Abstract
Schwangerschaft wird durch die Infiltration von Leukozyten in der reproduktiven Gewebe und an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Decidua basalis und Dezidua parietalis) gekennzeichnet. Diese Schnittstelle ist der anatomischen Stelle der Kontakt zwischen Mutter und Fetus Gewebe; es ist daher ein immunologisches Wirkort während der Schwangerschaft. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus Schnittstelle spielen eine zentrale Rolle bei der Implantation, Schwangerschaft Wartung, und der Zeitpunkt der Lieferung. Daher werden phänotypische und funktionelle Charakterisierung dieser Leukozyten Einblick in die Mechanismen, die zu Schwangerschaftsstörungen führen werden. Verschiedene Protokolle haben, um zu isolieren infiltrierenden Leukozyten aus der Dezidua basalis und Dezidua parietalis beschrieben; Jedoch macht der Mangel an Übereinstimmung in den Reagenzien, Enzyme und Inkubationszeiten es schwierig, diese Ergebnisse zu vergleichen. Hierin wird ein neuartiger Ansatz, der die Verwendung von sanften mechanischen und enzymatischen diss kombiniertereinigung Techniken, um die Lebensfähigkeit und Integrität der extra- und intrazellulären Markern in Leukozyten aus den menschlichen Geweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle getrennt zu bewahren. Abgesehen von Immunphänotypisierung, Zellkultur und Zellsortierung, die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls sind zahlreich und vielfältig. Nach diesem Protokoll können die isolierten Leukozyten verwendet werden, um DNA-Methylierung, die Expression von Zielgenen, in vitro Leukozyten Funktionalität (dh die Phagozytose, Zytotoxizität, T-Zellproliferation und Plastizität, etc.), und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies zu bestimmen an der Mutter und Fötus-Schnittstelle. Zusätzlich mit dem beschriebenen Protokoll wurde dieses Labor in der Lage, neue und seltene Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zu beschreiben.
Introduction
Schwangerschaft wird durch drei verschiedene immunologische Phasen gekennzeichnet: 1) der Implantation und der frühen Plazentation mit einer pro-inflammatorische Reaktion verbunden (dh der Implantation ähnelt eine "offene Wunde"); 2) dem zweiten Trimester und das meiste des dritten Trimesters der Schwangerschaft, wenn Immunhomöostase wird durch eine überwiegend anti-entzündlichen Zustand an der mütterlich-fötalen Grenzfläche erreicht; und 3) der Geburt, einer pro-inflammatorischen Zustand 1-7. Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Entzündungsreaktion an der Mutter und Fötus-Schnittstelle, wo ihre Fülle und Lokalisierung Veränderung während der Schwangerschaft 6-9.
Bei Menschen, die Mutter und Fötus-Schnittstelle stellt einen Bereich des direkten Kontakts zwischen mütterlichen (decidua) und fetale (Chorion oder Trophoblast) Gewebe. Diese Schnittstelle umfasst: 1) die Decidua parietalis, die Linien der Gebärmutterhöhle nicht von der Plazenta bedeckt und in Juxtapositionauf die Chorion laeve; und 2) der Dezidua basalis, in der Basalplatte der Plazenta, wo es durch interstitielle Trophoblasten 10 (1) eingedrungen entfernt. Die Intimität dieser Kontaktbereiche schafft die Voraussetzungen für die fetale Antigen-Exposition gegenüber dem mütterlichen Immunsystem 11-13. Nicht überraschend, umfassen Leukozyten bis zu 30-40% der Deciduazellen 8,9,14,15 neben typischen Stromazellen Typzellen und Drüsenzellen 8,14,16. Die Rolle der Leukozyten bei der mütterlich-fötalen Grenzfläche umfasst mehrere Prozesse, für die Begrenzung der Trophoblastinvasion 17, Umbau von Spiralarterien 18,19, Wartung der mütterlichen Toleranz 12,20 und Initiierung der Arbeits 21-26 enthalten. Leukozyten sowohl des adaptiven und angeborenen Schenkel des Immunsystems, dh T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen, B-Zellen, dendritische Zellen und NK-Zellen, sind in den decidual Geweben identifiziert worden, und ihreProportionen und Aktivierungsstatus wurde gezeigt, räumlich und zeitlich während der Gestation 6-10,12,14,24,27-30 variieren. Störungen in der Leukozyten-Population und / oder Funktion sind mit Spontanabort 31, Präeklampsie 32, intrauterine Wachstumsrestriktion 32,33 und Frühgeburt 7,24 verbunden. Daher wird die Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften und Funktionen von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle die Aufklärung der immunologischen Wege in Schwangerschaftsstörungen fehlreguliert zu erleichtern.
Eine der leistungsfähigsten Werkzeuge verwendet, um den Phänotyp und funktionellen Eigenschaften der Leukozyten zu bestimmen, ist Durchflusszytometrie Technologie, die die quantitative Analyse von mehreren Parametern gleichzeitig 34-36 ermöglicht. Leukozyten durch Durchflusszytometrie analysiert, wird die Isolierung der Leukozyten in einer Einzelzellsuspension benötigt. Daher ist ein Verfahren zur Abtrennung infiltrierenden leukocytes von der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt wird, um ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu studieren.
Es wurden mehrere Verfahren beschrieben worden, um Leukozyten aus dem menschlichen maternofetalen Schnittstelle 10,14,25,27,37-39 isolieren. Während einige gelten mechanische Aufschlüsselung 10,25,27,38, andere verwenden enzymatische Verdauung 37,40 für Gewebedissoziation. Da mechanische Zerlegung erzeugt eine geringere Ausbeute und verminderte Lebensfähigkeit 41 und enzymatische Dissoziation kann Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker Retention 42 beeinflussen, die hier beschriebene Methode kombiniert sanfte mechanische Dissoziation mit enzymatische Vorbehandlung, die Ausbeute an isolierten Leukozyten, ohne dabei die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Eine ähnliche Kombination von Methoden nachgewiesen wurde als wirksam bei der Isolation von Leukozyten aus der Dezidua-Gewebe an der mütterlich-fötalen Grenzfläche 39 ist. Daher sind die hierin beschriebenen Protokoll beinhaltet mechanische Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, die Konsistenz erhöht und spart Zeit und Arbeit, wenn die traditionellen Fleischwolf gegenüber gegnerischen Skalpelle, Rasierklingen, oder chirurgische Scheren 10,28. Die für Gewebedissoziation gewählten Enzym war Accutase. Anders als häufig verwendete Kollagenase 43, Dispase 44 und Trypsin 45, Accutase (a Zellablösung Lösung) kombiniert sowohl allgemeine proteolytischen und kollagenolytische Aktivitäten, die für eine effiziente und dennoch schonende Dissoziation 46,47 beizutragen. Nach Dissoziation werden die Leukozyten aus der Gesamtbevölkerung der Deciduazellen durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Verschiedene Dichtegradientenmedien zuvor verwendet worden, von denen die häufigsten sind Percoll (eine Suspension von kolloidalen Siliciumdioxidteilchen) 48 und Ficoll (ein Polymer aus Saccharose mit einem hohen synthetischen Molekulargewicht) 49. Die überlegene Effizienz der Trennung von der Saccharose Polymer wurde previonuierlich 50 gezeigt, und die hierin weiter beschriebenen Protokoll beweist, dass diese Dichtegradientenmedien erzeugt eine ausreichend hohe Reinheit von mononukleären Leukozyten.
Daher ist das hier beschriebene Protokoll verbindet die mechanische Gewebe Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, enzymatische Verdauung mit einer Zellentfernungslösung und Leukozyten-Trennung mit einem Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml), um Leukozyten aus menschlichen Dezidua-Gewebe zu isolieren. Dieses Protokoll ist nachgewiesen worden, Zelloberflächenantigene zusammen mit Zelllebensfähigkeit zu bewahren. Die isolierten Leukozyten kann für mehrere Anwendungen, die Immunphänotypisierung mit der Durchflusszytometrie und funktionelle Untersuchungen in vitro zählen verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieses Protokoll wird für Leukozyten isoliert von den Decidua basalis und Dezidua parietalis in der Vorbereitung für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie geeignet. Weiterhin können die isolierten Zellen für die Zellsortierung, Zellkultur, RNA-Isolierung und der Zytologie verwendet werden. Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen menschliche ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und Institutional Review Boards erhältlich. Die Sammlung und Nutzung der menschlichen Proben zu Forschungszwecken wurden von den Institutional Review Boards der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Department of Health and Human Services (DHHS genehmigt , Bethesda, MD, USA) und der Wayne State University (Detroit, MI, USA). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen schwangeren Frauen vor der Entnahme von Gewebeproben erhalten.
HINWEIS: Während der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder GefahrenGehilfen, wie in diesem Protokoll erwähnt, ist es wichtig, dass die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden.
1. Dissection der Menschen Deziduale Tissues
HINWEIS: Die Basalplatte ist die Basis unterhalb und Plazenta befestigt und stellt die mütterliche Oberfläche. Die chorioamniotic Membranen sind das Amnion und Chorion. Die Basalplatte umfasst die Decidua basalis und das Chorion umfasst die Decidua parietalis (Abbildung 1).
- Decidua Basalis
- Sezieren ein Stück der Basalplatte von einem Keimblatt der Plazenta (1A und 1B).
- Legen Sie sie auf einem sterilen Schneidebrett mit den Plazentazotten nach oben zeigt. Die Seite, die die Plazentazotten ist in der Regel blutig rot mit behaarten Gewebe in Erscheinung. Die Basalplatte ist glatt und blass in der Farbe rot.
- Verwenden Sie scharfe, feine Punkt Schere und Pinzette, um die vill entfernenous Gewebe und Blutgefäße. Halten Sie das Gewebe in 1x PBS eingeweicht während des Prozesses (Abbildung 1c) (Ca 2+ - kostenlos - und Mg 2+). Sammeln Sie 2 bis 3 dieser Stücke und spülen Sie sie gründlich mit 1x PBS, das Blut (1D) zu entfernen.
- Decidua parietalis
- Sezieren ein Stück der chorioamniotic Membranen (ungefähr 10 cm x 10 cm, 1E). Legen Sie sie auf dem Brett mit dem Chorion nach oben zeigt. Das Chorion-Seite enthält blutigen Klumpen und ist in der Regel leicht gelblich gefärbt.
- Verwenden Sie fein Punkt Pinzette möglichst viele der von Blutgerinnseln wie möglich (1E) zu entfernen. Spülen Sie die Membran in sterile 1x PBS, um das überschüssige Blut aus der Membran zu reinigen, bis die 1x PBS klar ist.
- Verwenden Sie eine sterile Zellschaber sanft kratzen die dezidualen Schicht von der Membran. Bewerben sterile 1x PBS auf der memBrane während Abschluss dieses Prozesses (1F). Sammeln Sie die dezidualen Gewebe und legen Sie sie in einem 50 ml-Kunststoffröhrchen mit sterilem 1x PBS (1G).
2. Mechanische Disaggregation und enzymatische Verdauung
- In einem 50 ml-Kunststoffrohr waschen das Gewebe aus der Dezidua basalis (aus Schritt 1.1.3) seziert oder Dezidua parietalis (aus Schritt 1.2.3) mit sterilem 1x PBS. Sammeln Gewebepellets durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT.
- Saugen Sie den Überstand über dem Gewebepellet befinden vorsichtig, ohne das Pellet aufzurühren.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden die Pellets sehr locker, da sie rote Blutzellen enthalten. Wenn das Volumen des Pellets beträgt etwa oder weniger als 3 ml, resuspendieren das Pellet in 6 ml Zellentfernungslösung auf 37 ° C vorgewärmt. Wenn die Pellets größer als 3 ml Volumen, fügen Sie mehr Zellablösung Lösung (fügen Sie etwa 2 mal the Volumen der Gewebeproben). - Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe (Decidua basalis + Zellablösung Lösung oder Dezidua parietalis + Zellablösung Lösung) zu einem C-Rohr.
- Legen Sie das C-Rohr in der automatischen Dissociator und führen Sie das entsprechende Programm.
HINWEIS: Das Programm für die Decidua basalis läuft für 17 sec mit 668 Gesamt Schuss pro Lauf. Das Programm für die Decidua parietalis läuft für 37 sec mit 235 Gesamt Schuss pro Lauf. Diese Programme wurden angepasst, um Leukozyten aus der Dezidua basalis oder der Dezidua parietalis mit guter Ausbeute und Lebensfähigkeit der Zellen zu isolieren. - Nach der mechanischen Disaggregation der Gewebe zu verdauen die Gewebe mit einer im Handel erhältlichen Zellablösung Lösung wie Accutase; (Ein Cocktail, der proteolytischen und kollagenolytische Enzyme enthält) für 45 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
3. Isolierung der Leukozyten
- Nach der Inkubation mit 10 ml 1x PBS auf die DIGElierte Gemischs und führt es durch einen 100 um Zellsieb in einen 50 ml Kunststoffrohr. In Abhängigkeit von der Klebrigkeit des Verdauungsgemisch, kann man brauchen, um mehrere Zellsiebe für eine Mischung zu verwenden.
- Füllen Sie den Schlauch mit 1x PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die 1x PBS über den Zellpellets sorgfältig und resuspendieren der Pellets mit 5 ml eiskaltem FACS-Puffer.
HINWEIS: Um die polymorphkernigen und mononukleären Leukozyten zusammen lernen, gehen Sie zu Schritt 6.1; um die mononukleären Leukozyten zu untersuchen, gehen Sie zu Schritt 3.3. - 5 ml 20% Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml) in ein 15 ml-Kunststoffrohr und langsam lagern die Zellsuspension auf der Oberseite des Dichtegradientenmedien. Während Schichtung der Probe ist es wichtig, nicht die Dichtegradientenmedien mit der Zellsuspension gemischt.
- Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor bei 500 xg für 30 min bei 4 ° C ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, schalten Sie die Bremse, um zu vermeiden, indem die Zellen und lOsing die Steigung. Leukozyten werden in der Schnittstelle zwischen dem Dichtegradienten Medien und der FACS-Puffer gefunden werden.
- Die obere Schicht, die die FACS-Puffer und Zelltrümmer enthält sehr vorsichtig mit einer Pipette. Das Band an der Schnittstelle enthält die decidual mononukleären Zellen und einen Teil der polymorphkernigen Leukozyten.
- Übertragen der Zellen an der Grenzfläche vollständig auf eine neue 15-ml-Plastikröhre. Fügen mindestens 3 mal mehr Volumen FACS-Puffer.
- Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer. Pelletisieren der Zellen mit einem weiteren Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT.
HINWEIS: Um die Zellkultur durchführen, finden Sie in Schritt 4. Zum Zellsortierung durchführen, finden Sie unter Schritt 5. Um Immunphänotypisierung durchführen, finden Sie in Schritt 6.
4. Anwendungen - Zellkultur
- Resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml RPMI 1640 Kulturmedium Zählen der lebensfähigen Zellen using eine automatische Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%.
- Addieren der Menge an RPMI-Kulturmedium, um eine Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml zu ergeben. Die Zellen sind nun bereit für Kultur.
5. Anwendungen - Isolierung von Makrophagen für Primärzellkultur
- CD14 + Zellen zu isolieren, magnetisch zu markieren, die Zellen aus Schritt 3.7 mit CD14 Microbeads (20 ul Perlen pro 10 7 Zellen), die Proben für 15 min bei 4 ° C und separate CD14 + Zellen aus anderen Arten von Zellen, die durch Anlegen eines Magnetfeldes. Nach 2 Waschvorgängen mit MACS-Puffer und Entfernen des Magnetfelds eluieren magnetisch gehalten CD14 + Zellen mit MACS-Puffer.
- Nach der Zentrifugation resuspendieren die Zellpellets in RPMI 1640 Kulturmedium werden die Zellen bereit für die Beschichtung (2).
6. Anwendungen - Immunphänotypisierung
- Um die Zellen auf immunophenot verwendenyping, resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml 1 × PBS. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%.
- Beschriften Sie die Zellen mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Farbstoff (Abbildung 3). Wasche die Zellen zweimal mit FACS-Puffer und Resuspension der Zellen in Puffer Fleck. Inkubieren mit einem FcR-Blocker für 15 min bei 4 ° C.
- In der extrazellulären Antikörpern gegen Fluorochrome konjugiert. Zum Beispiel wird in diesem Protokoll verwendet anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 und anti-CD56-Antikörpern (Tabelle 1). Inkubieren für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Nach 2 Waschvorgängen mit 1x PBS werden die Zellen in 500 ul Puffer Fleck unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert. Eine Darstellung der Gating-Strategie verwendet, um die Leukozyten-Subpopulationen in der Dezidua-Geweben zu analysieren, ist in 4 gezeigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Die Präparation von menschlichen Geweben auf der mütterlich-fötalen Grenzfläche (Dezidua basalis und Dezidua parietalis) ist in Abbildung 1 dargestellt Dieses Verfahren umfasst die Präparation der Grundplatte, die Decidua basalis (1A - D) enthält. Decidua basalis wird durch Entfernen des Plazentazotten (fötales Seite) von der basalen Platte (1C) erhalten. Decidua parietalis wird durch leichtes Abkratzen der Chorionmembran (1E - F) gesammelt. 2 zeigt die Morphologie von isolierten Makrophagen (CD14 +) aus Dezidua parietalis in einer Terminschwangerschaft mittels magnetischer Zellsortierung gesammelt. Isolierten Makrophagen behielt die Fähigkeit, Cytokine nach 3 Tagen Kultur freizusetzen (Daten nicht gezeigt). Die Ausbeute von lebensfähigen Zellen aus der Dezidua basalis und Dezidua parietalis isoliert in 3 dargestellt, und es ist mehr als 90% in beiden.
Abbildung 1. Menschliche Mutter und Fötus-Schnittstelle:. Plazenta und chorioamniotic Membranen (A) Basal Platte von der Plazenta seziert; (B) Grundplatte von der Plazentazotten getrennt sind; (C) Plazentazotten von der Basalplatte einschließlich der Dezidua basalis auch ausgestattet; (D) decidua Basa lis ist in 1x PBS gespült; (E) ein Fragment der Chorion-Membran erhalten wird, und Blutgerinnsel vorsichtig entfernt; (F) Dezidua parietalis wird vorsichtig abgeschabt; und (G) Decidua parietalis (gepunktete Linie) wird aus dem Chorion-Membran getrennt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Deziduale Makrophagen in Kultur. Makrophagen (CD14 + -Zellen) wurden aus der Dezidua parietalis an ausgetragenen Schwangerschaft isoliert. Makrophagen wurden in Kammer-Objektträgern aus Kunststoff mit RPMI1640 + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin + 50 ng / ml MCSF plattiert. Fotos wurden zum Zeitpunkt der Plattierung (A) entnommen und nach 3 Tagen in Kultur (C).3 / 52863fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Gesamtzelllebensfähigkeit. Die Lebensfähigkeit der gesamten Zellen aus den Decidua basalis isoliert und der Dezidua parietalis wurde folgende Dichtegradienten bestimmt mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Farbstoff (Schritt 6.2). Lebensfähigkeit der isolierten Zellen ist> 95% nach dem Live / Dead Zelllebensfähigkeit Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Gating-Strategie für dezidualen Leukozyten-Subpopulationen. Die Leukozyten wurden mit FSC und SSC gated. Lebende Zellen wurden dann nach der Lebensfähigkeit Gate (Live) sucht. Lebensfähige Zellen wurden in n getrennteeutrophils (CD15 +) und Makrophagen (CD14 +). Die CD14-CD15- Population wurde dann weiter in NK-Zellen (CD3-CD56 +), NKT-Zellen (CD3 + CD56 +) T-Zellen (CD3 +) und B-Zellen (CD19 +) voneinander getrennt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.
. Abbildung 5. Leukozyten-Subpopulationen in den dezidualen Gewebe Neutrophile (CD15 +) und Makrophagen (CD14 +) wurden innerhalb der Lebensfähigkeit Tor gated; T-Zellen (CD3 +) und B-Zellen (CD19 +) wurden innerhalb des CD14-CD15- Tor gated. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Rare Leukozyten-Subpopulationen in der DECIDual Gewebe. NK-Zellen (CD56 +) und NKT-Zellen (CD56 + CD3 +) wurden innerhalb des CD14-CD15- Tor gated. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Antikörper-Liste | Unternehmen | Catalog No. |
| BD Pharmingen Anti-Mensch-CD56-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557.747 |
| BD Horizon Anti-human CD15-BV605 | BD Biosciences | 562.980 |
| BD Horizon Anti-Mensch-CD14-BUV395 | BD Biosciences | 563.561 |
| BD Horizon Anti-human CD19-BUV737 | BD Biosciences | 564.303 |
| Brilliant Violet 650 Anti-human CD3-Antikörper | Biolegend | 317.323 |
Tabelle 1. Liste der Antikörper für Leukozyten-Untermenge verwendet Immunphänotypisierung
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Charakterisierung der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften der Infiltration von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle ist wesentlich für das Verständnis der Immunmechanismen, um eine Schwangerschaft zu Störungen führen. Es wurden mehrere Techniken, um Leukozyten aus dem menschlichen mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 10,14,25,28,37,42,43 isolieren beschrieben. Jedoch jede dieser Techniken unterscheidet, verwendet verschiedene Enzyme oder Enzymkombinationen, erfordert unterschiedliche Dissoziation Zeiten nicht Gewebemengen angeben, und, was am wichtigsten ist, ist nicht immer die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen angeben. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung von infiltrierenden Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle (Decidua basalis und Dezidua parietalis), was zu einer hohen Ausbeute an Lebensfähigkeit und bietet detaillierte Informationen über die kommerziellen Reagenzien, Pufferherstellung, Gewebe Mengen und Inkubationszeiten validated in unserem Labor.
Der erste wichtige Schritt des Leukozyten-Isolierungsverfahren ist Gewebedissoziation; dieser Schritt das mechanische desegregation und / oder enzymatische Spaltung. Mechanische desegregation erfolgreich durch Abschaben der Chorion, wenn die Isolierung des Dezidua parietalis (1F) und durch Trimmen der Plazentazotten von der Basalplatte, wenn die Isolierung der Dezidua basalis (1C) 10,28 durchgeführt. Daher sind die hierin beschriebenen Protokoll umfasst sowohl Verfahren als Anfangsschritten. Jedoch ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die Basalplatte (mütterliche Gewebe) und der Plazentazotten (fötales Gewebe) werden innig befestigt ist, zu einer Kontamination der fetalen Leukozyten bei der Isolierung von Leukozyten aus der Dezidua basalis verursachen können. Fetale Kontamination zu vermeiden, hier empfiehlt das Protokoll Waschen des getrimmten Basalplatte zwei oder drei Mal (Abbildung 1D). Nach Zell Kratz- oder Trimmenvon den Decidua basalis oder Dezidua parietalis, hat einen weiteren Schritt zur mechanischen Gewebe Aufschlüsselung empfohlen worden 39. Dieser Schritt wird empfohlen, da die Infiltration von Leukozyten an die Mutter und Fötus Schnittstelle express Zelladhäsionsmoleküle, die fest an sie an die extrazelluläre Matrix 6,7. Daher ist die hier beschriebene Protokoll beinhaltet die mechanische Zerlegung mit einer automatischen Gewebe Dissociator, die Konsistenz erhöht und spart Zeit und Arbeit im Vergleich zu traditionellen Fleischwolf mit Skalpellen, Rasierklingen, oder chirurgische Scheren 10,28.
Ein zweiter kritischer Schritt in der Gewebedissoziation Prozess enzymatische Dissoziation. Einzelenzyme und eine Kombination von verschiedenen Enzymen verwendet worden, der auf die Infiltration von Leukozyten aus der Dezidua basalis isolieren und Dezidua parietalis 10,14,25,28,37,42,43. In zahlreichen Fällen haben die Enzyme zu einer bestimmten Konzentration mit der Hand in der labora zubereitettory unterliegen können menschliche Fehler sein. Hier stattdessen eine ready-to-use gereinigte Collagenase / neutrale Protease-Cocktail, Accutase, im Labor durchgeführt wurden; als Handels Enzyms wurde gezeigt, um zuverlässige Ergebnisse in der Zellkultur 51 bereitzustellen. Accutase (a Zellablösung Lösung) ist bekannt, dass Makrophagen von Kulturplatten effektiv abzulösen, ohne Abfall und, was am wichtigsten ist, ohne dabei Oberflächenantigene 51. Diese vorbereitete Enzym wurde auch verwendet, um die Verdauung des menschlichen und tierischen Geweben des Nervensystems zu verarbeiten, was zu lebensfähigen Zellen isoliert, die für einen langen Zeitraum, dass im Laufe der Zeit ermöglicht die Zellkultur 52 nachhaltige bleiben. Darüber hinaus sichert diese Lösung auch CD24 Antigenität in Zellen von Zentralnervensystem Gewebe 52 isoliert. Wann Liberase-1, einem anderen Cocktail aus Kollagenase und neutraler Protease, weder Accutase noch Liberase-1 zu generieren freien DNA-Aggregate im Vergleich; jedoch Accutase gEntler als Liberase-1 während Gewebedissoziation 52. Aus diesem Grund ist nicht Accutase Zellaggregate dissoziieren nach dem Aufschluss 52. Um diese Beschränkung zu überwinden, sind die hierin beschriebenen Protokoll beinhaltet die automatische Gewebe-Disaggregation der Decidua basalis und Dezidua parietalis vor Gewebedissoziation mit der Lösung. Accutase hat auch seine Überlegenheit gegenüber Trypsin bei der Konservierung von CD44, einem Krebsstammzelloberflächenmarker 53 gezeigt. Untersuchungen unseres Labors haben immer darauf hingewiesen, dass die Ablösung Lösung bewahrt die Oberflächenantigene. Tatsächlich haben Unterschiede zwischen Schwangerschaftsstörungen und normalen Schwangerschaften in der Expression von mehreren extrazellulären und intrazellulärer Marker in Makrophagen (CD14 + -Zellen), Neutrophile (CD15 + -Zellen), T-Zellen (CD3 + Zellen) und B-Zellen gefunden worden (CD19 + -Zellen), einschließlich CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3 und RORγt und in Zytokin-Freisetzung. Daher ist das hier beschriebene Protokoll optimal für Immunphänotypisierung der Infiltration von Leukozyten im menschlichen mütterlich-fötalen Grenzfläche, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt.
Ein bedeutender Vorteil des hierin beschriebenen Protokolls ist, dass es für die Isolierung von Leukozyten mit einer hohen Ausbeute an lebensfähigen Zellen. Die repräsentativen Daten zeigt, dass> 90% der isolierten Zellen lebensfähig sind. Dies ist von großer Bedeutung, da dieses Protokoll für die Untersuchung der funktionellen Eigenschaften der Zellen aus menschlichen Geweben isoliert an der mütterlich-fötalen Grenzfläche erlaubt. Beispielsweise wurden Kulturen der Dezidua-Makrophagen und dem Studium der Zytokinfreisetzung unter Stimulation durchgeführt unter Verwendung dieses Protokolls.
Um erfolgreiche Ergebnisse unter Verwendung der beschriebenen Protokoll zu erreichen, ist es wichtig, die folgenden Faktoren berücksichtigen: 1) Gewebe collectiauf muß innerhalb von 1-2 h nach der Geburt durchgeführt werden und diese Gewebe in einen Behälter mit 1x PBS bei 4 ° C platziert, um die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen erhalten werden kann; 2) mechanische Gewebe Disaggregation muss durchgeführt unter Verwendung eines automatischen Homogenisator bei validiert Zeiten, da in diesem Protokoll beschrieben; 3) die Dauer der Inkubation mit der Zellablösung Lösung muss weniger als 1 Stunde, da seine Aktivität nach dieser Zeit vermindert werden; 4) die Temperatur der Inkubation mit der Zellablösung Lösung ist bei 37 ° C gehalten, um die optimale Aktivität des Enzyms zu erhalten; 5) Zellpellet Manipulation muss vorsichtig mit Mikropipetten durchgeführt, da die Verwendung des Wirbels kann die Integrität der Zellen schädigen werden (denken Sie daran, dass isolierte Zellen differenziert und abrupten Manipulation leicht ihre Lebensfähigkeit zu reduzieren); 6) Puffer und Zentrifuge Temperaturen müssen die gleiche Temperatur wie die Zellsuspension gehalten werden; 7) isolierten Zellen müssen für Immunphänotypisierung verarbeitet oder unmit verwendet werdenLICH als ihre Lebensfähigkeit reduziert rasch; und 8) bei der Durchführung Immunphänotypisierung Proben müssen unter Verwendung eines Durchflusszytometers sofort für die besten Ergebnisse erhalten werden.
Eine der Beschränkungen dieses Protokolls ist die Kosten Accutase, das teurer als andere Enzyme mit ähnlichen Funktionen, beispielsweise Trypsin, Dispase II und Kollagenase. Die Vorteile, die Displays die über die Enzyme Accutase sind jedoch überlegen. Eine zweite Einschränkung des Protokolls ist die Anforderung einer automatischen Gewebe Dissociator, die nicht eine gemeinsame Laborgerät und daher kostspielig sein. Um diese Einschränkung zu überwinden, kann das Gewebe Aufhebung der Rassentrennung auch über kleine chirurgische Scheren durchgeführt werden; Allerdings kann dieser Schritt 3-5 Minuten nicht überschreiten, da längere Zeiträume wurde gezeigt, dass die Ausbeute an lebensfähigen Zellen zu reduzieren. Alle dissociations muss von der gleichen Forscher durchgeführt werden, um die Variabilität zu minimieren.
Zusammenfassend ist der ProProtokoll bietet hier einen neuen Ansatz, der die Verwendung von sanften mechanischen und enzymatischen Gewebedissoziation Techniken kombiniert, um die Integrität der extra- und intrazellulären Markern in Leukozyten aus den menschlichen Geweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle getrennt zu bewahren. Abgesehen von Immunphänotypisierung, Zellkultur und Zellsortierung, die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls sind zahlreich und vielfältig. Wir haben erfolgreich mit Hilfe dieses Protokolls auf decidual Leukozyten für in vitro-Untersuchungen von Leukozyten-Funktionalität (dh, Zytotoxizität, T-Zell-Proliferation und Plastizität, etc.), und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies in der Leukozyten aus Dezidua-Gewebe isoliert wurde (Daten nicht zu isolieren, gezeigt). In der Tat, mit dem beschriebenen Protokoll hat sich unser Labor in der Lage, neue und seltene Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zu beschreiben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development, NIH / DHHS unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt, teilweise von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal-Kind-Gesundheit. Wir danken Maureen McGerty (Wayne State University) für ihre kritische Messwerte des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
- Kelly, R. W.
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M.
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E.
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A.
- Christiansen, O. B.
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
