenase ופרוטאז הניטרלי, לא Accutase לא Liberase-1 ליצור אגרגטים DNA חופשיים; עם זאת, Accutase הוא זentler מ Liberase-1 במהלך ניתוק רקמה 52. בגלל זה, Accutase לא לנתק אגרגטים תא לאחר העיכול 52. כדי להתגבר על מגבלה זו, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כולל את disaggregation הרקמה האוטומטי של basalis decidua וdecidua parietalis לפני ניתוק הרקמה עם הפתרון. Accutase גם הוכיח את עליונותו לטריפסין בשימור CD44, סמן פני תא גזע סרטני 53. המחקרים של המעבדה שלנו ציינו באופן עקבי כי פתרון הניתוק משמר את אנטיגנים פני השטח. ואכן, הבדלים בין הפרעות הריון והריונות רגילים כבר נמצאו בביטוי של מספר סמנים תאיים ו תאיים במקרופאגים (CD14 + תאים), נויטרופילים (CD15 + תאים), תאי T (CD3 + תאים), ותאי B (CD19 + תאים), כולל CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IGD, CD5, T-הימור, GATA-3, וRORγt, ובשחרור ציטוקינים. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוא אופטימלי עבור immunophenotyping של לויקוציטים חדירה בממשק אימהי-העוברי האנושי כפי שמוצגים בתוצאות הנציג.
יתרון חשוב של הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוא שהיא מאפשרת לבידוד של כדוריות דם לבנות עם תשואה גבוהה של תאי קיימא. הנתונים מראה כי הנציג> 90% של התאים המבודדים הם בת קיימא. זה הוא בעל חשיבות רבה כפרוטוקול זה אפשר המחקר של התכונות הפונקציונליות של התאים מבודדים מרקמות אנושיות בממשק אימהי-העוברי. לדוגמא, תרבויות של מקרופאגים decidual והמחקר של שחרור ציטוקינים תחת גירוי בוצעו תוך שימוש בפרוטוקול זה.
כדי להשיג תוצאות מוצלחות באמצעות הפרוטוקול המתואר, חשוב לשקול את הגורמים הבאים: 1) collecti הרקמהבחייב להתבצע בתוך 1-2 שעות לאחר לידה, ורקמות אלה חייבים להיות ממוקמים במכל עם 1x PBS ב 4 ° C כדי לשמר את יכולת הקיום של התאים המבודדים; 2) disaggregation רקמה המכני חייבת להתבצע באמצעות homogenizer אוטומטי בזמנים תוקף, כפי שתואר בפרוטוקול זה; 3) משך הדגירה עם פתרון ניתוק התא חייב להיות פחות משעה 1 מאז את פעילותה לאחר זמן זה פוחת; 4) בטמפרטורה של דגירה עם פתרון ניתוק תא יש לשמור על 37 מעלות צלזיוס להשיג את הפעילות האופטימלית של אנזים זה; 5) המניפולציה תא גלולה חייב להיעשות בעדינות עם micropipettes כי שימוש במערבולת יכולה לפגוע בשלמות של התאים (זוכר שתאים מבודדים הם מניפולציה מובחנת ופתאומית יכולה בקלות להפחית את הכדאיות שלהם); 6) חיץ וטמפרטורות צנטריפוגות חייבת להישמר באותה הטמפרטורה כמו ההשעיה התא; 7) תאים מבודדים חייבים להיות מעובד לimmunophenotyping או משמשים מידיותately ככדאיות שלהם מפחיתה במהירות; ו -8) בעת ביצוע immunophenotyping, דגימות חייבות להיות נרכשו באמצעות cytometer זרימה מייד לתוצאות הטובות ביותר.
אחת המגבלות של פרוטוקול זה הוא העלות של Accutase, שהוא יקר יותר מאנזימים אחרים עם פונקציות דומות, למשל, טריפסין, dispase השנייה, וcollagenase. עם זאת, היתרונות שAccutase מציג מעל ומעבר לאנזימים אלה הם מעולים. מגבלה שנייה של הפרוטוקול היא הדרישה של Dissociator רקמה אוטומטי, שאינו מכשיר מעבדה משותף, ולכן, יכול להיות יקר. כדי להתגבר על מגבלה זו, ביטול הפרדת הרקמות יכול גם להתבצע באמצעות מספריים כירורגיות קטנים; עם זאת, בשלב זה לא יעלה על 3-5 דקות מאז תקופות ארוכות יותר כבר הוכיחה כדי להפחית את התשואה של תאי קיימא. כל ההתנתקויות חייבת להתבצע על ידי אותו החוקר למזער שונות.
לסיכום, פרוtocol מסמך מציע גישה חדשנית המשלבת את השימוש בטכניקות ניתוק רקמה מכאניות והאנזימטית עדינות לשמור על השלמות של סמנים תאיים ו תאיים בלויקוציטים מבודד מהרקמות האנושיות בממשק אימהי-העוברי. מלבד immunophenotyping, תרבית תאים, ומיון תא, היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם רבים ומגוונים. אנחנו כבר בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה כדי לבודד לויקוציטים decidual ללימודים במבחנה פונקציונאלית יקוציט (כלומר, רעיל, התפשטות תאי T וגמישות, וכו '), וייצור של מיני חמצן מגיבים בלויקוציטים מבודד מרקמות decidual (נתונים לא מוצג). ואכן, באמצעות הפרוטוקול המתואר, המעבדה שלנו הייתה מסוגלת לתאר לויקוציטים החדשים והנדירים בממשק אימהי-העוברי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכון יוניס קנדי שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם, NIH / DHHS. עבודה זו נתמכה גם, בחלקו, על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. הכרת תודה אנו מודים מורין McGerty (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
