Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

جيل من التذبذبات CA1 γ المحلية من خلال تحفيز كزازي

Published: August 14, 2015 doi: 10.3791/52877
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne

Summary

التذبذبات هي خصائص الشبكة الأساسية ومنظم من قبل المرض والمخدرات. دراسة التذبذبات الدماغ شريحة يسمح توصيف شبكات معزولة تحت ظروف خاضعة للرقابة. وتقدم بروتوكولات لإعداد شرائح الدماغ الحادة لاستثارة CA1 التذبذبات γ.

Abstract

التذبذبات الشبكة العصبية هي السمات الهامة لنشاط الدماغ في الصحة والمرض، ويمكن عن طريق التضمين مجموعة من الأدوية المستخدمة سريريا. ويرد بروتوكول لإنشاء نموذج لدراسة التذبذبات CA1 γ (20-80 هرتز). هذه التذبذبات γ مستقرة لمدة 30 دقيقة على الأقل، وتعتمد على النشاط متشابك مثير والمثبطة بالإضافة إلى تفعيل التيارات جهاز تنظيم ضربات القلب. التذبذبات حفز Tetanically لديها عدد من الخصائص استنساخه وقابلة للقياس بسهولة بما في ذلك عدد السنبلة، مدة التذبذب، الكمون وتردد أن يقدم على حالة الشبكة. وتشمل مزايا التذبذبات حفز كهربائيا الاستقرار، واستنساخ وحيازة عرضية تمكين توصيف قوية وظيفة الشبكة. هذا النموذج من CA1 التذبذبات γ يمكن استخدامها لدراسة الآليات الخلوية والتحقيق بشكل منهجي كيف العصبية شبكة النشاط يتم تبديل في المرض والمخدرات.الصيدلة حالة المرض يمكن إدراجها بسهولة عن طريق استخدام شرائح الدماغ من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا أو التدخلية لتمكين مجموعة من العقاقير التي تستهدف على وجه التحديد آليات المرض.

Introduction

تحدث اهتزازات الشبكة الدماغ في نطاقات الترددات المختلفة التي ترتبط إلى الدول السلوكية. في القوارض، التذبذبات θ الحصين - ويلاحظ (5 10 هرتز) خلال السلوكيات الاستكشافية 1،2، في حين التذبذبات γ (20-80 هرتز) مع الزميلة العمليات المعرفية المختلفة، بما في ذلك الإدراك والانتباه 3،4. هو متورط متزامن نشاط الشبكة γ أيضا في أمراض اضطرابات مثل الصرع والفصام 5،6. على سبيل المثال، يعتقد أن التذبذبات γ لتتوافق مع مجالات القشرية بؤر صرعية 5،7،8 ويمكن أن تستخدم كعلامات من pharmacosensitivity أو المقاومة، واثنين من المجالات الهامة للتحقيق في أبحاث الصرع 9.

شريحة الدماغ الحصين هو النموذج الذي تم استخدامه على نطاق واسع للتحقيق في نشاط الشبكة 10-12. وقد وضعت بروتوكولات مختلفة لتوليد اهتزازات γ في شرائح الدماغ التي عادة ما طnvolve تعديل الدوائي مثل انخفاض المغنيسيوم 2+، 4-aminopyridine (4AP)، bicuculline، وحمض الكايينيك 12-17. أوجه القصور في التذبذبات أثار دواء هي أنها تحدث بشكل عشوائي بعد تطبيق المخدرات ولم يتم إنشاؤها بشكل موثوق أو مستقرة على مر الزمن. أثار كهربائيا التذبذبات γ التغلب على كثير من هذه المشاكل ولها أيضا ميزة حبسهم زمنيا لحدث مثير السماح لتسجيل وتحليل العرضية. هنا يوصف بروتوكول لتوليد اهتزازات CA1 γ من خلال تقديم التحفيز كزازي إلى الطبقة المتجهة في شريحة الحصين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران قبل لجنة الأخلاق الحيوانية معهد فلوري.

1. إعداد لقطع شرائح الدماغ

  1. إعداد محلول القطع تتألف من (ملم) 125 الكولين-CL، 2.5 بوكل، 0.4 CaCl 2، 6 MgCl 2، 1.25 ناه 2 ص 4، 26 NaHCO 3، 20 D-الجلوكوز مشبعة بالغاز كربوجين (95٪ O 2 -5 ٪ CO 2)، والسائل النخاعي الاصطناعي (حل ACSF) تسجيل تتألف من (ملم) 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2 CaCl 2، 2 MgCl 2، 1.25 ناه 2 ص 4، 26 NaHCO 3، 10 D-الجلوكوز، مشبعة كربوجين. وضع حل القطع على الجليد لإبقائه باردا.
  2. تجميد حوالي 400 مل من محلول القطع والمزج مع 100 مل من محلول القطع رفع التجميد لخلق الطين الجليد. فقاعة مع كربوجين (95٪ O 2 -5٪ CO 2) في تدفق ما يقرب من 0.5 لتر / دقيقة عن طريق ج الصغيرةaliber أنابيب أو الزجاج متكلس لإنتاج تدفق ثابت ولكن لطيف من الفقاعات.
  3. إعداد كوب 250 مل مع رفع إدراج شبكة من النايلون التي سيتم وضعها على شرائح الدماغ. ملء مع ACSF لتغطية شبكة بحوالي 2 سم وفقاعة مع كربوجين، وضمان أن الفقاعات لا يعطل مباشرة مساحة الشريحة القابضة. ومن المهم أيضا أن عدم وجود فقاعات الهواء في شبكة من النايلون، لذلك إن وجدت موجودة إزالتها. وستكون هذه الغرفة القابضة ويتم الاحتفاظ بها في RT (20-25 درجة مئوية).
  4. تخطيط الصكوك تشريح بما في ذلك زوج كبير من مقص، وزوج من مقص صغير، ملاعق صغيرة صغيرة وكبيرة، وأزواج الكبيرة والصغيرة من الملقط والبرد منهم على الجليد. وضع كتلة قطع الأنسجة vibratome على الجليد على الساحة من رقائق الألومنيوم. الحصول على 2 قطعة من 6 سم رقة الترشيح، واحدة حافة شفرة الحلاقة، ودورق 25 مل مليئة الطين حل القطع كذلك.
  5. ملء الحاويات الثانية مع الثلج، ووضع قطعة من حلمة الثدي النسيجإيه على الجليد ووضع صحن الثقافة 12 سم على القمة. ملء الطبق الثقافة مع قطع حل الطين الجليد وفقاعة مع كربوجين. هذا هو الحاوية التي تشريح الدماغ مع أن يؤديها.
  6. إعداد vibratome. إزالة مزدوجة شفرة حلاقة جديدة حدين (استخدام شفرة جديدة في كل مرة) من الالتفاف ورذاذ مع 80٪ من الإيثانول الماء ثم منزوع الأيونات. قطع 3 مل من البلاستيك ماصة نقل عند النقطة التي يبدأ في الاضمحلال. وسوف تستخدم هذه لنقل شرائح الدماغ. بيند 27 G إبرة في قاعدة بحوالي 45 درجة ونعلق على حقنة 1 مل. وسوف تستخدم هذه للتلاعب شرائح خلال عدة قطاعات.

2. قطع شرائح الدماغ

  1. تخدير ماوس (P16 - P18) مع 2٪ الأيزوفلورين أو طريقة معتمدة محليا. بعد الاستقراء، وقطع رأس الحيوان مع زوج كبير من مقص وإسقاط رئيس في طبق ثقافة 12 سم يحتوي على فقاعات الطين حل القطع. الطين يجب أن تزج تماما الرأس لالتبريد السريع.
  2. عقد الجزء الأمامي من الرأس بيد واحدة تقشير الجلد والنسيج الضام إلى الأمام نحو الأنف. باستخدام مقص صغير قطع النسيج الضام للكشف عن الجمجمة الأساسية. ثم إزالة العضلات التي تغمر الجانب الظهري من الجمجمة والعنق.
  3. إزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق تأمين لأول مرة أمام الجمجمة مع ملقط كبيرة ومن ثم جعل اثنين من التخفيضات الجانبية من خلال العظام جانبي ماغنوم الثقبة باستخدام مقص صغير (الشكل 1، والتخفيضات وصفت A1 و A2).
    1. جعل قطع أخرى بين العينين (فقط الأمامي من bregma) (الشكل 1، وقطع المسمى B) ثم قطع بعناية على طول الدرز السهمي الأمامية وتعكس أقسام قطع الجمجمة للكشف عن الدماغ (الشكل 1، وقطع المسمى C).
    2. استخدام ملعقة صغيرة ليستخرج الدماغ ومكان على طبق الثقافة. يكون على بينة من كراالأعصاب الاتحاد العالمي للتعليم على الجانب السفلي من الدماغ والتي سوف تحتاج إلى أن تنقطع، وهذا يمكن أن يتم ذلك باستخدام ملعقة صغيرة صغيرة الحجم. باستخدام ملعقة الأكبر نقل الدماغ على الدورق 25 مل مليئة الطين حل القطع.
  4. إعداد المخ في نصف الكرة للتشريح.
    1. وضع قطعة واحدة من ورقة الترشيح 6 سم في الجزء السفلي من طبق ثقافة جديدة ثم ملء مع الطازجة الطين حل القطع وفقاعة. استخدام الملعقة الكبيرة لوضع الدماغ، الجانب البطني أسفل، على ورقة الترشيح. اتخاذ حافة واحدة شفرة حلاقة جديدة وتنظيفها وقطع الدماغ لإزالة المخيخ، ثم اجراء خفض على طول خط منتصف لفصل المخ إلى نصفين.
  5. إعداد كتلة الأنسجة vibratome.
    1. اتخاذ المبردة كتلة الأنسجة vibratome، يجف السطح، ووضع قطرة من الغراء cyanoacrylate في الوسط، وتنتشر بالتساوي على الحجم التقريبي للدماغ. استخدام ملعقة صغيرة لمعالجة واحدة مننصفي الدماغ على ملعقة صغيرة كبيرة جدا على الجانب الإنسي من الدماغ هو أسفل.
    2. تلمس حافة الملعقة في واجهة الدماغ على القطعة الثانية من ورق الترشيح لإزالة أكبر قدر من حل ممكن. حرك الدماغ قبالة ملعقة أكبر باستخدام ملعقة صغيرة لترشدها على الغراء.
    3. تأمين كتلة قطع في غرفة vibratome وملء الغرفة مع الطين حل القطع وفقاعة، بما يضمن مغمورة المخ تماما. تدوير كتلة قطع ذلك الجانب البطني من الدماغ يواجه النصل.
  6. تشريح الدماغ.
    ملاحظة: كل vibratome هو فريد من نوعه اتبع تعليمات الشركة الصانعة.
    1. تعيين سمك شريحة إلى 450 ميكرومتر، وضمان شفرة تهتز وهي تتحرك من خلال الدماغ بسرعة حوالي 0.3 ملم / ثانية. قطع تماما من خلال الدماغ من الجانب البطني إلى السطح القشري، وهذا سوف ينتج الدماغ شرائح السهمي كلها التي يمكن بالبريد المستخدمة في التسجيلات الكهربية. وسيتم إنتاج شرائح أفقيا إلى إعلامي وعادة 3-4 شرائح يمكن قطع كل من نصف الكرة الغربي.
    2. إذا كانت قاعدة المصاعد شريحة تستخدم عازمة 27 G الإبرة إلى الصحافة لطيف شريحة أسفل الظهر. كما هو قطع كل شريحة، استخدم ماصة نقل لنقله على منصة في غرفة القابضة حيث أنها قابلة للحياة لمدة تصل إلى 8 ساعات.

3. خارج الخلية الكهربية تسجيلات

  1. تركيب شريحة في غرفة تسجيل.
    1. باستخدام ماصة نقل، ضع شريحة الدماغ إلى غرفة تسجيل المغمورة مع perfused ACSF تتدفق في 1-2 مل / دقيقة ويسخن إلى 32 درجة مئوية. وACSF المستخدمة للتسجيلات يختلف عن ذلك في غرفة القابضة كما يتم زيادة المغنيسيوم 2+ تركيز من 2 مم إلى 4 مم.
    2. تأمين شريحة مع "القيثارة" (شبه دائري الفولاذ المقاوم للصدأ مع خيوط النايلون تمتد عبر في 2-3 ملم تباعد). مكانالقيثارة بحيث مسارات موازية لCA1. زيادة سرعة نضح إلى 8-10 مل / دقيقة عند 32 ° C.
  2. تحت المجهر مكان تشريح القطب تحفيز والقطب تسجيل (الزجاج الكهربائي مليئة الحل تسجيل ACSF) على سطح الطبقة المشععة من CA1 (الشكل 2A). وضع القطب تحفيز أولا ثم وضع القطب تسجيل.
  3. تحفيز شافر الضمانات مع 120-150 أمبير السعة و 0.1 مللي ثانية مدتها اختبار النبض ومراقبة مجال آخر مثير متشابك المحتملة (fEPSP) الموجي مما أدى لتحديد صحة شريحة (الشكل 2B). قد تحتاج الأقطاب محفزة وتسجيل ليتم نقلها إلى شريحة حوالي 50-100 ميكرون من سطح شريحة للحصول على fEPSP تسجيل من تسديدة الألياف الصغيرة والسعة الكبيرة. أثار الضمان شافر fEPSPs هي النمطية وتقدم مؤشرا جيدا للصحة شريحة. Hتظهر ealthy شرائح عادة من تسديدة الألياف إلى fEPSP نسبة السعة أقل من 0.3.
  4. اعادة تموضع الأقطاب.
    1. باستخدام مجهر تشريح، نقل القطب تحفيز لمنتصف الطبقة المتجهة ونقل القطب تسجيل في طبقة الخلايا الهرمية أقرب إلى القطب تسجيل ممكن كما هو مبين في الشكل 3A. قد تحتاج الأقطاب محفزة وتسجيل لتكون دفعت إلى شريحة حوالي 50-100 ميكرون حتى يتسنى للاستجابة السعة fEPSP إلى 120-150 اختبار أمبير نبض حوالي 1 بالسيارات.
  5. توليد اهتزازات γ.
    1. لتوليد اهتزازات γ تحفيز الأنسجة مع قطار 20 × 0.1 ميللي ثانية البقول تسليمها في 200 هرتز. هذا التحفيز كزازي يمكن أن تسفر عن ردود استنساخه عند تسليم كل 5 دقائق.
  6. استخدام المعلمات تسجيل التالية.
    1. تحجيم مكاسب إشارة خرج لتتناسب مع نطاق الإدخال الجهدالتناظرية إلى المحول الرقمي. تأكد من أن يستخدم الحد الأقصى المتوقع إشارة رحلة لا تقل عن 30٪ من نطاق الإدخال الجهد. كن حذرا عند وضع المكاسب ليصل إشارات قد مقطع. عرض النطاق الترددي نموذجي اللازمة للتسجيلات ميدانية 500 هرتز مع AC اقتران عند 0.1 هرتز لإزالة الانجراف خط الأساس.
    2. رقمنة لا يقل عن 4 - 5 مرات أسرع من وتيرة زاوية منخفضة لتمرير مرشح لتجنب إشارة التعرج.
  7. تحليل البيانات.
    1. تصفية البيانات عالية تمرير في 5 هرتز لإزالة أي تحولات أساسية. تحديد طفرات باستخدام عتبة المشتقة، مع فصل الحد الأدنى الحدث من 10 ميللي ثانية، وهو وقت الحدث نموذجية إلى الذروة وفترة الانحدار من 7 مللي، عتبة ~ 100 فولت / ميللي ثانية، وواد يفصل من 100٪. حساب الكمون مثل الوقت الذي يستغرقه لارتفاع حددت الأول تحدث بعد نهاية قطعة أثرية التحفيز. هذا التحليل يسمح لتوصيف عدد السنابل، الكمون، الفاصل الزمني بين الحدث، والمدة المحسوبة على النحوالتالي:
    2. حساب عدد السنابل كما يتم تحديد العدد الإجمالي للارتفاع في التذبذب لكل الاجتياح.
    3. حساب الكمون التذبذب. لكل التذبذب، وطرح الوقت من ارتفاع حددت الأول من نهاية قطعة أثرية التحفيز.
    4. حساب متوسط ​​الفاصل الزمني بين الحدث (ISI). تحديد الفترة الزمنية بين عدة طفرات الكشف عن والمتوسط.
    5. حساب مدة التذبذب. قياس الوقت بين ارتفاع الكشف الأول والأخير في كل التذبذب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحفيز كزازي من الطبقة المتجهة إنشاء قوية وقابلة للتكرار التذبذبات γ (± 2.2 35.4 هرتز)، انظر الشكل 3B. لإثبات أن تم توليد اهتزازات داخل الشبكة المحلية CA1 قطعت المدخلات من CA3 عن طريق قطع شريحة في المنطقة CA2 باستخدام عازمة 32 G الإبرة. لم خصائص التذبذب في شرائح قطع لا تختلف عن شرائح غير المصقول (ع = 0.85؛ قطع شرائح 6.16 ± 1.1 المسامير، ن = 6؛ شرائح تقطيعه 5.89 ± 0.8 المسامير، ن = 6)، مشيرا إلى أن التذبذبات تتولد محليا.

ومن المزايا المهمة لهذا الأسلوب هو استقرار التسجيلات. عندما تم تسليم الكزاز في 5 مين فترات كانت التذبذبات مستقرة لمدة 30 دقيقة على الأقل لأي شريحة معينة (ع = 0.26 لعدد السنابل في 15 دقيقة مقابل 30 دقيقة). هناك التباين بين الشرائح في عدد من المسامير داخل التذبذب وغيرها من المعالم. لددراسات البساط يقترن التجارب يمكن أن يتم ذلك أن الاختلافات في خصائص أساسية هي العوامل طفيفة. لتقلب مقارنات داخل شريحة يمكن أن يكون مصدر قلق، ويمكن التغلب عليها عن طريق المقارنات توفير الطاقة بما فيه الكفاية.

بعد ذلك، تم التحقيق القنوات الأيونية والمستقبلات التي مطلوبة من أجل توليد هذه التذبذبات CA1 γ حفز tetanically. الحصار الدوائي من α-الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic حمض (أمبا) مستقبلات مع 20 ميكرومتر 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX) (الشكل 4A، B)، GABA A مستقبلات مع 20 ميكرومتر bicuculline (الشكل 4C)، وأنا ح الحالية مع 20 ميكرومتر 4- (N-ايثيل-N-phenylamino) -1،2-ثنائي ميثيل-6- (متيل) كلوريد pyrimidinium (ZD7288) (الشكل 4D)، وT-نوع كا كانت 2+ قنوات مع 100 ميكرومتر ني 2+ (الشكل 4E) كل مستقلة قادرة على الحد من عدد السنابل ولدت(p <0.05؛ CNQX ن = 6؛ bicuculline ن = 7؛ ZD7288 ن = 6؛ ني 2+ ن = 6). لم تطبيق (2R) -amino-5-phosphonopentanoate (AP5، 20 ميكرومتر) لن يؤثر على عدد السنابل (ع = 0.22، ن = 5؛ AP5، 5.9 ± 3.1 المسامير، والسيطرة، 8.3 ± 2.2 المسامير)، مما يوحي بأن لا يشاركون مستقبلات NMDA في الجيل التذبذب γ في هذا الإعداد.

هذا الإعداد هو الأمثل لتحديد نطاق عمل شبكة المخدرات. Retigabine هو دواء مضاد للصرع المستخدمة سريريا التي تفتح قنوات البوتاسيوم ويقلل من الغشاء استثارة 18-20. أنتجت تطبيق حمام من retigabine تخفيض تعتمد على الجرعة في عدد السنابل في ومدة التذبذب (الشكل 5).

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي من الجمجمة والمغطي الجلد تظهر موقع تخفيضات لإعادة لحم العجل الدماغ. A1، A2، B و C بمناسبة مواقع التخفيضات التي يجب القيام بها لفتح الجمجمة لإزالة من الدماغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. التنسيب للتحفيز وتسجيل الأقطاب في CA1 شافر الضمانات للصحة شريحة الاختبار. (A) معارض وضع القطب محفزة (STIM) والقطب تسجيل (التوصية). (ب) وهناك مثال الممثلين fEPSP التي حركها 120 التحفيز أمبير (كرة الألياف تميزت *). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

jove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل (3)
الشكل 3. تكوين لتسجيل وتحفيز كهربائي يستخدم لاستحضار التذبذب. (A) موقع القطب محفزة (STIM) في الطبقة المتجهة والقطب تسجيل (التوصية) في الهريمة طبقة من CA1. (B) مثال ممثل التذبذبات γ الناجم عن التحفيز كزازي (علامة القطع الأثرية التي كتبها "STIM"). تتبع ممثل تظهر مخرجات قابلة للقياس الكمي. ISI الفاصلة بين ارتفاع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. توصيف الدوائية العلام tetanicallyالتذبذبات ATED γ. (A) تتبع ممثل مما يدل على تأثير CNQX. الرسوم البيانية مما يدل على تأثير (B) CNQX (20 ميكرومتر، ن = 6)، (C) bicuculline (20 ميكرومتر، ن = 7)، (D) ZD7288 (20 ميكرومتر، ن = 6) و (E) ني 2+ (100 ميكرومتر، ن = 6) على عدد من المسامير. وتعرض البيانات والمقارنات المقترنة. * P <0.05، ** p <0.01، و*** P <0.001. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الآثار Retigabine على خصائص الشبكة. أمثلة الممثل تظهر نشاط الشبكة تخفيض الاهتزازات التي يسببها (A) في ظروف سيطرة و (B) و <قوي> (C) مع retigabine. ملخص للآثار هو مبين في (D) عدد السنبلة، (E) مدة التذبذب، (F) الكمون إلى بداية التذبذب، و (G) الفاصل بين ارتفاع (ISI). وتعرض البيانات والمقارنات المقترنة. * P <0.05. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ووصف طريقة قوية لتوليد CA1 التذبذبات γ في شرائح الدماغ الحادة. دعت التذبذبات الناتجة عن الدوائر المحلية مما يتيح فرصة أفضل للمراقبة وفهم الأساس العصبي من التذبذبات شبكة 12. مستقبلات أمبا، GABA A المستقبلات، I ساعة وT-نوع كا 2+ القنوات كلها اللازمة لالتذبذبات γ في هذا النموذج. في حين أن التذبذبات CA1 المحلية الموصوفة هنا يمكن أن تتولد بقوة هذا يعتمد على ضمان أن شرائح الدماغ بصحة جيدة. والخطوة الحاسمة هي الإزالة السريعة من الدماغ من الجمجمة، مع الحرص على عدم اختراق الدماغ أثناء إزالة والغمر السريع ثم في محلول الباردة الجليد. من الناحية المثالية الوقت بين قطع الرأس وإزالة الدماغ من الجمجمة يجب أن يكون هناك أكثر من 30-60 ثانية للحفاظ على شريحة الصحة 21.

باستخدام التحفيز كزازي التذبذبات γ CA1 المحلية يمكن أن يكونولدت في حلول تسجيل الفسيولوجية القياسية دون الاعتماد على وكلاء الدوائية. هذا هو مفيد لوصف الأمراض في نماذج المرض حيث إضافة كلاء الدوائية قد تربك التفسير. على سبيل المثال، وذلك باستخدام هذا النموذج النشاط CA1 المحلي والحساسية للأدوية المضادة للصرع وتعززت في نموذج الفأر من الصرع الوراثي البشري 22. استخدام هذا النموذج للتحقيق في نشاط الشبكة لا يقتصر على الصرع ويمكن بسهولة أن تطبق على أمراض أخرى مثل مرض الزهايمر والتوحد وانفصام الشخصية. في حين لا يطلب من وكلاء الدوائية لتوليد اهتزازات المحلية CA1 الأوكسجين الأنسجة الكافي، وذلك بسبب الطلب الأيضي للشريحة الدماغ 23. معدلات التروية عالية تحسين الأكسجين ودرجة الحموضة التوازن داخل شريحة خلق بيئة أكثر الفسيولوجية لشرائح الدماغ 24،25.

وثمة ميزة أخرى لاستخدام التحفيز كزازي لgeneratالتذبذبات الشبكة الإلكترونية هو أن التصميم التجريبي العرضية يمكن استخدام الكميات التي تمكن أكثر استعدادا من المعلمات نشاط الشبكة، مثل تأخير إلى أرقام بداية ومدتها والسنبلة، بطريقة قابلة للتكرار. في المقابل، نشاط الشبكة التي يسببها كيميائيا هو عفوية 13،15،16،26-28 وأكثر من ذلك يصعب قياسها كميا. التحفيز كزازي، ومع ذلك، يمكن أن تسبب تغيرات في NMDA تعتمد على مستقبلات اللدونة متشابك، والتي يمكن أن تسبب تغيرات في نشاط الشبكة مع مرور الوقت. للسيطرة على هذا وتمكين الجيل التذبذب مستقر على مدى عدة التحفيز كزازي التغييرات اللدونة يمكن الحد من رفع المغنيسيوم 2+ المستويات. على الرغم من أن هذا البروتوكول يعزز استنساخ أنها مبهمة إلى أي تأثير NMDA وظيفة مستقبلات.

يمكن غرف تسجيل واجهة تحسين الصحة شريحة، تسفر عن أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء والمزيد من التنسيق أقل كثافة التحفيز مع فائدة إضافية تتمثل في القطع الأثرية التحفيز أصغر. chambe مثقبةأن أساليب تسجيل ص أيضا تحسين الصحة شريحة للتجارب على المدى الطويل. باستخدام دوائر تسجيل مجموعة الكهربائي الجزئي أو تسجيل المشبك التصحيح يتيح مجالا واسعا وظيفة الخلايا العصبية واحدة لقياسها خلال التسجيلات للتحقيق في الآليات الكامنة وراء التذبذبات γ وتأثيرها على أداء الشبكة الأوسع بشكل أفضل. وسيكون إدراج الجهد والكالسيوم وأجهزة الاستشعار وكذلك أساليب optogenetic إدخال المرونة التجريبية إضافية في كل من تسجيل وتحفيز النماذج. بروتوكولات مماثلة وضعت لمناطق الدماغ الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لعلم الأمراض قيد الدراسة. A الاستخدام النهائي للبروتوكول يصف هنا قد يكون لبناء واختبار نماذج حساب التذبذبات خلال الجمع بين تسجيلات ميدانية مع المشبك الخلايا العصبية التصحيح والتصوير الدراسات احدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288) Sigma-Aldrich Z3777
Biuculline Sigma-Aldrich 14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX) Sigma-Aldrich C127
Nickel Sigma-Aldrich 266965
Carbamazepine Sigma-Aldrich C4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV) Tocris Bioscience 0105
Retigabine ChemPacific 150812-12-7
Choline-Cl Sigma-Aldrich C1879-5KG
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-250G
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297-250G
NaCl Sigma-Aldrich S7653-5KG
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 • 2H2O Sigma-Aldrich 223506-500G
MgCl2 • 6H2O Sigma-Aldrich M2670-500G
Electrode glass Harvard Apparatus  GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode  FHC CBBPF75
Digital Isolator Getting Instruments Model BJN8-9V1 
Model 1800 amplifier A-M systems Model 1800 amplifier
Digitizer National Intruments NI USB-6211
Vibrotome Leica VT1200s

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
  2. Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 26 (4), 407-418 (1969).
  3. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 45-56 (2007).
  4. Buzsáki, G., Wang, X. -J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu. Rev. Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  5. Kobayashi, K., et al. Cortical contribution to scalp EEG gamma rhythms associated with epileptic spasms. Brain Dev. 35 (8), 762-770 (2013).
  6. Andreou, C., et al. Increased Resting-State Gamma-Band Connectivity in First-Episode Schizophrenia. Schizophr Bull. , (2014).
  7. Alarcon, G., Binnie, C. D., Elwes, R. D., Polkey, C. E. Power spectrum and intracranial EEG patterns at seizure onset in partial epilepsy. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 94 (5), 326-337 (1995).
  8. Fisher, R. S., Webber, W. R., Lesser, R. P., Arroyo, S., Uematsu, S. High-frequency EEG activity at the start of seizures. J. Clin. Neurophysiol. 9 (3), 441-448 (1992).
  9. Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. N. Engl. J. Med. 342 (5), 314-319 (2000).
  10. Traub, R. D., Kopell, N., Bibbig, A., Buhl, E. H., LeBeau, F. E., Whittington, M. A. Gap junctions between interneuron dendrites can enhance synchrony of gamma oscillations in distributed networks. J. Neurosci. 21 (23), 9478-9486 (2001).
  11. Traub, R. D., Whittington, M. A., Buhl, E. H., Jefferys, J. G., Faulkner, H. J. On the mechanism of the gamma --> beta frequency shift in neuronal oscillations induced in rat hippocampal slices by tetanic stimulation. J. Neurosci. 19 (3), 1088-1105 (1999).
  12. Whittington, M. A., Stanford, I. M., Colling, S. B., Jefferys, J. G., Traub, R. D. Spatiotemporal patterns of gamma frequency oscillations tetanically induced in the rat hippocampal slice. J. Physiol. 502 (3), 591-607 (1997).
  13. Avoli, M., Panuccio, G., Herrington, R., D’Antuono, M., de Guzman, P., Lévesque, M. Two different interictal spike patterns anticipate ictal activity in vitro. Neurobiol. Dis. 52, 168-176 (2013).
  14. Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 162-173 (2014).
  15. Gloveli, T., Albrecht, D., Heinemann, U. Properties of low Mg2+ induced epileptiform activity in rat hippocampal and entorhinal cortex slices during adolescence. Brain Res. Dev. Brain Res. 87 (2), 145-152 (1995).
  16. McLeod, F., Ganley, R., Williams, L., Selfridge, J., Bird, A., Cobb, S. R. Reduced seizure threshold and altered network oscillatory properties in a mouse model of Rett syndrome. Neuroscience. 231, 195-205 (2013).
  17. Bracci, E., Vreugdenhil, M., Hack, S. P., Jefferys, J. G. On the synchronizing mechanisms of tetanically induced hippocampal oscillations. J. Neurosci. 19 (18), 8104-8113 (1999).
  18. Main, M. J., Cryan, J. E., Dupere, J. R., Cox, B., Clare, J. J., Burbidge, S. A. Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine. Mol. Pharmacol. 58 (2), 253-262 (2000).
  19. Wickenden, A. D., Yu, W., Zou, A., Jegla, T., Wagoner, P. K. Retigabine, a novel anti-convulsant, enhances activation of KCNQ2/Q3 potassium channels. Mol. Pharmacol. 58 (3), 591-600 (2000).
  20. Otto, J. F., Kimball, M. M., Wilcox, K. S. Effects of the anticonvulsant retigabine on cultured cortical neurons: changes in electroresponsive properties and synaptic transmission. Mol. Pharmacol. 61 (4), 921-927 (2002).
  21. Pomper, J. K., Graulich, J., Kovacs, R., Hoffmann, U., Gabriel, S., Heinemann, U. High oxygen tension leads to acute cell death in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. Dev. Brain Res. 126 (1), 109-116 (2001).
  22. Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. Enhanced in vitro CA1 network activity in a sodium channel β1(C121W) subunit model of genetic epilepsy. Epilepsia. 55 (4), 601-608 (2014).
  23. Lord, L. -D., Expert, P., Huckins, J. F., Turkheimer, F. E. Cerebral energy metabolism and the brain/'s functional network architecture: an integrative review. J. Cereb. Blood Flow Metab. 33 (9), 1347-1354 (2013).
  24. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur. J. Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  25. Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. J. Neurosci. Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  26. Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 163-173 (2012).
  27. Antuono, M., Köhling, R., Ricalzone, S., Gotman, J., Biagini, G., Avoli, M. Antiepileptic drugs abolish ictal but not interictal epileptiform discharges in vitro. Epilepsia. 51 (3), 423-431 (2010).
  28. Stenkamp, K., et al. Enhanced temporal stability of cholinergic hippocampal gamma oscillations following respiratory alkalosis in vitro. J. Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).

Tags

علم الأعصاب، العدد 102، التذبذبات غاما، CA1، الحصين، نشاط الشبكة، والعقاقير المضادة للصرع
جيل من التذبذبات CA1 γ المحلية من خلال تحفيز كزازي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou,… More

Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. Generation of Local CA1 γ Oscillations by Tetanic Stimulation. J. Vis. Exp. (102), e52877, doi:10.3791/52877 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter