Summary
नमूना अभिविन्यास टैग (स्पॉट) के प्रयोजन के बहु-ऊतक आयल ब्लॉकों में अलग-अलग ऊतक पहचान करने में सहायता करने के लिए एक अभिविन्यास उपकरण के रूप में कार्य करने के लिए है। इन प्रोटोकॉल यह आम, कम लागत ऊतक विज्ञान सामग्री से आसानी से निर्माण और आयल ब्लॉक और वर्गों में एक विश्वसनीय दृश्य मार्कर के रूप में कार्य करता है कि कैसे प्रदर्शित करता है।
Abstract
मल्टी ऊतक आयल ब्लॉक वृद्धि की दक्षता, प्रयोगात्मक एकरूपता, और कम समय और लागत के साथ उच्च throughput विश्लेषण प्रदान करते हैं। ऊतक बहु-ऊतक आयल ब्लॉकों का बहुमत बना है, लेकिन तेजी, शोधकर्ताओं की योजना बना और उपकरण में पर्याप्त निवेश के बिना ऊतक के लाभ के कई प्रदान कर सकते हैं जो एक से अधिक व्यक्तियों से बड़ा ऊतकों युक्त गैर arrayed ब्लॉकों का उपयोग कर रहे हैं। किसी भी बहु-ऊतक विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण घटक के प्रत्येक व्यक्ति के ऊतकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल अभिविन्यास विधि है। विधियों उचित अभिविन्यास और बहु-ऊतक ब्लॉक में ऊतकों की पहचान बनाए रखने के लिए मौजूद हैं, सबसे एक सरणी के भीतर मूल्यवान अंतरिक्ष उपभोग कर सकते हैं, गैर arrayed ब्लॉक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं और / या मानक ऊतक विज्ञान प्रयोगशाला में उत्पादन के लिए मुश्किल हैं। नमूना अभिविन्यास टैग (स्पॉट) स्पष्ट रूप से तेल ब्लॉक और सभी ऊतक वर्गों के लिए में दिख रहा है कि एक साधारण, कम लागत अभिविन्यास उपकरण हैarrayed और गैर arrayed लेआउट में R विश्वसनीय नमूना पहचान। स्पॉट यह ऊतक के लिए किसी भी प्रत्यक्ष संशोधन की आवश्यकता नहीं है के रूप में गैर arrayed ब्लॉकों के लिए मौजूदा अभिविन्यास तरीकों पर लाभ प्रदान करता है और ऊतक के टुकड़े की व्यवस्था में लचीलापन के लिए अनुमति देता है।
Introduction
एक भी तेल ब्लॉक में एक से अधिक व्यक्तियों से ऊतकों के नमूनों एम्बेड करने की क्षमता, उपचार और व्यक्तियों के बीच आसान पक्ष द्वारा साइड तुलना में सक्षम बनाता है स्लाइड्स के बीच परिवर्तनशीलता समाप्त, और सेक्शनिंग और नमूनों धुंधला की लागत और काम का बोझ कम कर देता है। ये बहु-ऊतक ब्लॉक आम तौर पर एक गैर सरणी लेआउट में एक से अधिक व्यक्तियों से ऊतक युक्त या तो ऊतक (टीएमए) या तेल ब्लॉक के रूप में उत्पादित कर रहे हैं। नमूना पहचान का रख-रखाव के लिए किसी भी बहु-ऊतक विश्लेषण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। शोधकर्ताओं ने विश्लेषण की दक्षता में सुधार स्लाइड्स के बीच भिन्नता को कम करने, मूल्यवान ऊतक संसाधनों के संरक्षण, और समय और प्रयोगों 1 की लागत को कम करने के लिए अपने विकास के बाद से tmas उपयोग किया गया है। Tmas के सही ओरिएंटेशन ऊतक कोर 2-4, कोर समूह की विषम व्यवस्था 3, 5 (जैसे, विवाद के बीच खाली स्थान, पंक्तियों या स्तंभों सहित तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर पूरा किया जा सकता हैउपचार बनाम एल), "बीकन" कोर 6, और टीएमए मैट्रिक्स 3 के बाहर स्थित नामित अभिविन्यास कोर। इन तरीकों tmas के लिए अच्छी तरह से काम हालांकि, सबसे ऊतक कोर समय के साथ समाप्त हो रहे हैं के रूप में पहचानकर्ता भ्रमित हो सकता है के रूप में अंतराल और रिक्त स्थान के साथ मूल्यवान टीएमए कोर अंतरिक्ष और tmas खपत करते हैं। वे पहचानकर्ता के रूप में वर्दी माइक्रोएरे कोर के कसकर आदेश दिया पैटर्न में विसंगतियों पर भरोसा करते हैं, क्योंकि इसके साथ ही, इन तरीकों में एक सरणी के प्रारूप के बिना बहु-ऊतक ब्लॉक में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं। अधिकांश गैर arrayed बहु-ऊतक ब्लॉक इन aberrations के स्थलों के रूप में बाहर खड़े करता है कि संरचित सरणी ग्रिड प्रदर्शित नहीं करते, परिभाषा से, गैर वर्दी ऊतकों को समायोजित करना चाहिए।
एक टीएमए, सबसे बड़ा नुकसान में से एक का उपयोग करने के कई फायदे हैं हालांकि हमेशा काफी हद तक विषम ऊतक 1 के प्रतिनिधि नहीं है जो कोर के छोटे आकार का है। गैर arrayed बहु-ऊतक ब्लॉक टी के कई प्रदानवह एक टीएमए के लाभ, लेकिन बड़े ऊतकों के नमूनों, या जानवरों के अध्ययन से पूरे अंगों होते हैं। एकल कोर का उपयोग ऊतक ब्याज की प्रोटीन के आधार पर पूरे ऊतक वर्गों के साथ सामंजस्य बदलती है और कई वृद्धि हुई क़बूल 7-11 के लिए कई कोर की आवश्यकता होती है। कारण जटिलता और कुछ बायोमार्कर phenotypes की विषम प्रकृति के कारण, tmas अभी भी अपर्याप्त हो सकता कोर की भी बड़ी संख्या (> 10) का उपयोग कर और विश्लेषण 8 के लिए प्रोटीन के अलावा अन्य तरीकों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, टीएमए निर्माण तकनीकी की मांग समय लगता है, है, और एक ऊतक arrayer करने के लिए प्रारंभिक लागत और में निवेश या पहुँच की आवश्यकता है। गैर तैनात बहु-ऊतक ब्लॉक में काफी कम समय और प्रयास के साथ किसी भी बुनियादी प्रयोगशाला में की गई और सरणियों की अनुमति है या लागत में कटौती और विश्लेषण को आसान बनाने के लिए एक साधन के रूप में अधिक से अधिक ऊतक की आवश्यकता होती है कि अध्ययन के लिए एक मान्य विकल्प है किया जा सकता है।
गैर arrayed बहु-ऊतक ब्लॉक इसी प्रकार एक विश्वसनीय आवश्यकता होती है याientation मार्कर नमूना पहचान ट्रैक करने के लिए, हालांकि, इन मार्करों के विकास के लिए सीमित कर दिया गया है। ऊतक के उन्मुखीकरण का वर्णन साहित्य की ज्यादातर ऐसी स्याही 12 के साथ ऊतक गोदने के रूप में व्यक्तिगत ऊतक टुकड़े, एम्बेड करने के लिए सही शारीरिक उन्मुखीकरण पर केंद्रित है, पूर्व प्रसंस्करण से 13 अगर-जिलेटिन में ऊतकों पूर्व embedding, और डिग्री अधिक 14 या टांके 15 के साथ कुछ ऊतकों अंकन । कार्यात्मक हालांकि, इन तरीकों की वजह से अपनी सीमाओं को बहु-ऊतक ब्लॉक में मार्कर के रूप में आदर्श नहीं हैं। एक सिवनी जल्दी के माध्यम से sectioned किया जाएगा और हर खंड में दिखाई नहीं हो सकता। प्रसंस्करण और एम्बेडिंग के दौरान उचित अभिविन्यास में ऊतक रख सकते हैं अगर-जिलेटिन तकनीक का उपयोग कर प्री-embedding, लेकिन आयल ब्लॉक और स्लाइड में कई नमूने के बीच अंतर करने के लिए एक दृश्य संकेत प्रदान नहीं करता है। ऊतक पर notches या डाई विश्लेषण उलझा या महत्वपूर्ण रूपात्मक विवरण रोक देना हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, ऊतक पहचानएक गैर arrayed बहु-ऊतक ब्लॉक में एक असममित व्यवस्था में ऊतक टुकड़े के embedding के माध्यम से बनाए रखा है, लेकिन इस 3 या उससे अधिक ऊतक के टुकड़े की आवश्यकता है और विश्लेषण के लिए ऊतकों के इष्टतम व्यवस्था के लिए अनुमति नहीं हो सकती किया जा सकता है।
नमूना अभिविन्यास टैग (स्पॉट) स्पष्ट रूप से बहु-ऊतक ब्लॉक में ऊतकों की पहचान करने के लिए एक आसान और सस्ती पद्धति के रूप में विकसित किया है और मौजूदा अभिविन्यास तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है किया गया है। स्पॉट Hydroxyethyl agarose प्रसंस्करण जेल और ऊतक अंकन डाई, से बना है और आयल (चित्रा -2) के साथ घुसपैठ की एक छोटी सी, रंगीन, मूल है। स्पॉट कोर एक बहु-ऊतक आयल ब्लॉक में एक भी ऊतक करने के लिए अगले छोर पर एम्बेडेड और ब्लॉक में और हर वर्ग में एक चमकीले रंग की बिंदी के रूप में प्रकट होता है - स्पष्ट रूप से ब्लॉक और वर्गों की सही ओरिएंटेशन, यह दर्शाता है (चित्रा 1 ए डी) आसान ऊतक पहचान के लिए।
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Protocol
स्पॉट 1. निर्माण
- 1 मिनट के लिए या पूरी तरह से भंग कर दिया जब तक एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब या 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब और भंवर में 1 मिलीलीटर ऊतक अंकन डाई करने के लिए गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के 50 मिलीग्राम जोड़ें।
नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, जैव रासायनिक ग्रेड बीएसए का उपयोग करें। अन्य ग्रेड और purities परीक्षण नहीं किया गया है, यह ग्रेड और पवित्रता मौके की सफलता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं होता है कि उम्मीद है। - जेल पूरी तरह से पिघल रहा है जब तक 10 सेकंड की वेतन वृद्धि के लिए 30% बिजली पर एक माइक्रोवेव में एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हीट 9 मिलीलीटर hydroxyethyl agarose प्रसंस्करण जेल।
- एक एकल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पिघल प्रसंस्करण जेल और डाई-बीएसए समाधान का मिश्रण है और एक विंदुक के साथ मिश्रण अच्छी तरह से। समाधान भंवर।
- कुछ घंटे के लिए या जब तक ठोस एक रेफ्रिजरेटर में शंक्वाकार ट्यूब रखें।
- धीरे शंक्वाकार ट्यूब से रंगीन जेल प्लग जारी करने के लिए एक लंबी, पतली, धातु का रंग या जांच का प्रयोग करें।
- घन के लिए एक स्केलपेल या रेजर ब्लेड का प्रयोग करेंजेल 5 मिमी मोटी वर्गों में transversely प्लग टी। गोल समाप्त होता निकालें और अपशिष्ट (2A चित्रा) के रूप में निपटाने।
- ऊतक विज्ञान कैसेट में फ्लैट जेल प्लग वर्गों प्लेस और 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में पकड़। एक 24 घंटा अवधि में कम से कम 3 परिवर्तन के लिए 70% इथेनॉल समाधान हर 2-4 घंटे में बदलें।
- (1 घंटे के लिए प्रत्येक (जैसे, स्निग्ध हाइड्रोकार्बन समाधान 3x मंजूरी देने में तो स्पष्ट 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल (3x परिवर्तन),: मैन्युअल एक इथेनॉल श्रृंखला (1 घंटा प्रत्येक के माध्यम से जेल वर्गों की प्रक्रिया Xylenes स्थानापन्न)) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया, Xylenes या तो स्वयं या एक ऊतक processer में) भी स्वीकार्य हैं, और 1 घंटे प्रत्येक) के लिए पिघला हुआ आयल (3x के साथ घुसपैठ।
नोट: 100% इथेनॉल में पूर्ण निर्जलीकरण से पहले, डाई एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर में अन्य ऊतकों और तरल अभिकर्मकों को प्रभावित कर सकता है, जो जेल प्लग से रिसाव हो सकता है। इस तरह, मैनुअल रिहाइड्रेशन अत्यधिक की सिफारिश की है, हालांकि स्वचालित प्रसंस्करण equ हैसहयोगी प्रभावी। - कार्यप्रणाली (चित्रा 2 बी) को एम्बेड मानक आयल का उपयोग कर एम्बेड कई प्रसंस्कृत जेल वर्गों। ब्लॉक शांत और कठोर और फिर कमरे के तापमान को आने की अनुमति।
- ब्लॉक (चित्रा -2) समाप्त हो रहा है जब तक एम्बेडेड जेल वर्गों से हाजिर कोर को हटाने के लिए इच्छित आकार का एक चमड़े का पंच सुई का प्रयोग करें। एक ही ब्लॉक में 20 x 2 मिमी 2 कोर करने के लिए उपलब्ध करा सकता है। एक शांत क्षेत्र में कोर स्टोर। इस प्रोटोकॉल में चमड़े का पंच का उपयोग आंकड़े देखें, एक 1.5 मिमी (आंकड़े -1 डी, और 2 डी) या एक 2 मिमी (आंकड़े 1 बी, 1C, और -2)।
2. ओरिएंट गैर arrayed ब्लाकों के धब्बे का प्रयोग
- इच्छित स्थानों और साथ में एम्बेड करने के लिए अलग-अलग ऊतक के टुकड़े के सभी की पहचान की है, और इस स्थान का स्थान इंगित करने के लिए एक ऊतक उन्मुखीकरण चित्र बनाने।
नोट: ऊतक अभिविन्यास आरेख पी शामिल हैं जो एक सचित्र नक्शा हैपहचानकर्ता और मौके के स्थान के साथ लेबल किए गए सभी ऊतक के टुकड़े की hysical स्थानों। यह इलेक्ट्रॉनिक बनाया जा सकता है या हाथ से तैयार किया जा सकता है। आरेख सबसे अच्छा अंतिम उत्पाद का उपयोग तकनीशियन और शोधकर्ता सूट जो विधि का उपयोग कर बनाया जाना चाहिए। नमूने आसानी से सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान पहचाना जा सकता है ताकि इस मानचित्र में शोधकर्ता के लिए गाइड के रूप में काम करेगा। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल मानचित्र हाथ से तैयार किया गया था। यह ऊतक का एक टुकड़ा और मौके खींचा और वास्तविक ऊतक ब्लॉक और स्लाइड के रूप में एक ही स्थिति में लेबल के साथ एक ऊतक ब्लॉक और कांच खुर्दबीन स्लाइड दर्शाया गया है। - वे ठीक से grossing और प्रसंस्करण कदम भर में पहचान रहना सुनिश्चित करना है कि सामान्य रूप से ऊतक टुकड़ों प्रक्रिया। 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल (X3 परिवर्तन), स्निग्ध हाइड्रोकार्बन (Xylenes स्थानापन्न) (X3 परिवर्तन), और पिघला हुआ ऊतक घुसपैठ आयल में: इस प्रोटोकॉल के लिए, 1 घंटा प्रत्येक में लिए ऊतकों की प्रक्रिया 60 डिग्री सेल्सियस (X3 परिवर्तन)।
ध्यान दें: एकडालूँगा ऊतकों मानक ऊतक विज्ञान प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का पालन कार्रवाई की जानी चाहिए। इस वजह से अलग-अलग प्रयोगशाला प्रक्रिया, ऊतक आकार और प्रकार के चर हो सकता है, लेकिन यह एक अभिविन्यास उपकरण के रूप में स्पॉट का उपयोग करने की क्षमता को प्रभावित नहीं करेगा। - ऊतक उन्मुखीकरण चित्र के अनुसार सही सौंपा स्थानों में एम्बेड स्टेशन पर ऊतक के टुकड़े की व्यवस्था। हर ब्लॉक में हाजिर और ऊतक के टुकड़े की व्यवस्था करने पर तकनीशियन मार्गदर्शन करने के लिए एक संदर्भ के रूप में ऊतक अभिविन्यास आरेख का उपयोग करें।
नोट: आरेख पर तैयार के रूप में एम्बेड करने तकनीशियन बिल्कुल वैसी ही व्यवस्था में एम्बेड स्टेशन पर ऊतक टुकड़े एम्बेड स्टेशन के बगल में हाथ से तैयार की अभिविन्यास मानचित्र डाल दिया है और व्यवस्था की इस प्रोटोकॉल में। यह सब ऊतक टुकड़े अंतिम उत्पाद में सही ढंग से पहचान योग्य रहना सुनिश्चित करता है। इस बहु-ऊतक ब्लॉक के सफल प्रयोग करने के लिए पूरी तरह से गंभीर है। - सभी ऊतक टुकड़े ब्लॉक में एम्बेड करने के लिए की तुलना में स्पॉट कोर लम्बे है सुनिश्चित करें।
- मानक एम्बेड पद्धति का उपयोग ऊतक उन्मुखीकरण चित्र के अनुसार उचित स्थानों में तो ऊतक टुकड़े और अंत (अनुप्रस्थ) पर हाजिर शामिल करें। जरूरत के रूप में आयल स्थान (एस) (1-2 मिनट) पर गिर नहीं होगा कि पर्याप्त जम गया है, जब तक संदंश के साथ ईमानदार स्थान (एस) का आयोजन करेगा।
- मानक पद्धति का उपयोग स्थान के साथ धारा और दाग आयल वर्गों।
- वर्गों एक सकारात्मक आरोप लगाया गिलास स्लाइड करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान पर तैरने लगते हैं और पालन करने की अनुमति दें (uncharged स्लाइड परीक्षण नहीं किया गया)। कम से कम 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने ओवन में स्लाइड्स सूखी।
- निम्नलिखित अभिकर्मकों के माध्यम से एक स्वचालित Stainer में स्लाइड्स प्लेस और प्रसंस्कृत: Xylenes (Xylenes 1-5 मिनट, Xylenes 2 और 3-2 मिनट, प्रत्येक), 100% इथेनॉल (2 मिनट), 95% इथेनॉल (1 मिनट), 80 % इथेनॉल (30 सेकंड), 70% इथेनॉल (30 सेकंड) चल रहा है, पानी के नल (2 मिनट), hematoxylin (1.5 मिनट), चल रहे पानी के नल (3 मिनट), एसिड शराब (1 मिनट), चल रहे पानी के नल (2 मिनट ), बीएलuing अभिकर्मक (1 मिनट), पानी चल रहा है (2 मिनट), 80% इथेनॉल (30 सेकंड), eosin (1 मिनट), पानी चल रहा है (10 सेकंड), 80% इथेनॉल (1 मिनट), 100% इथेनॉल (3 परिवर्तन, 2 मिनट प्रत्येक), Xylenes (3 परिवर्तन, 30 सेकंड प्रत्येक)।
- बढ़ते मध्यम के साथ मुहिम शुरू कांच coverslips, साथ स्लाइड कवर।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, histotechnician 5 माइक्रोन वर्गों में एक सूक्ष्म पर आयल ब्लॉक sectioned। हम एक स्वचालित Stainer इस्तेमाल किया इस प्रोटोकॉल के लिए, तथापि बराबर परिणामों पुस्तिका धुंधला के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है।
Tmas में 3. स्पॉट (मैनुअल टीएमए किट)
- 2.1 में वर्णित है और इस स्थान का इच्छित स्थान (एस) आवंटित रूप में, एक ऊतक उन्मुखीकरण चित्र बनाने।
- एक एम्बेड स्टेशन पर पिघल आयल के साथ टीएमए मोल्ड भरें। ढालना ठंडा है, ऊतक अभिविन्यास आरेख ने संकेत दिया इच्छित स्थानों पर टीएमए मोल्ड के मार्जिन में अंत पर हाजिर (ओं) को एम्बेड। जरूरत के रूप में, आयल हा जब तक ईमानदार संदंश के साथ हाजिर (ओं) को पकड़एस स्पॉट (एस) (1-2 मिनट) पर गिर नहीं होगा कि काफी बढ़ाया।
- निर्माता के निर्देशों के लिए और सरणी मार्जिन (चित्रा 2 डी) में स्पॉट (एस) के स्थान के संबंध में अनुसार टीएमए कोर इकट्ठे होकर मानक सेक्शनिंग और धुंधला प्रोटोकॉल का पालन करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सेक्शनिंग और धुंधला पद्धतियां देखने के लिए कदम 2.6 देखें।
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Representative Results
स्पॉट सब आयल वर्गों में एक दौर, आयल ब्लॉक में चमकीले रंग डॉट (चित्रा 1 ए और 2 डी), के रूप में प्रकट होता है, और एच एंड ई या आईएचसी धुंधला प्रक्रिया के माध्यम से गिलास स्लाइड पर रहता है (आंकड़े 1 बी - -1 डी, और 2 डी)। यह स्पष्ट दृश्य संकेत एड्स दोनों प्रत्येक व्यक्ति के ऊतक टुकड़ा पहचान करने में histotechnician और शोधकर्ता और histotechnician के रूप में संचार सरल खुर्दबीन पर स्लाइड से डाटा एकत्रित शोधकर्ता के ऊतक के टुकड़े की व्यवस्था इंगित करने के लिए इस दृश्य संकेत का उपयोग कर सकते हैं। ऊतक अभिविन्यास आरेख शोधकर्ता के लिए प्रदान की स्लाइड के साथ शामिल है और सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान वहाँ कोई भ्रम नहीं होगा तो विस्तार से समझाया जाना चाहिए। 2A चित्रा जम, रंगीन agarose जेल प्लग सेक्शनिंग के परिणामों से पता चलता है। चित्रा 2B embedding के परिणाम से पता चलता है sectioned agarose जेल प्लगएक तेल ब्लॉक में है। चित्रा -2 स्पॉट कोर का उत्पादन करने के लिए एक चमड़े का पंच का उपयोग कर के परिणामों से पता चलता है।
चित्रा 1: स्पॉट कोर आसानी से बनाया है और ऊतक ब्लॉक और स्लाइड में आसानी से दिखाई दे रहे हैं (ए) के धब्बे स्पष्ट रूप से एम्बेडेड ब्लॉक में दिखाई दे रहे हैं।। (बी) के धब्बे अलग व्यक्तियों / उपचार समूहों से इसी तरह के प्रदर्शित होने के ऊतकों युक्त बहु-ऊतक ब्लॉकों के लिए आसान अभिविन्यास और ऊतकों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। (सी) के धब्बे एक ऊतक माइक्रोएरे के हर कोर मूल्यवान ऊतकों के नमूनों के लिए उपयोग किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। एक टीएमए कोर करने के लिए आसन्न स्पॉट (डी) माइक्रोस्कोप देखें। तीर स्पॉट संकेत मिलता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 2:। स्पॉट कोर की तैयारी (ए) जम Hydroxyethyl agarose प्लग Eppendorf ट्यूब से जारी है और 5 मिमी स्लाइस में transversely काट रहे हैं। (बी) के एक से अधिक स्लाइस एक भी तेल ब्लॉक में एम्बेडेड रहे हैं और (सी) एक चमड़े का पंच स्पॉट कोर दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (डी) के धब्बे एक ऊतक माइक्रोएरे के हाशिये में एम्बेडेड रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
स्पॉट की सफल तैयारी और उपयोग कुछ तकनीकी कदम को सावधान पालन की आवश्यकता है। Hydroxyethyl agarose के पिघलने धीरे-धीरे और कम गर्मी पर किया जाना चाहिए। उच्च गर्मी पर जल्दी पिघलती इष्टतम परिणामों से भी कम समय के लिए agarose के कुछ टूटने में परिणाम कर सकते हैं। प्रसंस्करण के लिए टुकड़ों में डाई से लदी प्लग जब काटने, प्रत्येक टुकड़ा की मोटाई अधिक से अधिक 4.5 मिमी और 7 मिमी से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करते हैं। वे मोटाई में नहीं समान रूप से 5 मिमी के रूप में गोल समाप्त होता अपशिष्ट के रूप में हटा रहे हैं। 5 मिमी से भी कम मोहरे आसन्न ऊतक सामग्री की थकावट के लिए पहले सेक्शनिंग द्वारा समाप्त किया जा रहा जोखिम है कि छोटे धब्बे के निर्माण में परिणाम होगा। स्पॉट ब्लॉक की सम्पूर्णता के माध्यम से मौजूद है, यह सुनिश्चित करने के लिए, टुकड़ों में कम से कम 4.5-5 मिमी होने की जरूरत है। मोम की उचित घुसपैठ सुनिश्चित करने के लिए, हालांकि, टुकड़े 7 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए। मोम घुसपैठ के लिए डाई टुकड़े dehydrating करते हैं, डाई लोव में टुकड़े से बाहर थोड़ा नमकीन पानी होगाइथेनॉल के आर सांद्रता। अंतिम उत्पाद को प्रभावित नहीं करता लीचिंग, स्पॉट अभी भी तीव्रता से रंगा है और स्पष्ट रूप से दिखाई देगा। लीचिंग हालांकि, अन्य ऊतकों को प्रभावित कर सकता है, तो टुकड़े जब तक डाई टुकड़े 100% इथेनॉल पर पहुँच गए हैं के रूप में ऊतक वर्गों को एक ही स्नान में संसाधित नहीं किया जाना चाहिए।
Arrayed ब्लॉकों में स्पॉट रखने, अन्य सभी ऊतक नियुक्ति से पहले हाजिर जोड़ने के लिए पूरा हो गया है कि यह सुनिश्चित करने के। स्पॉट पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ की है, अत: यह भी लंबे समय के लिए बैठने की अनुमति दी जाती है, तो प्राप्तकर्ता ब्लॉक का पिघला हुआ मोम स्पॉट कोर पिघला करने के लिए शुरू कर सकते हैं। मौके से किसी के पिघलने से रोकने के लिए एक ठंडा थाली करने के लिए ब्लॉक हस्तांतरण तुरंत, सब से पहले ऊतक टुकड़े व्यवस्थित स्पॉट कोर जोड़ने के लिए और।
स्पॉट सबसे ऊतक विज्ञान प्रयोगशाला workflows में फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। डाई का रंग प्रत्येक आवेदन में इष्टतम विपरीत के लिए बदला जा सकता है। लाल या काले डाई डब्ल्यू, आईएचसी दाग स्लाइड पर स्पष्ट उच्च विपरीत पैदा करता हैhile रेड स्पॉट आंख arrayed गुर्दे वर्गों के एक एच एंड ई दाग स्लाइड में पकड़ने के रूप में नहीं है। एच एंड ई स्लाइड के लिए, हरे या पीले रंग के धब्बे उच्च विपरीत प्रदान करने के लिए करते हैं। इसके अलावा, इस तरह के immunohistochemistry के लिए गर्मी प्रेरित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के रूप में प्रक्रियाओं के दौरान उच्च गर्मी के तहत, hydroxyethyl agarose दूर पिघला देता है। बीएसए भी उच्च गर्मी पुनः प्राप्ति के तरीकों के बाद स्लाइड पर एक चमकीले रंग मौके बनाए रखने के लिए मौके की तैयारी के दौरान डाई करने के लिए जोड़ा गया है। स्लाइड उच्च गर्मी को उजागर नहीं किया जाएगा, तो बीएसए तेजी स्पॉट उत्पादन के लिए छोड़ा जा सकता है।
इस स्थान का उपयोग का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं के निर्माण और एक स्पष्ट और संक्षिप्त अभिविन्यास मानचित्र के रखरखाव और नक्शा करने के लिए वफादार पालन स्पॉट रखते समय में कर रहे हैं। जब ठीक से इस्तेमाल, स्पॉट embedding तकनीशियन के रूप में स्पॉट के स्थान और Tissu के संबंध का संकेत मिलता है बस सकते हैं, ऊतक व्यवस्था पर भ्रम को कम करता है और तकनीशियनों और शोधकर्ताओं के बीच संचार को सरलएक नक्शे पर यह करने के लिए तों। स्पॉट आसान बहाव के विश्लेषण के लिए स्लाइड पर बढ़ते अत्यधिक संगत खंड की अनुमति के लिए स्लाइड तैयार करने के सभी चरणों में स्पष्ट रूप से दिख रहा है। शारीरिक मार्करों के विपरीत, स्पॉट हर खंड में स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और कलाकृतियों या आकृति विज्ञान की रुकावट की शुरूआत को रोकने, किसी भी तरह से ऊतक को संशोधित नहीं करता। Asymmetrically ऊतकों को एम्बेड की विधि के विपरीत, स्पॉट खुर्दबीन के नीचे दृश्य विश्लेषण का अनुकूलन करने के ऊतकों की व्यवस्था में तकनीशियनों और शोधकर्ताओं लचीलापन देता है। Tmas में हाजिर पूरे सरणी मूल्यवान ऊतक वर्गों से बना होने की अनुमति, रिक्त स्थान, असममित विधानसभाओं, या बीकन कोर के लिए दूर करने की जरूरत है, मुख्य सरणी के बाहर रखा जा सकता है। स्पॉट भी ऊतकों के नमूनों की (उदाहरण के लिए, बाहर का या समीपस्थ) संरचनात्मक दिशा इंगित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्पॉट निर्माण और एक के दौरान ऊतकों के नमूनों के लिए आसान है और लगातार उन्मुखीकरण के लिए एक सरल और कम लागत समाधान हैबहु-ऊतक ब्लॉक और tmas की nalysis।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा प्रदान करने के लिए डॉ ब्रेंट हैरिस को धन्यवाद देना चाहूंगा। ये अध्ययन एनआईएच / NCI अनुदान P30-CA051008 में भाग द्वारा समर्थित है जो लोम्बार्डी व्यापक कैंसर केंद्र हिस्तोपैथोलोजी और ऊतक साझा संसाधन में आयोजित की गई। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histogel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
References
- Jawhar, N. Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool. Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).
- Dhir, R.
- Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).
- Saxena, R., Bade, S. Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance. Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , Available from: http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf (2013).
- Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).
- Rangel, C. The tissue microarray: helpful hints. J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).
- Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology. Vet. Path. 44, 196-203 (2007).
- Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. Tissue microarrays: one size does not fit all. Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).
- Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast. Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).
- Wampfler, J., et al. Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer. J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).
- Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA). Microarray. 3, 91-102 (2014).
- Miettinen, M. A simple method for generating multitissue blocks without special equipment. Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).
- Jones, M., Calabresdi, P. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42, 569-570 (2007).
- Carson, F., Hladik, C. Histotechnology: A Self-Instructional Text. , 3rd ed, American Society for Clinical Pathology Press. Chicago, IL. (2009).
- Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , 7th ed, Churchill Livingstone Elsevier Ltd. London, UK. (2013).
