Spot Rätt Tissue varje gång i flera vävnads Blocks

Summary

Syftet med preparatorientering Tag (spot) är att fungera som ett orienteringsverktyg för att underlätta enskild vävnad identifiering i flera vävnadsparaffinblock. Dessa protokoll visar hur den är uppbyggd lätt från vanliga, billiga histologi material och fungerar som en tillförlitlig visuell markör i paraffinblock och sektioner.

Abstract

Multi-vävnad paraffinblock ger hög genomströmning analys med ökad effektivitet, experimentellt likformighet, och minskad tid och kostnad. Vävnads mikroarrayer utgör majoriteten av multi-vävnadsparaffinblock, men allt är forskare med hjälp av icke-klädd block som innehåller större vävnader från flera personer som kan ge många av fördelarna med vävnads mikroarrayer utan stora investeringar i planering och utrustning. En kritisk komponent i varje flervävnadsanalys är orienteringen metod som används för att identifiera varje enskild vävnad. Även om det finns metoder för att upprätthålla god orientering och identifiering av vävnader i flera vävnadsblock, de flesta är inte väl lämpade för icke-klädd block, kan förbruka värdefullt utrymme i en matris och / eller är svåra att producera i standard histologi laboratorium. Den preparatorientering Tag (spot) är en enkel, billig orientering verktyg som syns tydligt i paraffinblock och alla sektioner vävnads for pålitlig providentifiering i ordnade och icke-grupperade layouter. The Spot ger fördelar jämfört med befintliga orienterings metoder för icke-klädd block eftersom det inte kräver någon direkt ändring av vävnaden och möjliggör flexibilitet i arrangemanget av vävnadsbitar.

Introduction

Förmågan att bädda vävnadsprover från flera personer i en enda paraffinblocket möjliggör enkel sida-vid-sida jämförelse mellan behandlingar och individer, eliminerar variationen mellan diabilder, och minskar kostnaderna och arbetsbördan för sektionering och färgning exemplar. Dessa multi-vävnadsblock framställs typiskt som antingen vävnads microarrays (TMA) eller paraffinblock som innehåller vävnad från flera personer i en icke-array layout. Underhåll av prov identitet är avgörande för framgång för varje multi-vävnadsanalys. Forskare har använt TMA eftersom deras utveckling för att förbättra effektiviteten av analys, minska variationen mellan diabilder, bevara värdefulla resurser vävnad, och minska tiden och kostnaden för försök ^1. Korrekt orientering av TMA kan åstadkommas med användning av en mängd olika metoder, inklusive tomma utrymmen, rader eller kolumner mellan vävnadskärnor ^2-4, asymmetriska arrangemang av kärngrupper ^{3, 5} (t.ex., control kontra behandling), "ledstjärna" kärnor ⁶ och betecknade orienterings kärnor som ligger utanför TMA matrisen ^3. Även om dessa metoder fungerar bra för TMA, de flesta konsumerar värdefullt TMA kärnutrymme och TMA med luckor och utrymmen som identifierare kan bli förvirrande eftersom vävnadskärnor är uttömda över tiden. Dessutom är dessa metoder inte är lämpliga att använda i flera vävnadsblock utan en rad format, eftersom de förlitar sig på brister i tätt ordnat mönster av enhetliga microarray kärnor som identifierare. De flesta icke-grupperade flera vävnadsblock måste rymma oenhetliga vävnader och per definition, inte visa det strukturerade array rutnät som gör dessa avvikelser framstår som landmärken.

Även om det finns många fördelar med att använda en TMA, en av de största nackdelarna är den lilla storleken av kärnorna som inte alltid är representativa för i stort sett heterogena vävnad ^1. Icke-grupperade flera vävnadsblock ger många av than fördelarna med en TMA, men innehåller större vävnadsprover, eller hela organ från djurstudier. Vävnads mikroarrayer, använder en kärnor har varierande överensstämmelse med hela vävnadssnitt baserat på proteinet av intresse och många kräver flera kärnor för ökad samstämmighet ^7-11. På grund av komplexiteten och heterogena karaktären hos vissa biomarkörer fenotyper, TMA använder även ett stort antal kärnor (> 10) kan fortfarande vara otillräcklig och kan kräva andra än mikroarrayer för analys ⁸ metoder. Dessutom är TMA byggtiden krävande, tekniskt krävande och kräver den initiala kostnaden och investeringar i eller tillträde till en vävnad arrayer. Icke-klädd multivävnadsblock kan göras i någon grundläggande laboratorium med betydligt mindre tid och ansträngning och är ett bra alternativ för studier som kräver mer vävnad än arrayer tillåta eller som ett sätt att sänka kostnaderna och förenkla analysen.

Icke-klädd blockerar flera vävnads liknande kräver en pålitlig ellerientation markör för att spåra providentifikation emellertid utvecklingen av dessa markörer har varit begränsad. En stor del av litteraturen som beskriver vävnads orientering fokuserar på rätt fysiologisk orientering för att bädda in enskilda vävnadsbitar, såsom tatuering vävnaden med bläck ^12, pre-inbäddning vävnader i agar-gelatin före bearbetningen ^13, och märkning vissa vävnader med skåror ¹⁴ eller suturer ¹⁵ . Även om funktionell, är dessa metoder inte ideala som markörer på flervävnadsblock grund av deras begränsningar. En sutur kommer att sektioneras genom snabbt och kanske inte syns i varje avsnitt. Pre-inbäddning tekniker med agar-gelatin kan hålla vävnaden i rätt riktning under bearbetning och inbäddning, men inte ge en visuell kö för att skilja mellan flera prov i paraffinblock och diabilder. Skåror eller färgämne på vävnaden kan komplicera analys eller täppa viktiga morfologiska detaljer. Alternativt, vävnads identiteti ett icke-klädd flervävnadsblock kan upprätthållas genom inbäddning av vävnadsbitar på ett asymmetriskt arrangemang, men det kräver tre eller flera vävnadsbitar och kan omöjliggöra att optimala arrangemanget av vävnader för analys.

Den preparatorientering Tag (spot) har utvecklats som ett enkelt och billigt metod för att tydligt identifiera vävnader i flera vävnadsblock och erbjuder många fördelar jämfört med befintliga orienteringsmetoder. Platsen är en liten, färgrik, kärna består av hydroxietyl agaros behandling gel och vävnadsmärkfärg, och infiltrerade med paraffin (Figur 2C). Spot kärna är inbäddad i slutet bredvid en enda vävnad i en multi-vävnadsparaffinblock och visas som en färgglad prick i blocket och i varje avsnitt (Figur 1A - D), som tydligt visar den korrekta orienteringen av blocket och sektioner för enkel vävnad identifiering.

Protocol

1. Konstruktion av fläcken

1. Tillsätt 50 mg bovinserumalbumin (BSA) till 1 ml vävnadsmärkfärg i en 15 ml koniskt rör eller 2 ml mikrofugrör och skaka i 1 min eller tills den är helt upplöst.
   Obs! För detta protokoll, använda biokemiska Grade BSA. Medan andra kvaliteter och renhet inte har testats, förväntas det att lönegrad och renhet inte skulle ha en betydande inverkan på framgång plats.
2. Heat 9 ml hydroxietyl agaros bearbetning gel i en 15 ml koniska rör i en mikrovågsugn vid 30% effekt för 10 steg sek tills gelen är helt smält.
3. Kombinera det smälta bearbetning gel och färg BSA-lösning i en enda 15 ml koniska rör och blanda väl med en pipett. Vortexa lösningen.
4. Placera den koniska röret i kylskåp ett par timmar eller tills fast.
5. Använd en lång, smal, metallspatel eller sond för att försiktigt släppa färgade gelen kontakten ur koniska rör.
6. Använd en skalpell eller rakblad för att cut gelen plugga på tvären i 5 mm tjocka sektioner. Ta bort de rundade ändar och kassera som avfall (Figur 2A).
7. Placera gel plug sektionerna platta i histologi kassetter och håll i 70% etanol under 1 timme. Ändra etanollösningen 70% varje 2-4 h i minst tre förändringar under en 24 timmarsperiod.
8. Bearbeta manuellt gelen snitt genom en etanolserie (1 h vardera: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol (3x förändringar), sedan klar i clearing lösning 3x i 1 h vardera (t.ex. alifatiska kolväten ( xylener substitut)) användes i detta protokoll, xylener är också acceptabelt), och infiltrera med smält paraffin (3x under 1 timme vardera), antingen manuellt eller i ett vävnads processer.
   Obs: Före fullständig uttorkning i 100% etanol, kan färgämnet läcka från gelén pluggen som skulle kunna påverka andra vävnader och flytande reagens i en automatiserad vävnadsprocessor. Som sådan, manuell rehydrering rekommenderas, är emellertid automatiserad behandling equally effektiva.
9. Bädda in flera bearbetade gel sektioner med vanlig paraffininbäddning metod (Figur 2B). Låt block svalna och hårdna och sedan komma till rumstemperatur.
10. Använd en dermal punch nål av önskad storlek för att avlägsna plats kärnor från de inbäddade gel sektionerna tills blocket är slut (Figur 2C). En enda block kan ge upp till 20 x 2 mm ² kärnor. Förvara kärnorna i en sval plats. Använd dermal punch i detta protokoll se figurerna, en 1,5 mm (figurerna 1D och 2D) eller 2 mm (figurerna 1B, 1C och 2C).

2. Använda fläckar att Orient Icke-grupperade Blocks

1. Skapa en vävnadsorientering diagram för att indikera de önskade lägena och identiteter för alla enskilda vävnadsbitar som skall inbäddade tillsammans, och placeringen av platsen.
   OBS: Vävnads orientering diagrammet är en illustrerad karta som innehåller physical platser för alla vävnadsbitar märkta med identifierare och placeringen av platsen. Det kan skapas elektroniskt eller kan vara handritade. Diagrammet bör skapas med hjälp av vilken metod som passar bäst teknikern och forskare med hjälp av slutprodukten. Denna karta kommer att fungera som vägledning för forskare så prov kan lätt identifieras under mikroskopisk analys. Kartan som används i detta protokoll ritades. Det visar en vävnadsblock och glas objektglas med varje bit av vävnad och Spot dras och märkt i samma position som den faktiska vävnadsblock och bild.
2. Process vävnaden bitar normalt, se till att de förblir korrekt identifierade hela uppräknings och processteg. För detta protokoll, bearbeta vävnader under 1 timme vardera i: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol (X3 förändringar), alifatiska kolväten (xylener ersättnings) (X3 förändringar), och smält vävnadsinfiltration paraffin på 60 ° C (X3 förändringar).
   OBS: All vävnader bör behandlas följande standard histologiska laboratorieprocedurer. Detta kan vara variabel beroende på enskilda laboratorieförfarande, vävnads storlek och typ, men detta kommer inte att påverka förmågan att använda plats som orienteringsverktyg.
3. Ordna vävnadsbitar på inbäddning stationen i rätt tilldelade platser i enlighet med vävnadsorienteringsdiagram. Använd vävnadsorienteringsdiagram som en referens för att styra tekniker på hur man ordnar plats och vävnadsbitar i varje block.
   OBS: I detta protokoll inbäddning teknikern sätta handritade orienteringskartan bredvid inbäddning stationen och ordnade vävnadsbitar på inbäddning stationen i exakt samma arrangemang som dras i diagrammet. Detta säkerställer att alla vävnadsbitar förblir korrekt identifieras i slutprodukten. Detta är helt avgörande för den framgångsrika användningen av multi-vävnadsblock.
4. Se till att SPOT kärnan är högre än alla vävnadsstycken som skall inbäddas i blocket.
5. Bädda vävnaden bitar och sedan punkten på slutet (tvärgående) i rätt platser enligt vävnadsorienteringsdiagram genom att använda standard inbäddning metodik. Vid behov, håll plats (er) upprätt med pincett tills paraffinet har stelnat tillräckligt att platsen (s) inte kommer att falla under (1-2 min).
6. Avsnitt och fläckparaffinsektioner med plats med hjälp av standardmetoder.
   1. Låt avsnitt att flyta på ett vattenbad vid 40 ° C och anslöt sig till en positivt laddad glasskiva (har oladdade glider inte testats). Torka glasen i en torkugn vid 60 ° C under minst 20 minuter.
   2. Placera objektglasen i en automatisk infärgaren och bearbetas genom följande reagens: xylener (xylener 1-5 min, xylener 2 och 3-2 minuter, vardera), 100% etanol (2 minuter), 95% etanol (1 min), 80 % etanol (30 sek), 70% etanol (30 sek), rinnande kranvatten (2 min), hematoxylin (1,5 min), rinnande kranvatten (3 min), sur alkohol (1 min), rinnande kranvatten (2 min ), bluing reagens (1 min), rinnande vatten (2 min), 80% etanol (30 sek), eosin (1 min), rinnande vatten (10 sek), 80% etanol (1 min), 100% etanol (tre förändringar, 2 min vardera), xylener (3 förändringar, 30 sek vardera).
   3. Täck objektglasen med täckglas av glas, monterade med monteringsmedel.
      OBS: I detta protokoll, den histotechnician sektionparaffinblocken på en mikrotom i 5 pm sektioner. För detta protokoll använde vi en automatisk stainer, men lika resultat kan uppnås genom manuell färgning.

3. plats i TMA (manuell TMA Kit)

1. Skapa en vävnadsorientering schema, som beskrivs i 2.1 och tilldela önskad plats (er) av fläcken.
2. Fyll TMA formen med smält paraffin vid en inbäddning station. Eftersom formen kylning bädda plats (er) på slutet i anslutning till TMA formen på de önskade lägena indikeras av vävnadsorientering schemat. Vid behov, håll plats (er) upprätt med pincett tills paraffin has stelnade nog att plats (er) inte kommer att falla under (1-2 min).
3. Montera TMA kärnorna enligt tillverkarens anvisningar och med hänsyn till platsen för plats (er) i array marginaler (Figur 2D) och följ standardsektione och färgningsprotokoll.
   OBS: Se steg 2,6 för att se sektione och färgningsmetoder som används i detta protokoll.

Representative Results

The Spot visas som en rund, färgglad prick i paraffinblocket (Figur 1A och 2D), i alla paraffinsnitt, och ligger kvar på objektglaset genom H & E eller IHC färgningsproceduren (figurerna 1B - 1D och 2D). Denna uppenbara visuell hjälpmedel både den histotechnician och forskare att identifiera varje enskild vävnad bit och förenklar kommunikationen som histotechnician kan använda denna visuella kö för att indikera arrangemanget av vävnadsbitar till forskaren samla in data från bilden i mikroskop. Vävnads orientering diagram bör ingå i de bilder som tillhandahålls till forskaren och förklaras i detalj så det blir ingen förvirring vid mikroskopisk analys. Figur 2A visar resultaten av sektione de stelnade, färgade agarosgel pluggar. Figur 2B visar resultatet att bädda den sektione agarosgel pluggar i ett paraffinblock. Figur 2C visar resultaten av användning av en dermal punch för att producera de fläck kärnor.

Figur 1: plats kärnor skapas enkelt och väl synlig i vävnadsblock och diabilder (A) fläckar syns tydligt i den inbäddade blocket.. (B) fläckar möjliggör enkel orientering och identifiering vävnad för multi-vävnadsblock som innehåller liknande förekommer vävnader från olika individer / behandlingsgrupperna. (C) fläckar tillåter varje kärna av en Tissue microarray att utnyttjas för värdefulla vävnadsprover. (D) Mikroskop tanke på plats intill en TMA kärna. Pilar indikerar platsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Framställning av SPOT-kärnor (A) stelnat hydroxietyl agaros pluggar frigörs från Eppendorf-rör och skär på tvären i 5 mm skivor. (B) flera segment är inbäddade i ett enda paraffinblocket och (C) en dermal stans används för att ta bort fläckar kärnor. (D) fläckar är inbäddade i anslutning till en Tissue microarray. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Framgångsrik framställning och användning av fläckarna kräver noggrann anslutning till några tekniska steg. Smältning av hydroxietyl agaros bör ske långsamt och på låg värme. Smältande snabbt på hög värme kan resultera i en viss uppdelning av agarosen för mindre än optimala resultat. När skära färgämnes lastat pluggar i bitar för bearbetning, se till att tjockleken på varje bit är större än 4,5 mm och inte överstiga 7 mm. De rundade ändarna avlägsnas som avfall som de inte likformigt 5 mm i tjocklek. Pieces mindre än 5 mm kommer att leda till skapandet av kortare fläckar som riskerar att uttömmas genom sektionering före konsumtion av intilliggande vävnadsmaterial. För att säkerställa att SPOT är närvarande genom hela det blocket, bitarna måste vara åtminstone 4,5-5 mm. För att säkerställa korrekt infiltration av vax emellertid bitarna bör inte överstiga 7 mm. När dehydratisering färgämnes stycken för vax infiltration, kommer färgen läcka något av bitarna i lower koncentrationer av etanol. Läkningen påverkar inte den slutliga produkten kommer fläckarna fortfarande intensivt färgat och tydligt. Läkningen kan påverka andra vävnader, men så vävnadssnitt inte bör behandlas i samma bad som färgämne bitar tills bitarna har nått 100% etanol.

När du placerar Fläckarna i de grupperade blocken, se till att alla andra vävnader placering är klar före tillsats plats. Eftersom SPOT infiltreras med paraffinvax, kan det smälta vaxet i det mottagande blocket börjar smälta fläcken kärnan om det tillåts att sitta för länge. Ordna alla vävnadsbitar först, lägga Spot kärnan och omedelbart överföra blocket till en kall platta för att förhindra smältning av platsen.

The Spot kan modifieras för att passa in i de flesta histologi lab arbetsflöden. Färgen på färgämnet kan ändras för optimal kontrast i varje program. Röd eller svart färg ger tydlig hög kontrast på IHC färgade diabilder, wedan den röda fläcken är inte så iögonfallande i en H & E färgade rutschbanan i ordnade njursnitt. För H & E diabilder, gröna eller gula fläckar tenderar att ge högre kontrast. Vidare, under hög värme under processer som värmeinducerad antigenåtervinning för immunohistokemi, smälter hydroxietyl agaros bort. BSA sättes till färgämnet under SPOT förberedelse för att upprätthålla en ljust färgad fläck på objektglaset även efter höga värmehämtningsmetoder. Om objektglasen inte kommer att utsättas för hög värme, kan BSA utelämnas för snabbare SPOT produktion.

De mest kritiska aspekterna av användningen av Spot är i skapandet och upprätthållandet av en klar och koncis orienteringskarta och de trogna anslutning till kartan när du placerar plats. När det används på rätt sätt, minskar SPOT förvirring över vävnads arrangemang och förenklar kommunikationen mellan tekniker och forskare, som bädda teknikern kan helt enkelt ange läget för platsen och förhållandet mellan tissues till det på en karta. Spot är tydligt i alla steg i glaspreparering möjliggör mycket konsekvent avsnitt montering på objektglas för enklare analys nedströms. I motsats till fysiologiska markörer, syns tydligt i varje avsnitt plats och inte ändrar vävnaden på något sätt, vilket förhindrar införandet av artefakter eller obstruktion av morfologi. Till skillnad från den metod för inbäddning vävnaderna asymmetriskt, tillåter SPOT tekniker och forskare flexibilitet i arrangemanget av vävnader för att optimera visuell analys under mikroskop. I TMA, kan plats placeras utanför huvud array, vilket eliminerar behovet av blanksteg, asymmetriska församlingar, eller fyr kärnor, vilket gör att hela uppsättningen bestå av värdefulla vävnadssnitt. Fläcken kan också användas för att indikera anatomisk riktning (t.ex. distala eller proximala) av vävnadsprover. Fläcken är en enkel och billig lösning för enkel och konsekvent orienteringen av vävnadsprover under konstruktion och enNALYS av multi-vävnadsblock och TMA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histogel Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.