Abstract
A gravidez é caracterizada pela infiltração de leucócitos nos tecidos reprodutivos e na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal). Essa interface é o sítio anatômico de contato entre mãe e tecidos fetais; por conseguinte, é um local de acção imunológica durante a gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal de desempenhar um papel central na implantação, manutenção da gravidez, e tempo de entrega. Portanto, caracterizações fenotípicas e funcionais desses leucócitos irá fornecer insights sobre os mecanismos que levam a distúrbios de gravidez. Vários protocolos têm sido descritos, a fim de isolar a partir de leucócitos de infiltração a decídua basal e parietal decidua; no entanto, a falta de coerência nos reagentes, enzimas, e os tempos de incubação torna difícil comparar estes resultados. Descreve-se aqui uma nova abordagem que combina a utilização de Diss mecânicas e enzimáticas suavesociation técnicas para preservar a viabilidade e a integridade dos marcadores extracelulares e intracelulares em leucócitos isolados a partir dos tecidos humanos na interface materno-fetal. Além de imunofenotipagem, cultura de células, e separação de células, as futuras aplicações deste protocolo são numerosos e variados. Seguindo este protocolo, os leucócitos isolados podem ser usados para determinar a metilação do ADN, expressão de genes alvo, em termos de funcionalidade in vitro de leucócitos (isto é, a fagocitose, a citotoxicidade, proliferação de células T, e plasticidade, etc), e a produção de espécies reactivas de oxigénio na interface materno-fetal. Além disso, utilizando o protocolo descrito, este laboratório tem sido capaz de descrever novos e raros leucócitos na interface materno-fetal.
Introduction
A gravidez é caracterizada por três fases distintas: 1 imunológicos) implantação e placentação precoce associada com uma resposta pro-inflamatória (isto é, o implante se assemelha a um "ferida aberta"); 2) o segundo trimestre da gravidez, a maior parte do terceiro trimestre de gravidez quando homeostase imune é alcançada através de um estado predominantemente anti-inflamatório na interface materno-fetal; e 3) o parto, um estado pró-inflamatório 1-7. Células do sistema imunológico desempenha um papel importante na regulação da resposta inflamatória na interface materno-fetal, onde sua abundância e mudança de localização durante toda a gravidez 6-9.
Nos seres humanos, a interface materno-fetal representa uma área de contacto directo entre materna (decídua) e fetal (cório ou trofoblasto) tecidos. Esta interface inclui: 1) a decídua parietal que reveste a cavidade uterina não coberta pela placenta e está em justaposiçãopara o córion liso; e 2) os decídua basal, localizados na placa basal da placenta, onde é invadido por trofoblastos intersticiais 10 (Figura 1). A intimidade dessas áreas de contato cria condições para a exposição antigênica fetal à 11-13 sistema imunológico materno. Não surpreendentemente, leucócitos compreender até 30-40% das células deciduais 8,9,14,15 além de células do tipo do estroma e as células glandulares típicos 8,14,16. O papel dos leucócitos na interface materno-fetal engloba vários processos que incluem a limitação da invasão do trofoblasto 17, remodelação das artérias em espiral 18,19, manutenção da tolerância materna 12,20, eo início do trabalho de parto 21-26. Leucócitos de ambos os membros adaptativa e inata do sistema imune, isto é, células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, células NK, e foram identificados em tecidos deciduais, e suasproporções e estado de activação ter sido demonstrado que variam espacialmente e temporalmente ao longo da gestação 6-10,12,14,24,27-30. Perturbações na população e / ou função de leucócitos estão associados com aborto espontâneo 31, pré-eclâmpsia 32, restrição de crescimento intrauterino 32,33, e trabalho de parto prematuro 7,24. Por conseguinte, o estudo das suas características fenotípicas e funcionalidade de leucócitos na interface materno-fetal humano facilitará a elucidação das vias desreguladas em perturbações imunológicas gravidez.
Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para determinar o fenótipo e as propriedades funcionais de leucócitos é a citometria de fluxo, a tecnologia que permite a análise quantitativa de vários parâmetros simultaneamente 34-36. Para análise de leucócitos por citometria de fluxo, é necessário o isolamento de leucócitos de uma suspensão de célula única. Por conseguinte, um método para separar Leu infiltrantekocytes a partir da interface materno-fetal é necessária para estudar a sua fenotípica e propriedades funcionais.
Vários métodos têm sido descritos para isolar leucócitos a partir da interface materno-fetal humano 10,14,25,27,37-39. Enquanto alguns se aplicam desagregação mecânica 10,25,27,38, outros usam digestão enzimática 37,40 para a dissociação do tecido. Porque desagregação mecânica produz um rendimento mais baixo e reduziu a viabilidade 41, e dissociação enzimática pode afectar a viabilidade celular e a superfície de retenção do marcador 42, o método aqui descrito combina a dissociação mecânica suave com pré-tratamento enzimático para aumentar o rendimento de leucócitos isolados, sem comprometer a viabilidade celular. Uma combinação similar de métodos tem sido demonstrado ser eficaz no isolamento de leucócitos a partir de tecidos deciduais na interface materno-fetal 39. Portanto, o protocolo aqui descrito envolve a mechadesagregação nica com um Dissociator tecido automático que aumenta a consistência, poupando tempo e trabalho quando comparado ao picar tradicional com bisturis, lâminas de barbear opostas, ou tesoura cirúrgica 10,28. O enzima escolhido para a dissociação de tecidos foi Accutase. Ao contrário de colagenase comumente usados 43, Dispase 44, e tripsina 45, Accutase (uma solução de desprendimento de células) combina proteolítica geral e as actividades que contribuem para colagenolíticas eficiente dissociação ainda suave 46,47. Depois de dissociação, os leucócitos são enriquecidos da população total das células deciduais por centrifugação em gradiente de densidade. Vários meios de gradiente de densidade foram anteriormente utilizados, o mais comum dos quais são de Percoll (uma suspensão de partículas de sílica coloidal) e Ficoll a 48 (um polímero de sacarose com um peso molecular elevado sintético) 49. A maior eficácia de isolamento por o polímero de sacarose foi previously mostrado 50, e o protocolo descrito aqui ainda prova que esta mídia gradiente de densidade produz uma pureza suficientemente elevada de leucócitos mononucleares.
Assim, o protocolo aqui descrito combina a desagregação mecânica do tecido com um tecido Dissociator automática, a digestão enzimática com uma solução de separação celular, e separação de leucócitos com um meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para isolar leucócitos de tecidos deciduais humanas. Este protocolo foi comprovada para preservar os antigénios da superfície das células, juntamente com a viabilidade celular. Os leucócitos isolados podem ser usados em várias aplicações que incluem a imunofenotipagem com a citometria de fluxo e estudos funcionais in vitro.
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Protocol
Este protocolo é apropriado para o isolamento de leucócitos dos decídua basal e parietalis decídua em preparação para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Além disso, as células isoladas podem ser utilizadas para selecção de células, cultura de células, o isolamento de RNA, e citologia. Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética humana deve ser obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa local e Conselhos de Revisão Institucional. A recolha e utilização de amostras humanas para fins de investigação foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) Eunice Kennedy Shriver, Institutos Nacionais de Saúde (NIH), Departamento de Saúde e Serviços Humanos (DHHS , Bethesda, MD, EUA) e Wayne State University (Detroit, MI, EUA). Consentimento informado por escrito foi obtido de todas as mulheres grávidas, antes da colheita de amostras de tecido.
NOTA: Ao trabalhar com sangue animal, células, ou de perigoagentes ous como mencionado neste protocolo, é essencial que biossegurança adequado e ações de segurança de laboratório ser seguido.
1. A dissecção das deciduais Tecidos Humanos
NOTA: A placa basal é a base por baixo e ligado à placenta e representa a face materna. As membranas corioamnióticas incluem o âmnio e cório. A placa basal inclui os decídua basal e o cório inclui os decídua parietal (Figura 1).
- Decídua Basalis
- Dissecar uma parte da placa basal de um cotilédone da placenta (Figuras 1A e 1B).
- Coloque-o sobre uma tábua de corte estéril com as vilosidades da placenta voltadas para cima. O lado que mostra as vilosidades da placenta é geralmente vermelho sangrento com tecido cabeludo na aparência. A placa basal é suave e pálido de cor vermelha.
- Use afiados, tesouras de ponta fina e uma pinça para remover o villtecidos e vasos sanguíneos OUs. Manter o tecido embebido em 1x PBS (Ca2 + - Mg2 + e - livre) durante o processo (Figura 1C). Recolha 2-3 destas peças e lave-os abundantemente com 1x PBS para remover o sangue (Figura 1D).
- Decídua parietal
- Dissecar uma parte das membranas corioamnióticas (aproximadamente 10 cm x 10 cm, Figura 1E). Coloque-o sobre a placa com a chorion voltada para cima. O lado coriônica contém coágulos de sangue e é geralmente luz amarelada na cor.
- Use uma pinça de ponta fina para remover o maior número de coágulos de sangue como possível (Figura 1E). Lavar a membrana em 1x PBS estéril para limpar o excesso de sangue a partir da membrana até que o PBS 1x corre claro.
- Use um raspador de células estéril descartável para raspar suavemente a camada decidual a partir da membrana. Aplicar estéril 1x PBS na membrana ao completar este processo (Figura 1F). Recolher os tecidos deciduais e colocá-los em um tubo de plástico 50 ml com PBS estéril 1x (Figura 1G).
2. mecânica desagregação e digestão enzimática
- Lavar o tecido dissecado do decídua basal (do passo 1.1.3) ou a decídua parietal (a partir do passo 1.2.3) com 1x PBS estéril num tubo de plástico de 50 ml. Recolhe pastilhas de tecido por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante situado acima da pelete de tecido cuidadosamente, sem perturbar o sedimento.
NOTA: neste momento, os peletes são muito solta porque contêm células vermelhas do sangue. Se o volume do pelete é de cerca de ou menos de 3 ml, de re-suspender o sedimento em 6 ml de solução de separação celular pré-aquecida a 37 ° C. Se o sedimento é maior do que 3 ml de volume, adicionar mais solução de desprendimento de células (cerca de 2 vezes adicionar the o volume das amostras de tecido). - Transfira os tecidos homogeneizados (decídua basal + descolamento célula de solução ou decídua parietal + solução separação celular) para um tubo C.
- Colocar o tubo C no Dissociator automática e executar o programa correspondente.
NOTA: O programa para a decídua basal é executado por 17 segundos com 668 no total tiros por prazo. O programa para os parietalis decídua é executado por 37 segundos com 235 no total tiros por prazo. Estes programas foram personalizados para isolar leucócitos dos decídua basal ou os parietalis decídua com bom rendimento e viabilidade celular. - Após a desagregação mecânica dos tecidos, digerir os tecidos com uma solução de separação celular comercialmente disponível, como Accutase; (Um cocktail que contém enzimas proteolíticas e colagenolíticas) durante 45 min a 37 ° C com agitação suave.
3. Isolamento de Leucócitos
- Após a incubação, adicionar 10 ml de PBS 1x ao Digestion mistura e passá-lo através de um filtro de células 100 mm em um tubo de plástico de 50 ml. Dependendo da viscosidade da mistura de digestão, pode-se precisar de utilizar vários filtros de células para uma mistura.
- Encher o tubo com 1x PBS e centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o PBS 1x acima dos sedimentos celulares cuidadosamente e re-suspender as pelotas com 5 ml de tampão de FACS gelada.
NOTA: Para estudar os polimorfonucleares e mononucleares leucócitos juntos, vá para o Passo 6.1; para estudar os leucócitos mononucleares, continue com a Etapa 3.3. - Adicionar 5 ml de 20% de meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para um tubo de 15 ml de plástico e sobrepor-se lentamente a suspensão de células no topo do meio de gradiente de densidade. Enquanto estratificação da amostra, é importante não misturar a mídia gradiente de densidade com a suspensão de células.
- Centrifugar com um rotor basculante para fora a 500 xg durante 30 min a 4 ° C sem o travão. É muito importante para desativar o freio para evitar misturar as células e lOsing o gradiente. Os leucócitos podem ser encontrados na interface entre o meio de gradiente de densidade e o tampão de SCAF.
- Retirar a camada superior que contém o tampão e detritos de células FACS muito cuidadosamente utilizando uma pipeta. A banda na interface contém as células deciduais mononucleares e uma porção dos leucócitos polimorfonucleares.
- Transferir as células na interface completamente para um novo tubo de plástico de 15 ml. Adicionar, pelo menos, três vezes mais o volume de tampão de FACS.
- Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos para peletizar as células. Aspirar o sobrenadante e lava-se as células com tampão de SCAF. Peletizar as células com uma outra centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
NOTA: Para realizar a cultura de células, consulte Passo 4. Para executar separação de células, consulte Passo 5. Para realizar a imunofenotipagem, consulte a Etapa 6.
4. Aplicações - cultura celular
- Re-suspender as células do Passo 3,7 em 1 ml de meio de cultura RPMI 1640. Contar as células viáveis using contador automático de células ou um hemocitômetro e uma solução de azul de trypan 0,4%.
- Adicionar-se a quantidade de meio de cultura RPMI para fazer uma concentração de células de 1 x 10 6 células / ml. As células estão agora prontos para a cultura.
5. Aplicações - Isolamento de macrófagos para a Cultura celular primária
- Para isolar CD14 + células, magneticamente marcar as células do passo 3.7 com microesferas de CD14 (20 ul por esferas 10 7 células), incubar durante 15 minutos a 4 C, e CD14 + células separado a partir de outros tipos de células através da aplicação de um campo magnético. Após 2 lavagens com tampão de MACS e remoção do campo magnético, eluir as células CD14 + magneticamente retidos com tampão MACS.
- A seguir à centrifugação, re-suspender as pelotas celulares em meio de cultura RPMI 1640. As células estão prontas para o chapeamento (Figura 2).
6. Aplicações - imunofenotipagem
- Para usar as células para immunophenotyping, re-suspender as células do Passo 3,7 em 1 ml de 1x PBS. Contar as células viáveis utilizando um contador de células automático ou um hemocitómetro e uma solução de azul de tripano a 0,4%.
- Rotular as células com um corante de viabilidade fixável (Figura 3). Lavar as células duas vezes com tampão FACS e suspender novamente as células em tampão de coloração. Incubar com um bloqueador de FcR durante 15 min a 4 ° C.
- Adicionar anticorpos conjugados com fluorocromos extracelulares. Por exemplo, neste protocolo, usar anti-CD3, anticorpos anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 e anti-CD56 (Tabela 1). Incubar durante 30 min a 4 ° C, no escuro.
- Após duas lavagens com 1x PBS, as células serão analisados em 500 ul de tampão de coloração utilizando um citómetro de fluxo. Uma representação da estratégia de propagação usados para analisar as subpopulações de leucócitos foram encontrados nos tecidos deciduais é mostrado na Figura 4.
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Representative Results
. A dissecção de tecidos humanos na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal) é mostrado na Figura 1 Este procedimento inclui a dissecção da placa basal, que inclui os decídua basal (Figura 1A - D). A decídua basal é obtido pela remoção da vilosidade placentário (lado fetal) a partir da placa basal (Figura 1C). A parietal decidua é recolhido por raspagem suave da membrana coriónica (Figura 1E - F). A Figura 2 mostra a morfologia dos macrófagos isolados (CD14 +) recolhidas a partir das parietal decidua em uma gravidez termo utilizando separação de células magnético. Isolado macrófagos mantida a capacidade de libertação de citoquinas, após 3 dias de cultura (dados não mostrados). O rendimento de células viáveis isolados das decídua basal e parietal decidua é mostrado na Figura 3, e é maior do que 90% em ambos.
Figura 1. humano materno-fetal da interface:. Placenta e das membranas corioamnióticas (A) placa basal é dissecada da placenta; (B) da placa basal é separado do vilosidade placentário; (C) vilosidades placentária é cortado a partir da placa de base incluindo as decídua basal; (D) basa decídua lis é lavado em 1x PBS; (E) um fragmento da membrana coriónica é obtida e a formação de coágulos de sangue são cuidadosamente removidos; (F) parietalis decídua é suavemente raspada; e (G) parietalis decídua (linha pontilhada) é separada da membrana coriônica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. deciduais macrófagos em cultura. Os macrófagos (células CD14 +) foram isolados a partir das parietal na decídua termo gravidez. Os macrófagos foram plaqueadas em lâminas com câmara de plástico com RPMI1640 + 10% de FBS + 1% de Penicilina-Estreptomicina + 50 ng / ml MCSF. As fotografias foram tiradas na altura do plaqueamento (A) e após 3 dias em cultura (C).3 / "target =" _ blank 52863fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. viabilidade celular total. A viabilidade das células totais isolados a partir dos decídua basal e a decídua parietal foi determinada seguinte gradiente de densidade utilizando um corante de viabilidade fixável (passo 6.2). Viabilidade de células isoladas é> 95% de acordo com a coloração de viabilidade celular ao vivo / morto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. estratégia Gating para leucócitos decidual sub-populações. Os leucócitos foram fechado com FSC e SSC. As células vivas foram, em seguida, fechado de acordo com a porta de viabilidade (vivo). As células viáveis foram separados em neutrophils (CD15 +) e macrófagos (CD14 +). A população CD14-CD15- foi então ainda separados em células NK (CD3-CD56 +), células NKT (CD3 + CD56 +), células T (CD3 +) e células B (CD19 +). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 5. Leucócitos sub-populações nos tecidos deciduais neutrófilos (CD15 +) e macrófagos (CD14 +) foram fechado dentro do portão de viabilidade; As células T (CD3 +) e células B (CD19 +) foram fechado dentro do portão CD14-CD15-. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. leucócitos Raras sub-populações do decidtecidos ual. células NK (CD56 +) e células NKT (CD56 + CD3 +) foram fechado dentro do portão CD14-CD15-. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Lista anticorpo | Companhia | Catalog No. |
| BD Pharmingen anti-humano CD56-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557747 |
| BD Horizon Anti-humano CD15-BV605 | BD Biosciences | 562980 |
| BD Horizon Anti-humano CD14-BUV395 | BD Biosciences | 563561 |
| BD Horizon Anti-humano CD19-BUV737 | BD Biosciences | 564303 |
| Violeta brilhante 650 anti-humano CD3 | BioLegend | 317323 |
Tabela 1. Lista de anticorpos utilizado para leucócitos subconjunto imunofenotipagem
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Discussion
Caracterização das propriedades funcionais e fenotípicas de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal humana é essencial para a compreensão dos mecanismos imunes que levam a desordens gravidez. Diversas técnicas têm sido descritas, a fim de isolar leucócitos da interface materno-fetal humano durante a gravidez 10,14,25,28,37,42,43. No entanto, cada uma destas técnicas é distinto, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos diferentes de dissociação, não especifica quantidades de tecido, e, mais importante ainda, não sempre especificar a viabilidade das células isoladas. O protocolo aqui descrito permite o isolamento de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal humano (decídua basal e decídua parietal), resultando num rendimento elevado de viabilidade e fornece informações detalhadas sobre os reagentes comerciais, tampão de preparação, as quantidades de tecido, e os tempos de incubação validated em nosso laboratório.
O primeiro passo crucial do processo de isolamento de leucócitos é a dissociação de tecidos; Esta etapa envolve a desagregação mecânica e / ou dissociação enzimática. Desagregação mecânica é executada com sucesso por raspagem do córion quando se isola o decídua parietal (Figura 1F) e aparando as vilosidades placentária da placa basal quando se isola os decídua basal (Figura 1C) 10,28. Portanto, o protocolo aqui descrito inclui ambos os procedimentos dos passos iniciais. No entanto, é importante considerar que a placa basal (tecidos maternos) e as vilosidades placentária (tecidos fetais) estão intimamente ligados, que podem causar contaminação de leucócitos fetais quando se isola a partir de leucócitos a decídua basal. Para evitar a contaminação do feto, o protocolo aqui recomenda lavagem da placa basal aparada duas ou três vezes (Figura 1D). Na sequência raspagem celular ou aparandodos decídua basal ou decídua parietal, uma etapa adicional para a desagregação do tecido mecânico tem sido recomendado 39. Este passo é recomendado porque os leucócitos que se infiltram na interface moléculas de adesão celular materno-fetais expressos que firmemente anexá-los à matriz extracelular 6,7. Portanto, o protocolo aqui descrito envolve a desagregação mecânica com um Dissociator tecido automático que aumenta a consistência, poupando tempo e trabalho quando comparado ao picar tradicional com bisturis, lâminas de barbear ou tesoura cirúrgica 10,28.
Um segundo passo crítico no processo de dissociação do tecido é de dissociação enzimática. Enzimas de solteiro e uma combinação de enzimas diferentes foram usados para isolar leucócitos infiltrantes dos decídua basal e decídua parietal 10,14,25,28,37,42,43. Em muitos casos, essas enzimas preparadas para uma determinada concentração à mão no laboratory pode estar sujeito a erro humano. Aqui, em vez disso, um ready-to-use colagenase purificados / cocktail protease neutra, Accutase, foi implementado em laboratório; como uma enzima comercial, tem sido mostrado para fornecer resultados fiáveis em cultura de células de 51. Accutase (uma solução de separação celular) é conhecida para separar eficazmente macrófagos de placas de cultura sem raspagem e, mais importante ainda, sem perder antígenos de superfície 51. Esta enzima também preparado foi usado para processar a digestão de tecidos do sistema nervoso humano e animal, resultando em células isoladas viáveis que permanecem sustentável durante um longo período de tempo que, ao longo do tempo, permite a sua cultura de células 52. Além disso, esta solução também preserva a antigenicidade de CD24 em células isoladas a partir de tecidos do sistema nervoso central 52. Quando comparado com Liberase-1, outro coquetel de colagenase e protease neutra, nem Accutase nem Liberase-1 gerar agregados de DNA livres; no entanto, é g AccutaseEntler de Liberase-1 durante a dissociação do tecido 52. Devido a isso, Accutase não se dissocia os agregados de células após a digestão 52. Para superar esta limitação, o protocolo aqui descrito inclui a desagregação de tecido automática dos decídua basal e decídua parietal antes da dissociação do tecido com a solução. Accutase também demonstrou sua superioridade para tripsina na preservação do CD44, uma haste do cancro da superfície celular marcador 53. Os estudos de nosso laboratório foram consistentemente notar-se que a solução de desprendimento preserva os antigénios de superfície. Na verdade, as diferenças entre os transtornos da gravidez e gravidezes normais foram encontrados na expressão de vários marcadores extracelulares e intracelulares em macrófagos (células CD14 +), neutrófilos (CD15 + células), células T (células T CD3 +) e células B (CD19 + células), incluindo CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3 e RORγt, e na libertação de citoquinas. Portanto, o protocolo aqui descrito é óptima para a imunofenotipagem de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal humano, como mostrado nos resultados representativos.
Uma vantagem importante do protocolo aqui descrito é que ele permite o isolamento de leucócitos com um elevado rendimento de células viáveis. Os dados representativo mostra que> 90% das células isoladas são viáveis. Isto é de grande importância como este protocolo permitiu o estudo das propriedades funcionais das células isoladas a partir de tecidos humanos na interface materno-fetal. Por exemplo, as culturas de macrófagos deciduais e o estudo da libertação de citocina sob estimulação ter sido realizada utilizando este protocolo.
Para alcançar bons resultados, usando o protocolo descrito, é importante considerar os seguintes factores: 1) tecido Collectino deve ser realizada dentro de 2/1 hora após o parto, e esses tecidos devem ser colocados num recipiente com 1x PBS a 4 ° C para preservar a viabilidade das células isoladas; 2) a desagregação mecânica do tecido deve ser realizada utilizando um homogeneizador automática às vezes validadas, tal como descrito neste protocolo; 3) A duração da incubação com a solução de separação celular deve ser inferior a 1 hora uma vez que a sua actividade após esse tempo diminui; 4) a temperatura de incubação com a solução de separação celular deve ser mantida a 37 ° C para se obter a actividade óptima da presente enzima; 5) manipulação sedimento celular deve ser feito cuidadosamente com micropipetas porque o uso do vórtice pode danificar a integridade das células (lembrar que as células são isoladas a manipulação diferenciada e abrupta pode facilmente reduzir a sua viabilidade); 6) de tampão e temperaturas de centrifugação deve ser mantida à mesma temperatura como a suspensão de células; 7) células isoladas devem ser tratados para imunofenotipagem ou usado imedamente como a sua viabilidade reduz rapidamente; e 8) ao realizar a imunofenotipagem, as amostras devem ser adquiridos usando um citômetro de fluxo imediatamente para obter melhores resultados.
Uma das limitações do presente protocolo é o custo de Accutase, que é mais caro do que outras enzimas com funções semelhantes, como por exemplo, tripsina, dispase II, e colagenase. No entanto, as vantagens que a Accutase é exibida para além desses enzimas são superiores. Uma segunda limitação do protocolo é a exigência de uma Dissociator tecido automático, que não é um instrumento de laboratório comum e, portanto, pode ser caro. Para superar esta limitação, a desagregação de tecido também pode ser realizada usando pequenas tesouras cirúrgicas; no entanto, este passo não pode exceder 3-5 minutos, uma vez que os períodos mais longos foram demonstrados para reduzir o rendimento das células viáveis. Todos os dissociações devem ser realizadas pelo mesmo investigador para minimizar a variabilidade.
Em resumo, o próprotocolo aqui oferece uma nova abordagem que combina a utilização de técnicas de dissociação de tecido mecânicos suaves e enzimáticas para preservar a integridade dos marcadores extracelulares e intracelulares em leucócitos isolados a partir dos tecidos humanos na interface materno-fetal. Além de imunofenotipagem, cultura de células, e separação de células, as futuras aplicações deste protocolo são numerosos e variados. Temos sido sucesso usando esse protocolo para isolar leucócitos deciduais para estudos in vitro de funcionalidade de leucócitos (ou seja, citotoxicidade, proliferação de células T e plasticidade, etc.), e produção de espécies reativas de oxigênio nos leucócitos isolados de tecidos deciduais (dados não mostrando). De facto, utilizando o protocolo descrito, o nosso laboratório tem sido capaz de descrever novos e raros leucócitos na interface materno-fetal.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional Kennedy Shriver Eunice de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, NIH / DHHS. Este trabalho também foi apoiado, em parte, pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty (Wayne State University) para suas leituras críticas do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
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