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Neuroscience

धनुस्तंभीय उत्तेजना से स्थानीय सीए 1 γ दोलन की पीढ़ी

Published: August 14, 2015 doi: 10.3791/52877
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne

Summary

दोलन मौलिक नेटवर्क के गुण होते हैं और रोग और दवाओं द्वारा संग्राहक कर रहे हैं। मस्तिष्क-टुकड़ा दोलनों का अध्ययन नियंत्रित परिस्थितियों में अलग-थलग पड़ नेटवर्क के लक्षण वर्णन अनुमति देता है। प्रोटोकॉल सीए 1 γ दोलनों evoking के लिए तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस की तैयारी के लिए प्रदान की जाती हैं।

Abstract

Neuronal नेटवर्क दोलनों स्वास्थ्य और रोग में मस्तिष्क की गतिविधियों की महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं और चिकित्सकीय इस्तेमाल दवाओं की एक श्रृंखला के द्वारा संग्राहक जा सकता है। (- 80 हर्ट्ज 20) एक प्रोटोकॉल सीए 1 γ दोलनों के अध्ययन के लिए एक मॉडल उत्पन्न करने के लिए प्रदान की जाती है। ये γ दोलनों कम से कम 30 मिनट के लिए स्थिर रहे हैं और पेसमेकर धाराओं के सक्रियण के अलावा उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic गतिविधि पर निर्भर करते हैं। Tetanically प्रेरित दोलनों नेटवर्क स्थिति पर रिपोर्ट है कि कील गिनती, दोलन की अवधि, विलंबता और आवृत्ति सहित प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और आसानी से मात्रात्मक विशेषताओं में से एक नंबर है। विद्युत प्रेरित दोलनों के फायदे नेटवर्क समारोह का मजबूत लक्षण वर्णन सक्षम करने के लिए स्थिरता, reproducibility और प्रासंगिक अधिग्रहण शामिल है। सीए 1 γ दोलनों का यह मॉडल सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए और व्यवस्थित रोग में और दवाओं से बदल रहा है कैसे neuronal नेटवर्क गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।रोग राज्य औषध विज्ञान आसानी से विशेष रूप से रोग तंत्र लक्ष्य है कि दवाओं का चयन सक्षम करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित या हस्तक्षेप पशु मॉडल से मस्तिष्क के स्लाइस के प्रयोग से शामिल किया जा सकता है।

Introduction

ब्रेन नेटवर्क दोलनों व्यवहार राज्यों को परस्पर संबंधित अलग आवृत्ति बैंड के भीतर होते हैं। कृन्तकों में, हिप्पोकैम्पस θ दोलनों (5 - 10 हर्ट्ज), खोजपूर्ण व्यवहार 1,2 के दौरान मनाया जाता है γ दोलनों जबकि - धारणा और ध्यान 3,4 सहित विभिन्न संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं, के साथ (20 से 80 हर्ट्ज) सहयोगी। तुल्यकालिक γ नेटवर्क गतिविधि भी ऐसे मिर्गी और मानसिक असंतुलन 5,6 के रूप में विकार की विकृति में फंसा है। उदाहरण के लिए, γ दोलनों कॉर्टिकल मिरगी foci 5,7,8 के क्षेत्रों के अनुरूप करने के लिए लगा रहे हैं और pharmacosensitivity या प्रतिरोध, मिर्गी अनुसंधान 9 में जांच के दो महत्वपूर्ण क्षेत्रों में से मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा व्यापक रूप से नेटवर्क गतिविधि 10-12 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक मॉडल है। विभिन्न प्रोटोकॉल है कि आम तौर पर मस्तिष्क के स्लाइस में γ दोलनों उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है मैंइस तरह के कम 2 मिलीग्राम +, 4-aminopyridine (4AP), bicuculline, और kainic एसिड 12-17 के रूप में nvolve औषधीय मॉडुलन। औषधीय ट्रिगर दोलनों की कमियों वे नशीली दवाओं के आवेदन के बाद बेतरतीब ढंग से उत्पन्न होती है और मज़बूती से उत्पन्न या समय के साथ स्थिर नहीं कर रहे हैं। विद्युत γ दोलनों इन समस्याओं के कई पर काबू पाने के लिए और भी अस्थायी प्रासंगिक रिकॉर्डिंग और विश्लेषण के लिए अनुमति उत्तेजक घटना के लिए बंद होने का फायदा है शुरू हो गया। यहाँ एक प्रोटोकॉल hippocampal टुकड़ा में परत oriens करने के लिए एक धनुस्तंभीय उत्तेजना देने से सीए 1 γ दोलनों पैदा करने के लिए वर्णित है।

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Protocol

चूहों पर सभी प्रयोगों फ्लोरे संस्थान पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

मस्तिष्क के स्लाइस काट के लिए 1. सेटअप

  1. (मिमी) 125 Choline-CL, 2.5 KCl, 0.4 2 CaCl, 6 2 MgCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26 3 NaHCO के शामिल एक काटने समाधान तैयार, 20 डी ग्लूकोज carbogen गैस (95% 2 हे -5 के साथ संतृप्त (मिमी) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 2 CaCl, 2 2 MgCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26 3 NaHCO के शामिल% सीओ 2) और एक कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) रिकॉर्डिंग समाधान, 10 डी ग्लूकोज, साथ संतृप्त carbogen। ठंड इसे रखने के लिए बर्फ काटने पर समाधान रखें।
  2. काटने के समाधान के लगभग 400 मिलीलीटर रुक और एक आइस घोल बनाने के लिए unfrozen काटने समाधान के 100 मिलीलीटर के साथ एक साथ मिश्रण। Carbogen साथ बुलबुला (95% 2 हे -5% सीओ 2) छोटे ग के माध्यम से लगभग 0.5 एल / मिनट की एक प्रवाह परaliber ट्यूबिंग या sintered कांच बुलबुले की एक स्थिर लेकिन कोमल प्रवाह का उत्पादन करने के लिए।
  3. मस्तिष्क के स्लाइस रखा जाएगा जिस पर एक उठाया नायलॉन जाल डालने के साथ एक 250 मिलीलीटर बीकर तैयार करें। बुलबुले सीधे टुकड़ा धारण क्षेत्र को बाधित नहीं करना सुनिश्चित करना है कि, carbogen साथ लगभग 2 सेमी से जाली और बुलबुला कवर करने के लिए aCSF के साथ भरें। यह वहाँ नायलॉन जाल में कोई हवाई बुलबुले हैं, इसलिए किसी भी मौजूद हैं, अगर उन्हें हटाने के भी महत्वपूर्ण है कि। यह पकड़े चैम्बर हो जाएगा और आरटी पर रखा जाता है (20 - 25 डिग्री सेल्सियस)।
  4. कैंची की एक बड़ी जोड़ी, कैंची, छोटे और बड़े सूक्ष्म Spatulas, और संदंश के बड़े और छोटे जोड़े का एक छोटा सा जोड़ी सहित विदारक यंत्र लेआउट और उन्हें बर्फ पर ठंडा। एल्यूमीनियम पन्नी के एक वर्ग पर बर्फ पर vibratome ऊतक काटने ब्लॉक रखें। 6 सेमी फिल्टर पेपर, एक एकल बढ़त रेजर ब्लेड, और के रूप में अच्छी तरह से काटने के समाधान के घोल से भरा एक 25 मिलीलीटर बीकर के 2 टुकड़े प्राप्त करते हैं।
  5. बर्फ के साथ एक दूसरे कंटेनर भरें, और ऊतक पैप का एक टुकड़ा रखनाएर और बर्फ पर शीर्ष पर एक 12 सेमी संस्कृति डिश जगह है। Carbogen के साथ समाधान बर्फ गारा और बुलबुला काटने के साथ संस्कृति डिश भरें। यह मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन किया जा साथ में जो बस्ती है।
  6. Vibratome तैयार करें। एक ताजा डबल धार धार निकालें अपने लपेटकर से (एक ताजा ब्लेड हर समय का उपयोग) और 80% इथेनॉल तो विआयनीकृत पानी के साथ स्प्रे। यह घटना शुरू होता है इस मुद्दे पर जहां एक 3 एमएल प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट काटें। यह मस्तिष्क के स्लाइस हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। बेंड लगभग 45 डिग्री और 1 मिलीलीटर सिरिंज को देते द्वारा आधार पर एक 27 जी सुई। इस काटने के दौरान स्लाइस में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

2. मस्तिष्क के स्लाइस काट

  1. 2 isoflurane% या एक स्थानीय रूप से मंजूरी दे दी विधि के साथ - एक माउस (P18 P16) anesthetize। प्रेरण के बाद, कैंची की एक बड़ी जोड़ी के साथ पशु सिर काटना और bubbled काटने समाधान घोल जिसमें 12 सेमी संस्कृति डिश में सिर ड्रॉप। घोल पूरी तरह के लिए सिर को विसर्जित करना होगातेजी से ठंडा।
  2. एक हाथ की त्वचा और आगे नाक की ओर संयोजी ऊतक छीलने के साथ सिर के सामने पकड़ो। संयोजी ऊतक में कटौती छोटे कैंची का प्रयोग अंतर्निहित खोपड़ी प्रकट करने के लिए। फिर खोपड़ी और गर्दन के पृष्ठीय पहलू overlying की मांसपेशियों को हटा दें।
  3. पहले बड़े संदंश के साथ खोपड़ी के सामने प्राप्त करके खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और फिर छोटे कैंची (चित्रा 1, A1 और A2 में लेबल कटौती) का उपयोग कर रंध्र मैग्नम की हड्डी दोनों ओर के माध्यम से दो पार्श्व में कटौती कर सकते हैं।
    1. आंखों के बीच एक और कटौती (पर्वबिन्दु का सिर्फ पूर्वकाल) (चित्रा 1, कटौती से लेबल बी) तो ध्यान से पूर्व से बाण के समान सीवन के साथ काटा बनाओ और मस्तिष्क (चित्रा 1, कटौती से लेबल सी) प्रकट करने के लिए कटौती खोपड़ी वर्गों को दर्शाते हैं।
    2. एक संस्कृति डिश पर मस्तिष्क और जगह बाहर निकालना छोटा सा रंग का प्रयोग करें। क्रैन के बारे में पताकी आवश्यकता होगी जो मस्तिष्क के अवर पहलू पर ial नसों इस छोटे आकार के सूक्ष्म रंग का उपयोग किया जा सकता है, कटे होंगे। का प्रयोग बड़े रंग काटने समाधान घोल के साथ भरा 25 मिलीलीटर बीकर मस्तिष्क हस्तांतरण।
  4. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मस्तिष्क गोलार्द्ध की तैयारी।
    1. फिर ताजा काटने समाधान गारा और बबल के साथ भरने के एक ताजा संस्कृति डिश के तल में 6 सेमी फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें। फिल्टर पेपर पर, नीचे मस्तिष्क, उदर पक्ष की स्थिति के लिए बड़ा रंग का प्रयोग करें। एक नए और साफ एकल बढ़त धार ले लो और फिर, सेरिबैलम हटाने के मध्य रेखा के साथ एक काट दो गोलार्द्धों में मस्तिष्क अलग करने के लिए बनाने के लिए मस्तिष्क में कटौती।
  5. Vibratome ऊतक ब्लॉक तैयार कर रहा है।
    1. ठंडा vibratome ऊतक ब्लॉक ले सतह सूखी, और बीच में cyanoacrylate गोंद की एक बूंद जगह है और मस्तिष्क की अनुमानित आकार करने के लिए समान रूप से फैला। में से एक में हेरफेर करने के लिए छोटा सा रंग का प्रयोग करेंबड़े सूक्ष्म रंग पर मस्तिष्क गोलार्द्धों के मस्तिष्क की औसत दर्जे नीचे की ओर है तो।
    2. संभव के रूप में समाधान के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए फिल्टर पेपर का दूसरा टुकड़ा पर मस्तिष्क के इंटरफेस में रंग के किनारे को स्पर्श करें। गोंद पर मार्गदर्शन करने के लिए छोटे रंग का उपयोग बड़े रंग से दूर मस्तिष्क स्लाइड।
    3. मस्तिष्क पूरी तरह से डूब जाता है, यह सुनिश्चित करना vibratome चेंबर में काटने ब्लॉक सुरक्षित और कटौती समाधान गारा और बबल के साथ चैम्बर भरें। मस्तिष्क के उदर पक्ष ब्लेड का सामना करना पड़ रहा है ताकि काटने ब्लॉक घुमाएँ।
  6. मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया।
    नोट: प्रत्येक vibratome इसलिए निर्माता के निर्देशों का पालन अद्वितीय है।
    1. 450 माइक्रोन के लिए टुकड़ा मोटाई निर्धारित करें, और यह लगभग 0.3 मिमी / एस की गति से मस्तिष्क के माध्यम से कदम के रूप में ब्लेड हिल रहा है सुनिश्चित करते हैं। Cortical सतह के लिए उदर की ओर से मस्तिष्क के माध्यम से पूरी तरह कट, इस ख कर सकते हैं कि पूरे दिमाग बाण के समान स्लाइस का उत्पादन होगाelectrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए गए ई। स्लाइस मध्यवर्ती करने के लिए है laterally का उत्पादन किया जाएगा और आम तौर पर 3 - 4 स्लाइस प्रत्येक गोलार्द्ध से काटा जा सकता है।
    2. टुकड़ा लिफ्टों के आधार टुकड़ा वापस नीचे कोमल प्रेस करने के लिए तुला 27 जी सुई का उपयोग करते हैं। प्रत्येक टुकड़ा काट रहा है के रूप में, वे अप करने के लिए 8 घंटे के लिए व्यवहार्य हैं जहां पकड़े कक्ष में मंच पर ले जाने के लिए हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें।

3. कोशिकी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग

  1. रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा बढ़ते।
    1. 2 मिलीग्राम / मिनट और 32 डिग्री सेल्सियस पर गरम - हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, aCSF 1 पर बहने के साथ perfused एक जलमग्न रिकॉर्डिंग कक्ष में एक मस्तिष्क टुकड़ा जगह है। रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल aCSF 2 मिलीग्राम + एकाग्रता 4 मिमी 2 मिमी से वृद्धि हुई है, के रूप में पकड़े कक्ष में उस से अलग है।
    2. (- 3 मिमी रिक्ति 2 पर भर में फैला नायलॉन किस्में के साथ अर्द्ध परिपत्र स्टेनलेस स्टील) एक "वीणा" के साथ टुकड़ा सुरक्षित। स्थानवीणा किस्में सीए 1 के समानांतर चलने वाले हैं। 32 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीग्राम / मिनट - 8 के लिए छिड़काव की गति में वृद्धि।
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप जगह एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड और सीए 1 (2A चित्रा) की परत radiatum की सतह पर एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (ACSF रिकॉर्डिंग समाधान के साथ भरा गिलास इलेक्ट्रोड) के तहत। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड जगह तो पहले उत्तेजक इलेक्ट्रोड रखें।
  3. Schaffer एक 120 के साथ कोलेटरल उत्तेजित - 150 μA आयाम और 0.1 मिसे अवधि परीक्षण पल्स और टुकड़ा स्वास्थ्य (चित्रा 2 बी) का निर्धारण करने के परिणामस्वरूप क्षेत्र उत्तेजक पोस्ट सिनेप्टिक क्षमता (fEPSP) तरंग निरीक्षण करते हैं। टुकड़ा की सतह से 100 माइक्रोन एक fEPSP एक छोटे फाइबर वॉली और बड़े आयाम के साथ रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए - उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड लगभग 50 टुकड़ा में स्थानांतरित करने की आवश्यकता हो सकती है। Schaffer जमानत के fEPSPs टकसाली हैं और टुकड़ा स्वास्थ्य का एक अच्छा संकेत प्रदान पैदा की। एचealthy स्लाइस आम तौर पर कम से कम 0.3 के आयाम अनुपात fEPSP करने के लिए एक फाइबर वॉली दिखा।
  4. इलेक्ट्रोड repositioning।
    1. एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, परत oriens के बीच करने के लिए उत्तेजक इलेक्ट्रोड के लिए कदम और चित्रा 3 ए में दिखाया गया के रूप में संभव के रूप में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के करीब के रूप पिरामिड सेल परत करने के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड चाल है। 150 μA परीक्षण पल्स 1 लगभग एम वी है - 120 के लिए fEPSP प्रतिक्रिया आयाम इतना है कि 100 माइक्रोन - उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड लगभग टुकड़ा में 50 धक्का दिया करने की आवश्यकता हो सकती है।
  5. Γ दोलनों सृजन।
    1. Γ दोलनों 200 हर्ट्ज पर दिया 20 एक्स 0.1 मिसे दालों की एक ट्रेन के साथ ऊतक को प्रोत्साहित उत्पन्न करने के लिए। हर 5 मिनट वितरित करते हैं तो यह धनुस्तंभीय उत्तेजना प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतिक्रियाओं उपज कर सकते हैं।
  6. निम्नलिखित रिकॉर्डिंग मापदंडों का उपयोग करें।
    1. के इनपुट वोल्टेज श्रेणी मैच के लिए उत्पादन में संकेत के लाभ स्केलएनॉलॉग से डिजिटल परिवर्तित करने वाला उपकरण। अधिकतम की उम्मीद है और संकेत भ्रमण इनपुट वोल्टेज श्रेणी के 30% की एक न्यूनतम का उपयोग करता है कि सुनिश्चित करें। संकेतों क्लिप हो सकता है उच्च के रूप में करने के लिए लाभ सेट करते समय सावधान रहें। क्षेत्र रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक ठेठ बैंडविड्थ आधारभूत बहाव को दूर करने के लिए 0.1 हर्ट्ज पर एसी युग्मन के साथ 500 हर्ट्ज है।
    2. संकेत अलियासिंग से बचने के लिए कम पास फिल्टर के कोने आवृत्ति की तुलना में 5 गुना तेजी से - कम से कम 4 Digitize।
  7. डेटा विश्लेषण।
    1. 5 हर्ट्ज पर उच्च मार्ग फिल्टर डेटा किसी भी आधारभूत पारियों दूर करने के लिए। 10 मिसे की एक न्यूनतम घटना जुदाई, शिखर और 7 एमएस के प्रतिगमन अंतराल, ~ 100 एम वी / मिसे की एक सीमा के लिए एक विशिष्ट घटना के समय, और 100% की एक अलग करने घाटी के साथ, एक व्युत्पन्न दहलीज का उपयोग करने के spikes को पहचानें। पहले की पहचान की कील के लिए लिया गया समय उत्तेजना विरूपण साक्ष्य के अंत के बाद उत्पन्न करने के रूप में विलंबता की गणना। इस विश्लेषण के spikes, विलंबता, अंतर घटना अंतराल की संख्या के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, और अवधि के रूप में गणनाइस प्रकार है:
    2. प्रत्येक स्वीप के लिए दोलन प्रति spikes के कुल संख्या निर्धारित किया जाता है के रूप में के spikes की संख्या की गणना।
    3. दोलन विलंबता की गणना। प्रत्येक दोलन के लिए, उत्तेजना विरूपण साक्ष्य के अंत से पहले की पहचान की कील का समय घटाना।
    4. औसत अंतर-घटना अंतराल (आईएसआई) की गणना। कई का पता चला spikes और औसत के बीच समय अवधि निर्धारित करते हैं।
    5. दोलन की अवधि की गणना। प्रत्येक दोलन के भीतर पहली और आखिरी कील का पता चला के बीच के समय को मापने के।

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Representative Results

परत oriens की धनुस्तंभीय उत्तेजना मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य γ दोलनों (35.4 ± 2.2 हर्ट्ज) उत्पन्न, 3B चित्रा देखें। दोलनों सीए 3 से जानकारी एक तुला 32 जी सुई का उपयोग सीए 2 क्षेत्र में टुकड़ा काटने से कटे हुए थे स्थानीय सीए 1 नेटवर्क के भीतर उत्पन्न किया गया है कि प्रदर्शन करने के लिए। दोलनों स्थानीय रूप से उत्पन्न कर रहे हैं, यह दर्शाता है (काटा हुआ स्लाइस 5.89 ± 0.8 के spikes, एन = 6;, कट स्लाइस 6.16 ± 1.1 spikes के एन = 6 पी = 0.85) में कटौती स्लाइस में दोलन गुण काटा हुआ स्लाइस से अलग नहीं किया था।

इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण लाभ रिकॉर्डिंग की स्थिरता है। टिटनेस के 5 मिनट के अंतराल पर दिया गया था जब दोलनों (15 मिनट बनाम 30 मिनट पर spikes की संख्या के लिए पी = 0.26) किसी भी टुकड़ा के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए स्थिर थे। एक कंपन और अन्य मापदंडों के भीतर के spikes की कुल संख्या में स्लाइस के बीच परिवर्तनशीलता है। विकास के लिएआधारभूत गुण में मतभेद मामूली कारक हैं इतना है कि प्रयोगों बनती गलीचा अध्ययन किया जा सकता है। इंट्रा-टुकड़ा तुलना की परिवर्तनशीलता के लिए एक चिंता का विषय हो सकता है और पर्याप्त शक्ति की तुलना द्वारा दूर किया जा सकता है।

इसके बाद, इन tetanically प्रेरित सीए 1 γ दोलनों की पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं कि आयन चैनलों और रिसेप्टर्स की जांच की गई। Α अमीनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) के भेषज नाकाबंदी 20 माइक्रोन 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-Dione (CNQX) (चित्रा -4 ए, बी), गाबा के साथ रिसेप्टर्स 20 माइक्रोन bicuculline (चित्रा 4C) के साथ एक रिसेप्टर्स, मैं ज मौजूदा 20 माइक्रोन 4- (एन-इथाइल-एन-phenylamino) -1,2-डाइमिथाइल-6- (methylamino) pyrimidinium क्लोराइड (ZD7288) (चित्रा 4D) के साथ, और टी प्रकार सीए 100 माइक्रोन नी 2 + (चित्रा 4E) के साथ 2 + चैनलों स्वतंत्र रूप से उत्पन्न spikes के संख्या को कम करने में सक्षम प्रत्येक थे(पी <0.05; CNQX एन = 6; bicuculline एन = 7; ZD7288 एन = 6; नी 2 + एन = 6)। सुझाव है कि (नियंत्रण, 8.3 ± 2.2 के spikes, एन = 5; AP5, 5.9 ± 3.1 spikes के पी = 0.22) (2R) -amino-5-phosphonopentanoate (AP5, 20 माइक्रोन) के आवेदन के spikes की संख्या को प्रभावित नहीं किया NMDA रिसेप्टर्स इस तैयारी में γ दोलन पीढ़ी में शामिल नहीं हैं।

यह तैयारी ड्रग्स के नेटवर्क के पैमाने कार्रवाई का निर्धारण करने के लिए आदर्श है। Retigabine पोटेशियम चैनल को खोलता है और झिल्ली excitability के 18-20 को कम कर देता है कि एक चिकित्सकीय इस्तेमाल विरोधी मिरगी की दवा है। Retigabine के स्नान आवेदन (चित्रा 5) दोलन की एक खुराक पर निर्भर के स्पाइक्स की संख्या में कमी और अवधि का उत्पादन किया।

चित्र 1
चित्रा 1. खोपड़ी के योजनाबद्ध और फिर से करने के लिए कटौती के स्थान दिखा त्वचा overlying मस्तिष्क वील। A1, A2, बी और सी मस्तिष्क को हटाने के लिए खोपड़ी को खोलने के लिए किए जाने की जरूरत है कि कटौती के स्थानों को चिह्नित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
सीए 1 Schaffer में उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड चित्रा 2. प्लेसमेंट परीक्षण टुकड़ा स्वास्थ्य के लिए कोलेटरल। (ए) उत्तेजक इलेक्ट्रोड (Stim) और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (आरईसी)। (ख) एक 120 μA उत्तेजना (* द्वारा चिह्नित फाइबर वॉली) द्वारा पैदा की एक fEPSP का एक प्रतिनिधि उदाहरण के नियुक्ति दर्शाता है। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण।

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दोलन पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया रिकॉर्डिंग और उत्तेजना इलेक्ट्रोड की चित्रा 3. विन्यास। (ए) सीए 1 की परत pyramidale में परत oriens और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (आरईसी) में उत्तेजक इलेक्ट्रोड (Stim) का स्थान। (बी) का एक प्रतिनिधि उदाहरण धनुस्तंभीय उत्तेजना से प्रेरित γ दोलनों (विरूपण साक्ष्य "Stim" द्वारा चिह्नित)। मात्रात्मक outputs के दिखा प्रतिनिधि ट्रेस। आईएसआई अंतर-स्पाइक अंतराल। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Tetanically Gener के चित्रा 4. भेषज लक्षण वर्णनपैदा γ दोलनों। (ए) CNQX के प्रभाव का प्रदर्शन प्रतिनिधि ट्रेस। (बी) CNQX के प्रभाव का प्रदर्शन रेखांकन (20 माइक्रोन; एन = 6), (सी) bicuculline (20 माइक्रोन; एन = 7), (डी) ZD7288 (20 माइक्रोन; एन = 6) और (ई) नी 2 + (100 माइक्रोन; एन = 6) spikes के नंबर पर। डाटा बनती तुलना के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। * पी <0.05, ** पी <0.01 और, *** पी <0.001। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
नेटवर्क संपत्तियों पर चित्रा 5. Retigabine प्रभाव। नियंत्रण की स्थिति और (बी) और प्रेरित दोलनों (ए) के कम नेटवर्क गतिविधि दिखा प्रतिनिधि उदाहरण <retigabine के साथ मजबूत> (सी)। दोलन शुरुआत, और (छ) अंतर-स्पाइक अंतराल (आईएसआई) से (घ) कील गिनती, (ई) दोलन की अवधि, (एफ) विलंबता में दिखाया प्रभाव का सारांश। डाटा बनती तुलना के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। * पी <0.05। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस में सीए 1 γ दोलनों उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत विधि वर्णित है। उत्पन्न दोलनों को नियंत्रित करने और नेटवर्क दोलनों 12 के neurophysiological आधार को समझने के लिए एक बेहतर अवसर को सक्षम करने के लिए एक स्थानीय सर्किट से उत्पन्न होती हैं। AMPA रिसेप्टर्स, गाबा एक रिसेप्टर्स, मैं ज और टी प्रकार सीए 2 + चैनल सभी इस मॉडल में γ दोलनों के लिए आवश्यक हैं। यहाँ वर्णित स्थानीय सीए 1 दोलनों मजबूती के साथ उत्पन्न किया जा सकता है जबकि यह मस्तिष्क के स्लाइस स्वस्थ हैं कि यह सुनिश्चित करने पर निर्भर है। एक महत्वपूर्ण कदम बर्फ का ठंडा समाधान में हटाने और फिर तेजी से विसर्जन के दौरान मस्तिष्क घुसना नहीं देखभाल करने के लिए खोपड़ी से मस्तिष्क के तेजी से हटाने है। टुकड़ा स्वास्थ्य 21 संरक्षित करने के लिए 60 सेकंड - आदर्श रूप में कत्ल और खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने के बीच के समय में कोई 30 से अधिक होना चाहिए।

धनुस्तंभीय उत्तेजना का उपयोग करके स्थानीय सीए 1 γ दोलनों हो सकता हैऔषधीय एजेंटों पर निर्भरता के बिना मानक शारीरिक रिकॉर्डिंग समाधान में उत्पन्न। इस औषधीय एजेंटों के अलावा व्याख्या उलझाना सकता है, जहां रोग मॉडल में विकृतियों निस्र्पक के लिए लाभदायक है। उदाहरण के लिए, विरोधी मिरगी दवाओं के लिए इस मॉडल को स्थानीय सीए 1 गतिविधि और संवेदनशीलता का उपयोग करते हुए मानव आनुवंशिक मिर्गी 22 की एक माउस मॉडल में बढ़ाया गया था। नेटवर्क गतिविधि की जांच करने के लिए इस मॉडल का उपयोग मिर्गी तक ही सीमित नहीं है और आसानी से ऐसे अल्जाइमर रोग, आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन के रूप में अन्य रोगों के लिए लागू किया जा सकता है। औषधीय एजेंटों की वजह से मस्तिष्क टुकड़ा 23 की चयापचय की मांग करने के लिए पर्याप्त ऊतक oxygenation है, स्थानीय सीए 1 दोलनों उत्पन्न करने के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं। उच्च छिड़काव दरों मस्तिष्क के स्लाइस 24,25 के लिए एक अधिक शारीरिक वातावरण बनाने टुकड़ा के भीतर ऑक्सीजन और पीएच संतुलन में सुधार होगा।

Generat को धनुस्तंभीय उत्तेजना का उपयोग करने का एक और लाभई नेटवर्क दोलनों एक प्रासंगिक प्रयोगात्मक डिजाइन एक repeatable ढंग से, इस तरह की शुरुआत, अवधि और कील संख्या में देरी के रूप में नेटवर्क गतिविधि मापदंडों की अधिक तैयार quantitation के लिए सक्षम बनाता है कि इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके विपरीत, रासायनिक प्रेरित नेटवर्क गतिविधि सहज 13,15,16,26-28 और यों के लिए और अधिक कठिन है। धनुस्तंभीय उत्तेजना, हालांकि, समय के साथ नेटवर्क गतिविधि में परिवर्तन पैदा कर सकता है, जो NMDA रिसेप्टर पर निर्भर synaptic plasticity में परिवर्तन का कारण बन सकता है। इस के लिए नियंत्रण और कई धनुस्तंभीय stimulations की प्लास्टिसिटी परिवर्तन पर स्थिर दोलन पीढ़ी सक्षम करने के लिए 2 मिलीग्राम + स्तर को ऊपर उठाने के द्वारा सीमित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के reproducibility को बढ़ाता है हालांकि यह NMDA रिसेप्टर समारोह के किसी भी प्रभाव के लिए अपारदर्शी है।

इंटरफ़ेस रिकॉर्डिंग कक्षों, टुकड़ा स्वास्थ्य में सुधार छोटे उत्तेजना कलाकृतियों का जोड़ा लाभ के साथ शोर अनुपात और अधिक फोकल कम तीव्रता उत्तेजना के लिए बेहतर संकेत प्राप्ति कर सकते हैं। छिद्रित chambeआर रिकॉर्डिंग तरीकों में भी लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए टुकड़ा स्वास्थ्य में सुधार होगा। माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग कक्षों या पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग बेहतर γ दोलनों और व्यापक नेटवर्क समारोह पर उनके प्रभाव अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान मापा जा करने के लिए व्यापक क्षेत्र और एक न्यूरॉन समारोह में सक्षम बनाता है। वोल्टेज और कैल्शियम सेंसर का समावेश के साथ-साथ optogenetic विधियों दोनों रिकॉर्डिंग और उत्तेजक लद में अतिरिक्त प्रयोगात्मक लचीलापन शुरू होगा। इसी प्रकार प्रोटोकॉल अध्ययन के तहत रोग विकृति विज्ञान के लिए और अधिक प्रासंगिक हो सकता है कि मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों के लिए विकसित की है। प्रोटोकॉल के लिए एक अंतिम उपयोग के निर्माण और एक न्यूरॉन पैच दबाना और इमेजिंग अध्ययन के साथ क्षेत्र रिकॉर्डिंग के संयोजन से दोलनों की गणना मॉडल के परीक्षण के लिए हो सकता है यहाँ का वर्णन।

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288) Sigma-Aldrich Z3777
Biuculline Sigma-Aldrich 14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX) Sigma-Aldrich C127
Nickel Sigma-Aldrich 266965
Carbamazepine Sigma-Aldrich C4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV) Tocris Bioscience 0105
Retigabine ChemPacific 150812-12-7
Choline-Cl Sigma-Aldrich C1879-5KG
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-250G
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297-250G
NaCl Sigma-Aldrich S7653-5KG
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 • 2H2O Sigma-Aldrich 223506-500G
MgCl2 • 6H2O Sigma-Aldrich M2670-500G
Electrode glass Harvard Apparatus  GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode  FHC CBBPF75
Digital Isolator Getting Instruments Model BJN8-9V1 
Model 1800 amplifier A-M systems Model 1800 amplifier
Digitizer National Intruments NI USB-6211
Vibrotome Leica VT1200s

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 102 गामा दोलनों सीए 1 हिप्पोकैम्पस नेटवर्क गतिविधि विरोधी मिरगी दवाओं
धनुस्तंभीय उत्तेजना से स्थानीय सीए 1 γ दोलन की पीढ़ी
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Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. Generation of Local CA1 γ Oscillations by Tetanic Stimulation. J. Vis. Exp. (102), e52877, doi:10.3791/52877 (2015).

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