Abstract
Los límites a la resolución óptica y el reto de identificar poblaciones específicas de proteína en microscopía electrónica de transmisión han sido obstáculos en la biología celular. Muchos fenómenos no se pueden explicar mediante análisis in vitro en los sistemas simplificados y necesitan información estructural adicional in situ, en particular en el rango entre 1 nm y 0,1 m, con el fin de ser plenamente comprendido. Aquí, imágenes espectroscópicas de electrones, una técnica de microscopía electrónica de transmisión que permite el mapeo simultáneo de la distribución de las proteínas y ácidos nucleicos, y una etiqueta de expresión, miniSOG, se combinan para estudiar la estructura y organización de ADN de doble hebra focos romper la reparación.
Introduction
A pesar de los importantes avances en microscopía de luz en los últimos años 1, celulares biólogos todavía sufren de una brecha en la resolución. Esto limita la comprensión de las relaciones estructura-función en los procesos celulares fundamentales que implican la interacción coordinada entre los complejos macromoleculares (por ejemplo, en remodelación de la cromatina, la reparación del ADN, el ARN transcripción y replicación de ADN). Aunque los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) es proporcionar la resolución necesaria, ha sido un reto para definir estos procesos estructuralmente debido a la incapacidad para etiquetar proteínas específicas al mismo tiempo ser capaz de determinar la composición bioquímica de las estructuras visualizadas. En ausencia de membranas internas para ayudar a diferenciar las estructuras nucleares, el núcleo ha sido particularmente difícil. Electron espectroscópica de imágenes (ESI) resuelve algunas de estas limitaciones, permitiendo la detección simultánea y diferenciación de ADN, ARN y protein-basada estructuras nucleares 2-5.
Electron imágenes espectroscópicas:
Con el fin de mapear las distribuciones elementales a alta sensibilidad y resolución en el microscopio electrónico, se puede usar un espectrómetro de imágenes que selecciona los electrones que han sido dispersos inelásticamente través de interacciones con electrones de la capa interior de un elemento en la muestra 6. Puesto que las cantidades de elementos específicos de la energía se pierden como consecuencia de la ionización de los átomos en la muestra, estos electrones se pueden separar y se visualizaron usando un espectrómetro que está unido al microscopio electrónico. Por lo tanto, el análisis del espectro de los electrones que han interactuado con el espécimen revela información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición elemental de la muestra 7. Los electrones que no pierden energía cuando pasa a través de la muestra se encuentran en el "pico de pérdida cero" de la pérdida de energía de electronesespectro. La abundancia de estos electrones se relaciona con la masa, densidad y espesor de la muestra y se compone de electrones que pasan a través de la muestra sin chocar con la muestra o la pérdida de energía durante el paso a través de la muestra. Esta información puede ser útil para la cuantificación absoluta de los números de átomos de un elemento específico presente en la muestra 8.
Dado que las muestras biológicas consisten principalmente de elementos ligeros que mal desvían los electrones en el haz incidente de la TEM, métodos de tinción usando sales de metal pesado tienen que ser aplicados con el fin de generar contraste en la muestra. La falta de especificidad de la mayoría de estos agentes de contraste y la incapacidad para visualizar más de una mancha donde es posible especificidad ha limitado el valor de la microscopía electrónica convencional en el estudio del núcleo. ESI tiene ventajas significativas sobre TEM convencional, en particular para el estudio de las estructuras del núcleo de la célula.Es posible explotar la naturaleza rica en fósforo de ADN y complejos macromoleculares que contienen ARN para distinguir los complejos de nucleoproteína de complejos de proteínas y para resolver diferentes complejos de nucleoproteína en función de su densidad de ácidos nucleicos. El material biológico restante se pueden obtener imágenes en base a su abundancia de nitrógeno. Asignación de sólo estos dos elementos y el análisis de su distribución y abundancia relativa dentro de las diferentes estructuras anatómicas nos proporciona una gran cantidad de información sobre el núcleo. Por ejemplo, es fácil identificar la cromatina y los ribosomas en el mapa que representan la abundancia de fósforo. El espacio interchromatin, complejos de poro nucleares, y los cuerpos nucleares, por otro lado, pueden detectarse fácilmente en la imagen del mapa de nitrógeno.
Mini sistema generador de oxígeno singlete (miniSOG)
Mientras ESI representa una poderosa técnica para el estudio de la estructura de la cromatina in situ, ya que tomas ventaja de las relaciones característicos en la composición elemental entre el fósforo y el nitrógeno, la composición elemental no puede normalmente ser usada para discriminar entre diferentes poblaciones de complejos de proteínas. Anticuerpos marcados con pequeñas partículas de oro en el rango nanométrico se han utilizado ampliamente para mapear la localización de moléculas individuales. Dado que la partícula de oro generalmente se une a un anticuerpo secundario, aparecerá dentro de una circunferencia de aproximadamente 20 nm alrededor del epítopo detectado por el anticuerpo primario. En las muestras post incrustación, los anticuerpos sólo pueden detectar los epítopos que están expuestos en la superficie de las secciones. Si bien es posible demostrar la presencia de un antígeno y relacionarlo con una cierta estructura anatómica de la célula, la información que se obtiene es incompleta, ya que la mayoría de los epítopos están oscurecidos por la resina. Técnicas, que utilizan protocolos similares a los utilizados para la microscopía de fluorescencia Pre-incrustación, permitir el acceso a los antígenos a lo largotoda la profundidad de la muestra pero los pasos de permeabilización que se requieren para permitir que el anticuerpo para penetrar en la célula típicamente requieren la eliminación de las membranas lipídicas y eliminar componentes que no pueden ser corregidos por aldehídos. Por otra parte, el fijador aldehído preferido para la preservación ultraestructura, glutaraldehído, comúnmente destruye epítopos y, en consecuencia, paraformaldehído se requiere típicamente. Esto es menos efectivo en la reticulación proteína-proteína. Otra desventaja de los anticuerpos que se etiqueta con una nanopartícula de oro es que el oro es un material muy denso en electrones que crea un fuerte contraste que puede oscurecer los detalles estructurales interesantes de la muestra, que tiene más débil contraste.
La aparición de la proteína verde fluorescente (GFP) como una etiqueta proteína expresada ha transformado el uso de microscopía de fluorescencia para responder a preguntas de la biología celular. Etiquetado de una proteína con un pequeño dominio fluorescente permite el mapeo de su distribución in vivo 9. Los productos de reacción de HRP pueden también difunden lejos del lugar de generación de modo que su resolución es peor que el método Nanogold 10. Con el fin de evitar estos problemas, el sistema / ReAsH FLASH fue desarrollado 11. Se compone de proteínas de fusión recombinantes que poseen un motivo tetracisteína. Este motivo permite la unión deun fluoróforo biarsenic. Cuando excitado, el flash consolidado o ReAsH es capaz de generar el oxígeno atómico altamente reactivo y diaminobencidina tanto photoconvert (DAB) en un polímero que precipita inmediatamente en el lugar de las proteínas etiquetadas. El polímero DAB se puede teñir con tetróxido de osmio, que es denso en electrones y por lo tanto se puede utilizar para mapear la distribución de la proteína de fusión recombinante en el TEM.
En 2011, Shu et al. 10 presentó el sistema miniSOG, que consiste en una pequeña 106 amino ácidos etiqueta de fusión derivada de una flavoproteína de Arabidopsis que es fluorescente y capaz de crear muchos radicales de oxígeno singlete cuando se excita con luz azul 448 nm. Estos radicales de oxígeno singlete se pueden utilizar para diaminobencidina foto-oxidar para formar polímeros en y cerca de la superficie de la proteína etiquetada, que es considerablemente más estrecha que los anticuerpos marcados inmunoelectrónica 11. Mientras que el sistema de flash / ReAsH requiere llevar el flúorcromo y la diaminobenzidina en las células antes de hacer la fotoconversión, el sistema miniSOG sólo requiere diaminobencidina y la luz y, además, es dos veces más eficaz en la polimerización de diaminobencidina. Aquí, miniSOG se emplea en combinación con ESI con el fin de mapear la ultraestructura de focos de reparación del ADN.
Focos de reparación del ADN (DRF)
ADN no reparado doble filamento se rompe representan una seria amenaza para la célula, ya que pueden dar lugar a translocaciones y pérdida de información genética. A su vez, esto puede conducir a la senescencia, el cáncer y la muerte celular. Muchas proteínas que están implicadas en la reparación de ADN de doble filamento romper acumulan en los focos que reunir en torno a una doble cadena de ADN romper 12-14. Aunque su función no se conoce, que representan el sitio en el núcleo que contiene el ADN de doble capítulo romper y es el sitio de ADN de doble hebra de romper la reparación.
Foc reparación del ADNi (DRF) se han caracterizado por microscopía de fluorescencia y servir como biomarcadores de daño en el ADN 12,15. Ellos son enormes en relación con el tamaño de la rotura de doble cadena y se consideraron relativamente homogénea hasta que los estudios de microscopía de super-resolución recientes revelaron algunas pruebas de sub-compartimentación de moléculas en cada enfoque 16. Con el fin de entender cómo se organizan estos sitios, es necesario para visualizar todas las estructuras biológicos subyacentes respecto a la otra. Esto no se puede lograr mediante microscopía de fluorescencia, pero es posible a través de microscopía electrónica 17,18. Aquí, se describe un método que combina imágenes espectroscópicas de electrones con el método miniSOG para ilustrar el potencial de este enfoque combinado para explorar la ultraestructura de reparación del ADN de doble filamento romper.
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Protocol
1. Generación de miniSOG líneas celulares
- Crecer células U2OS (osteosarcoma humano) en una placa de 35 mm que contiene 2 ml de glucosa baja en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 atmósfera.
- Transfectar las células cuando son 80% de confluencia mediante lipofección con la calidad de la transfección purificada (A269 / ratio de 280 1.8-2.0) construcciones de plásmidos que contienen las secuencias para miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación de acuerdo con el protocolo del fabricante del reactivo de transfección 19. Los plásmidos de expresión miniSOG pueden ser solicitados a la Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- Ordenar las células que expresan la proteína recombinante con la etiqueta miniSOG y mCherry por fluorescencia de células activadas por la clasificación dos días después de la transfección. Recoger las célulascon la intensidad de fluorescencia intermedia con el fin de evitar las células que se sobreexpresan 20.
- Cultivar las células positivas en un plato de 10 cm en 10 ml de medio DMEM que se complementa con 10% de FBS y 0,6 g / ml del agente de selección G418 (geneticina).
- Después de colonias visibles han surgido en las placas, de pantalla para colonias mCherry positivas usando un microscopio de fluorescencia invertido y dibujar círculos alrededor de ellos (en la parte inferior de la placa) con un marcador permanente. Use un lente objetivo de aire bajo aumento (por ejemplo, 10 veces) y recoger clones usando una técnica estéril por rascarse cuidadosamente las colonias fuera y lentamente chupar ellos en una punta de pipeta de 1.000 l estéril.
- Expandir las colonias seleccionadas y congelar partes de ellos hacia abajo usando el medio de crecimiento descrito en el paso 1.1 suplementado con 10% de sulfóxido de dimetilo. Pon a prueba las células para la formación DRF cultivándolas en 18 x 18 mm 2 cubreobjetos estériles y exponiéndolos a2 Gy de radiación. Las células irradiadas que expresan establemente un miniSOG mCherry etiquetados proteína de reparación debe mostrar el patrón típico característico focal de DSBs cuando visualizó con un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro de set-para obtener imágenes de mCherry.
2. Cultivo Celular
- Cultura U2OS células que expresan establemente el miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación en las condiciones descritas en el paso 1.1. Cultivan las células a 80% de confluencia en una placa de fondo de vidrio de diámetro 35 mm que contiene 2 ml de DMEM. Asegúrese de que el pegamento que une la hoja de la cubierta para el plástico y el plástico utilizado es resistente a las soluciones acuosas y alcohólicas y resistente a la resina utilizada!
- Antes de realizar el experimento, esbozar una pequeña zona de aproximadamente 1 mm 2 que contiene células que expresan las proteínas ectópicos por el rascado con una pluma de diamante estéril usando un microscopio de fluorescencia para identificar la región de interés. Alternativamente, puede utilizar un plato con fondo de cristal tsombrero contiene un cubreobjetos con un sistema de red pre-grabado al agua fuerte incorporado en el cubreobjetos.
NOTA: Si utiliza la microscopía correlativa de alta calidad que combina ESI y fluorescencia imágenes microscópicas 21, asegúrese de que el grosor del cubreobjetos es compatible con los objetivos de inmersión en aceite. Debe tener el espesor No. 1,5 (desde 0,16 hasta 0,18 mm). Elija un área cerca del centro del plato para la región a ser examinada en el TEM con el fin de evitar problemas con la polimerización de la resina que puede ocurrir cerca de los bordes (véase el punto 4.10 a 4.13).
3. ADN Inducción Daños
- Irradiar las células con radiación gamma, utilice un fármaco radio, o inducir el daño por irradiación láser micro en un microscopio confocal (por ejemplo, como se describe en 18,22 o 23).
- En este ejemplo, irradiar las células con 2 y 6 Gy de irradiación gamma en un microirradiate de cesio-137 fuente de radiación o láser usando el sol 405 nmIdentificación del láser de estado de un microscopio confocal después de la sensibilización de las células durante 20 min con 0,5 g / ml Hoechst.
Preparación 4. Muestra
- Fijar las células con 1 ml de paraformaldehído al 4% en tampón cacodilato PRECAUCIÓN 0,1 M de sodio o en tampón fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 30 min a RT en la oscuridad.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído y cacodilato de sodio son tóxicos! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. - Lavar las células dos veces con 4 ml de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o tampón fosfato pH 7,4.
- Tratar las células fijadas con glicina 2 ml de 50 mM, 5 mM aminotriazol y 10 mM cianuro de potasio PRECAUCIÓN en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o un tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) (comprobar el pH!) Por 30 min con el fin de bloquear sin reaccionar grupos aldehído y para suprimir la especies reactivas de oxígeno generadas por grupos hemo, que puede aumentar el fondo.
PRECAUCIÓN: cianuro de potasio es extremadamente tóxico! Wguantes de oído, trabajan bajo una capucha y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. La reacción es muy sensible a pH por lo que es importante que el pH verificados y precisa. - Registre el área que se seleccionó en el paso 2.2 en 2D o 3D en un microscopio de fluorescencia invertida, si se desea microscopía correlativa.
- Preparar una solución de diaminobencidina 1 mg / ml de clorhidrato PRECAUCIÓN mediante la colocación de un comprimido de 10 mg de clorhidrato de diaminobencidina en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Añadir 980 l de H2O destilada y 20 l de ácido clorhídrico concentrado (11,65 M) y mezclar hasta que la solución es de color marrón claro y translúcido. Diluir esta solución en 0,1 M de fosfato o tampón de cacodilato de sodio 0,1 M a una concentración final de 1 mg / ml mientras se ajusta el pH con hidróxido de sodio a un pH entre 7,0 y 7,6 (pH 7,4 se recomienda).
PRECAUCIÓN: Diaminobencidina es tóxico! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. - Para fotooxidación, replace el tampón con 2 ml de una solución de 1 mg / ml de diaminobencidina hidrocloruro en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o tampón fosfato. Proteger esta solución de la luz y enfriarlo en hielo para 4 o C con el fin de aumentar la solubilidad del oxígeno. Saturar la solución con oxígeno burbujeando oxígeno a través de la solución (utilizar una manguera que se inserta en la solución y conectado a una botella de oxígeno). Comprobar el pH de nuevo y ajustar si es necesario.
NOTA: Es fundamental para la reacción de foto-oxidación que el pH está entre pH 7,0 y pH 7,6. - Montar el plato con las células fijadas con cuidado sobre un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una lente de objetivo de 40x de inmersión en aceite y moverlo a la zona de interés. Excite la etiqueta miniSOG con luz azul utilizando cubos de filtro para las buenas prácticas agrarias o PPC. MiniSOG tiene un máximo de excitación a 448 nm con un hombro a 473 nm 10.
- Continuar con la iluminación, incluso después de que el verde miniSOG fluorescencia jas desaparecido por completo y hasta que el producto fotooxidación marrón del Diaminobencidina polimerizado emerge en el canal de la luz transmitida. Cuando el producto de oxidación es visible en la mayoría de las células, apagar la iluminación de fluorescencia para detener la foto-oxidación.
NOTA: La foto-oxidación puede tardar varios minutos, dependiendo de la lente del objetivo, las longitudes de onda de transmisión del filtro y la eficiencia, y la fuente de iluminación. - Postfix las células con 1 ml de glutaraldehído al 2% en cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 tampón de pH o tampón de fosfato 7,4 durante 30 min.
- Fijar las membranas de las células con 0,1% -0,5% de tetróxido de osmio durante 20 min en tampón cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4.
NOTA: Se recomienda el uso de la concentración más baja posible de tetróxido de osmio requerido para estabilizar las membranas. Puesto que los precipitados DAB polimerizados tienen una alta densidad de nitrógeno, que puede ser detectada directamente por ESI, un fuertetinción de osmio no es necesario identificar la proteína marcada con miniSOG y podría ser perjudicial para la ESI. El tetróxido de osmio es muy tóxico! Trabajar en una campana extractora y disponer adecuadamente los residuos tóxicos. - Deshidratar, las células a través de una serie de etanol usando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100 pasos de etanol (% cada 5 min). Posteriormente, se incuban las células en una mezcla 1: 1 de etanol al 100% y resina acrílica (LR White) y poner el plato en un agitador durante 4 horas para facilitar la infiltración en las células antes de la incubación de las células durante al menos otros 4 h en 100 resina acrílica% (LR White).
- Con el fin de polimerizar la resina, cortar la tapa de un tubo de microcentrífuga de 2 ml marcado con un hoja de afeitar y recubrir el borde con acelerador de resina acrílica. Asegúrese de que el acelerador sólo cubre la llanta y no fluye en el tubo. Posteriormente, llenar cuidadosamente el tubo aproximadamente dos tercios con resina LR White usando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado de que la resina no entra en contacto ingenioh el acelerador en la llanta!
- Retire la resina que se infiltró en las células en el plato y colocar el plato boca abajo sobre el tubo de microcentrífuga de pie en posición vertical para que el ancho del tubo se llena casi por completo la ventana de observación de vidrio cubierto del plato.
- Espere 1 a 2 min para el acelerador para sellar el tubo y el cubreobjetos, a continuación, invertir el tubo de manera que la resina en el tubo cubre ahora las células.
- Coloque el plato con el tubo en un horno a 60 ° C y curar durante 12 horas.
- Cuando se cura el bloque, retire el plato con el tubo de microcentrífuga de llenado de resina adjunta del horno y separar el tubo de microcentrífuga de la antena. Facilitar la separación por ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y agua caliente.
- Deseche el plato con fondo de cristal y cortar cuidadosamente abrir el tubo de microcentrífuga con una hoja de afeitar con el fin de quitar el bloqueo.
- Marque el bloque con un marcador permanente.
- Utilice una hoja de afeitar a trim el bloque de manera que nada más que la región de 1 mm 2 que contiene el área marcada previamente con el lápiz de diamante o de tungsteno (o contiene el área con las células de interés) se mantiene.
- Monte el bloque en un ultramicrotomo, recorte el bloque con un cuchillo de cortar y cortar secciones ultrafinas de aproximadamente 50 nm usando un cuchillo de diamante.
- Recoge las secciones de alta transmisión de 300 redes de malla. Estas rejillas tienen muy pequeñas barras de la rejilla y por lo tanto cubren menos células en el área de interés.
- Cubra las secciones sobre las rejillas con aproximadamente 0,2 a 0,4 nm de carbono utilizando un dispositivo de recubrimiento de carbono para ayudar a estabilizar bajo el haz de electrones del TEM.
5. Microscopía Electrónica
- Cargar las rejillas en un TEM que está equipado con un filtro de energía. Después de sintonizar el microscopio y el filtro de energía de acuerdo con las instrucciones del fabricante, inspeccionar las células en las secciones en el modo de bajo aumento (transmisión normal) y compararellos a la fluorescencia de datos cuando sea apropiado (obtenido en el paso 4.4).
- Una vez que un núcleo con características interesantes (pista daño en el ADN o ADN focos de reparación) se encuentra, cambie al modo de filtrado de energía y registrar un mapa de espesor.
NOTA: Este procedimiento incluye la grabación de una pérdida de cero y una imagen sin filtrar. Espesores de hasta 0,3 recorrido libre medio (30% de los electrones del haz incidente se dispersa por la muestra) son lo suficientemente delgada como para generar buenos mapas elementales. - Mapas de relación de registro de los elementos fósforo y nitrógeno utilizando el software que controla el filtro de la energía del microscopio usado. Registre el mapa de fósforo imágenes de borde posterior en 175 eV pérdida de energía con una anchura de rendija de 20 eV y pre-borde imágenes a 120 eV pérdida de energía, también con una anchura de rendija de 20 eV. Para los mapas de nitrógeno, grabar imágenes de borde posterior de 447 eV con un ancho de ranura de 35 eV y pre-borde imágenes a 358 eV, también con un ancho de ranura de 35 eV.
NOTA: Debido a que el contenido de los elementos fotografiados (fosfOrus y nitrógeno) es relativamente baja (aprox. 1%), elija "Relación de Imagen" (mapa elemental cualitativo) sobre el "Método 3 ventana" (cuantificar mapa elemental) con el fin de generar imágenes con una mejor relación señal-ruido.
Procesamiento 6. Imagen
- Abra los mapas elementales de relación en un software de procesamiento de imágenes que puede manejar el formato de archivo de las imágenes adquiridas (por ejemplo, Micrografía Digital). Copie el mapa de nitrógeno en el canal rojo y el mapa de fósforo en el canal verde de una imagen RGB, a continuación, superponer y alinear los mapas.
- Exportar la imagen compuesta como un archivo de formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF). Abre la imagen en un software de procesamiento de imágenes que se pueden usar capas (por ejemplo, Photoshop).
- Ajuste el rango dinámico de cada canal por reescalar los valores máximo y mínimo en la imagen a un conjunto de datos de 8 bits (0 a 255).
- Restar el contenido de fósforo desde el mapa de nitrógeno (usando el"Capas" ventana) con el fin de generar un mapa cualitativo que muestra la distribución de la proteína.
- Convertir los mapas del ácido nucleico (fósforo) y la proteína (nitrógeno), creado en el paso anterior en "color indexado" y crear una tabla de búsqueda de color amarillo en el espacio de color CMYK para el mapa que muestra la distribución de ácido nucleico y una tabla de búsqueda cian para mostrar el mapa no nucleoproteína. Los colores se eligen para generar el máximo contraste entre los dos mapas elementales.
- Crear una nueva imagen e importar los mapas que muestran la distribución de fósforo y proteínas como las diferentes capas. Utilice el modo de transparencia "pantalla" con el fin de ver las dos capas superpuestas unas sobre otras.
- Abra la imagen-cero pérdida adquirida en el paso 5.2. Esta imagen representa una imagen de la zona grabada que se ve una imagen TEM convencional como pero sólo contiene los electrones que han pasado a través de la muestra sin chocar con la muestra. Exportaciónesta imagen como una imagen TIFF.
- Abra la imagen cero pérdida exportado en un editor de fotos y copiarlo en la capa superior de la imagen que muestra el mapa elemental. Alinear la imagen usando el modo de transparencia "pantalla".
- Umbral Opcionalmente la imagen para bajar de cero a segmento de la señal que se origina en el miniSOG. Añadir la imagen resultante como una capa separada como se describe anteriormente.
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Representative Results
ESI
Comparando las imágenes ESI del núcleo (Figura 1) con las imágenes de TEM convencionales (por ejemplo, la Figura 7-1) revela un aumento dramático en las estructuras anatómicas que pueden ser fácilmente distinguido. Las crestas de la cromatina aparecen en amarillo y es muy fácil de identificar las chromocenters en células de ratón. Nucleolos se puede distinguir fácilmente de la cromatina por su estructura redonda y color diferente, ya que los ribosomas premontados ya contienen altas cantidades de proteína, que es rica en nitrógeno, además de la RNA, que es rico en fósforo. La cromatina periférica reside como una capa fina en la frontera del núcleo y los poros nucleares puede ser visto como estructuras ricas en nitrógeno que interrumpen la cromatina periférica. A menudo, la lámina puede ser visto como una capa muy delgada azul fuera de la cromatina periférica. En el citoplasma, muchas partículas pequeñas ricas en fósforo puedeser visto. Estos pueden ser identificados como los ribosomas en función de su tamaño, abundancia y la ubicación fuera del núcleo. El espacio interchromatin puede ser visto como la zona rica en proteínas situado entre la cromatina. Este contiene cuerpos nucleares y zonas ricas en pequeñas señales amarillas, como las partículas de ribonucleoproteínas y racimos de gránulos ribonucleoprotein (Figura 2). Este último se denominan interchromatin racimos de gránulos y son característicamente enriquecidos en proteínas necesarias para la pre-mRNA de empalme. Figura 1B, C y D ilustran la aparición de otras estructuras conocidas como cromosomas mitóticos, centrosomas, mitocondrias y centrómeros. En la Figura 2, se resumen los pasos utilizados para generar imágenes compuestas de colores de los mapas de relación de elementales primas. Fusionando el mapa de fósforo (verde) y el mapa de nitrógeno (rojo) en el espacio de color RGB (fila superior) permite una mejor evaluación de las cantidades de esos elementos en la muestra. However, restando la señal de fósforo para agotar la contribución de las estructuras que contienen ácido nucleico a partir del mapa de nitrógeno para producir el mapa de proteínas (cian) y la fusión con el mapa de fósforo (amarillo) en el espacio de color CYMK proporciona una representación visual más clara de nucleoproteína y no nucleoproteína (fila inferior). Esto permite que los datos a ser interpretados fácilmente por los individuos más familiarizados con la tecnología.
Células microirradiated Láser expresan MDC1, 53BP1 y Rad52
Debido al tamaño, la forma definida por el usuario y la ubicación de las pistas de daños láser, la región de DAB deposición en las células láser microirradiated son muy fáciles de encontrar en el TEM al utilizar el sistema de miniSOG. Las imágenes tomadas en el modo de transmisión de magnificación baja (es decir, TEM campo claro convencional) revelan las huellas de daños característicos y se pueden comparar con los datos que se grabó con un microscopio de fluorescencia antes de la incorporación.Esto es especialmente útil si se pretende microscopía correlativa, ya que permite una fácil identificación y traslado de núcleos individuales. (Figura 2-4).
El primer ejemplo (Figura 3) muestra una línea celular U2OS expresan establemente MDC1 miniSOG-mCherry. En un experimento microirradiation láser, el reclutamiento de la MDC1 que contiene las etiquetas miniSOG y mChrerry era muy similar a las versiones GFP-etiquetados de esta proteína (datos no mostrados). La fijación de las células 1 hora después de daño en el ADN de la inducción y la preparación de la muestra para el TEM, las pistas de daños MDC1 fueron identificados fácilmente en secciones ultrafinas en el modo TEM normales como rayas oscuras en los núcleos, lo que correspondía muy bien a los datos de fluorescencia ( Figura 3-5). Cuando observamos la distribución de la proteína, un claro aumento en la señal de nitrógeno se pudo observar en los sitios de láser dañado. Hay que señalar aquí que este es causado principalmente por la diami polimerizado nobenzidine, que es rica en nitrógeno y amplifica la señal de la miniSOG etiquetada proteína de reparación, en lugar de únicamente a través de la acumulación de proteínas de reparación en la pista de daños. La comparación de la estructura de la cromatina en el resto del núcleo con la estructura en las pistas de daños muestra una clara diferencia. La cromatina dañado (que se muestra dentro de las líneas de trazos en la Figura 3) aparece más decondensed en contraste con la cromatina no irradiado, que se produce en las crestas gruesas en el nucleoplasma. Dentro de las pistas de daños, también se pudieron observar cuerpos nucleares (200-300 nm) (señaladas por las flechas en la figura 3 II2, IIb, IIc y IIIa) que son ricos en proteínas MDC1-miniSOG pero libre de ácido nucleico. Sería muy difícil definir estos cuerpos nucleares como estructuras de cromatina libre sin esta técnica. También sugiere un nivel adicional de complejidad a los sitios de daño que no se predijo por la bioquímica conocida de MDC1.
ntent "> En cuanto a las pistas de daño de 53BP1 (Figura 4) que se crearon usando las mismas condiciones que el daño se ha descrito previamente en las células MDC1 transfectadas, resultados muy similares se pueden observar. La señal que se produce por la foto-oxidación de el miniSOG estaba lleno y llena el espacio entre los pliegues de la cromatina. cuerpos nucleares con manchas también pueden ser observados (resaltado por una flecha en la Figura 4 D, E, F).A partir de experimentos con construcciones Rad52-GFP, se sabe que Rad52 formará pequeñas microcompartements brillantes 24 a lo largo de una pista de daño inducido por láser. Debido al límite de resolución de los microscopios ópticos convencionales, ha sido poco claro qué tan grande estas estructuras realmente son y cómo se relacionan con el ADN dañado. En cuanto a la imagen TEM de los núcleos U2OS láser irradiadas que expresan constitutivamente Rad52-miniSOG-mCherry, el tamaño de estos cuerpos se midieron para estar en la media (150-250 nm). esaún más sorprendente para un vistazo a estos focos con ESI. En contraste con los ejemplos anteriores, los focos Rad52-miniSOG-mCherry parecen estar organizado de manera muy diferente a lo largo de la pista daños y parecen ser estructuras de cuerpo como nucleares compactos que se componen de proteína y no tienen ácidos nucleicos detectables dentro de su interior. En base a mirar el ácido nucleico de la relación / proteína en las zonas dañadas obtenidos con nuestro abordaje combinado miniSOG y ESI, sugerimos que la reparación del ADN puede tener lugar en la superficie de los focos y no en el interior.
La imagen inferior de la Figura 5 muestra los resultados similar a la Figura 3-III. La cromatina en la zona dañada parece estar más descondensada en comparación con el de la cromatina en las áreas no irradiadas (ver área delineada por guiones rojos).
Células irradiadas Gamma
Mientras láser micro-irradiación es una herramienta conveniente para quicklproteínas de prueba Y que contienen una etiqueta fluorescente para el reclutamiento a los sitios de las lesiones del ADN, crea grandes cantidades de daño compleja (doble filamento se rompe, se rompe una sola hebra, el daño base y dímeros cyclopyrimidine) 25. Con el fin de estudiar los compartimentos que se forman alrededor de ADN de doble filamento se rompe más directamente, examinamos DRF que se forman alrededor DSBs individuales mediante la exposición de las células a la irradiación gamma.
Células U2OS que expresan de forma estable 53BP1-miniSOG-mCherry se expusieron a 2 Gy de irradiación gamma y se fijaron media hora después de la irradiación. El patrón característico de grandes focos distribuidos por todo el nucleoplasma se pudo observar (Figura 6Ia). Después de la foto-oxidación de diaminobencidina, manchas oscuras emergentes en las posiciones donde se encuentran las señales mCherry fluorescentes en micrografías de fluorescencia se podía ver en las micrografías electrónicas (Figura 6iB yc). Estas manchas pueden ser correlacionados a TEM imágenesque fueron llevados a bajo aumento (Figura 6Id ye). Las imágenes ESI de estos focos, que parecían ser aproximadamente 1-1,5 micras de diámetro, mostraron una estructura interesante. Hebras delgadas de la cromatina parecían estar intercalados con proteínas 53BP1 de aproximadamente dos veces el espesor.
En otros experimentos, las células fueron expuestas a una mayor cantidad de radiación y se fijan en puntos de tiempo posteriores (después de 3 hr y 6 hr, respectivamente) con el fin de generar focos de mayor tamaño y facilitar la localización de ellos en las secciones ultrafinas (Figura 7). Debido a que somos capaces de trazar separado nucleoproteína y proteínas, ESI revela que la estructura de los focos parecen reorganizar el tiempo. La cantidad relativa de proteína 53BP1 en el enfoque parece aumentar mientras que la cromatina toma una posición más periférica.
Desde focos 53BP1 también aparecen en las células como "focos crípticos" en las células G1 en los sitios de bajo-replicarse sin irradiard ADN 26,27, también se obtuvieron imágenes de los focos. Estos focos crípticos parecen albergar grandes cantidades de proteína en relación con los focos inducidos por la radiación y muestran una estructura regular interesante de la cromatina.
Por lo tanto, la visualización de reparación del ADN constituyentes focos utilizando el método miniSOG ayuda a identificar regiones de daño del ADN y para mapear la distribución de la proteína de reparación etiquetada con relación a la cromatina.
Figura 1. Visión general de las estructuras que se pueden observar en una imagen ESI Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(A) Imagen ESI de fibroblastos embrionarios de ratón. Crestas de la cromatina (amarillo) están rodeadas de nucleoplasma (cian) llenando el interchromatin space. El núcleo está rodeado por la heterocromatina periférica y chromocenters (inferior izquierda) que son interrumpidos por complejos de poro nuclear (cian). El nucléolo puede ser claramente separado por su color. Esto es debido al hecho de que la cantidad de proteína en relación con ácidos nucleicos es mayor en la estructura nucleolar de lo que es en la cromatina. Fuera del núcleo, las mitocondrias y ribosomas (ricos en ácido nucleico) pueden ser fácilmente identificados.
(B) Imagen de un núcleo y los centrosomas (véanse las flechas), que puede ser visto como partículas huecas ricos en proteínas en la parte superior izquierda de la imagen.
Sección (C) de la Cruz a través de una placa de metafase. Los cromosomas en metafase altamente condensadas se han alineado en un disco que se extiende desde la esquina superior izquierda a la esquina inferior izquierda. Las altas concentraciones de nitrógeno son visibles en la superficie de algunos cromosomas. Estas áreas son los cinetocoros (ver flechas).
(Fila superior) Las dos primeras imágenes de la fila muestra los mapas de proporción de fósforo y nitrógeno. La última imagen en la fila superior muestra estos mapas elementales superpuestas en el espacio de color RGB. Estructuras amarillas representan las nucleoproteínas, lo que refleja la presencia de ambos fósforo y nitrógeno. (Fila inferior) La primera imagen muestra el mapa de fósforo, lo que revela principalmente la distribución de ácido nucleico en la muestra. La imagen central muestra la distribución de ácido nucleico agotado / estru negativo ctures. Se calculó restando el mapa de fósforo a partir del mapa de nitrógeno. La imagen inferior derecha muestra una combinación del mapa de ácido nucleico y el mapa de proteínas en el espacio de color sustractivo. Esta composición de color se debe utilizar para ayudar en la identificación de las estructuras individuales y clasificarlos como nucleoproteína o no nucleoproteína. La información cuantitativa sobre el fósforo y el nitrógeno abundancia debe ser recogida visualmente del fósforo y nitrógeno neta neta mapas en escala de grises o de materiales compuestos generados mediante el uso de colores aditivos, tales como en la fila superior. 
Figura 2. Creación de un multi-color de la imagen ESI 
Figura 3. Láser micro irradiación de células U2OS expresan establemente MDC1-miniSOG-mCherry. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(II) La zona, destacado por un cuadrado verde en Ic se magnifica y se muestra en el modo de transmisión normal (IIa) y ESI (IIb). IIc muestra una superposición de la imagen de ESI con la señal de la pista daños. La señal de la pista daños se obtuvo por umbralización la imagen superior.
(III) Los ejemplos de la estructura de micro lásercromatina -irradiated y cromatina fuera del área láser dañado.
Figura 4. láser micro irradiación de las células que expresan establemente 53BP1-miniSOG-mCherry. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Columna de la izquierda: (A) Fluorescencia, (B) y TEM convencional (C) ESI imagen de la misma micro láser núcleo irradiados.
Columna derecha: (D) TEM convencional, (E) y ESI (F) Superposición de la imagen con la señal de ESI miniSOG que fue segmentado por umbralización de (D) (véase la etapa 6.10)
Figura 5. línea celular U2OS expresan establemente Rad52-miniSOG-mCherry y dañado por láser micro-irradiación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(A) Superposición de una imagen de fluorescencia de una imagen TEM bajo aumento que muestra un láser microirradiated U2OS núcleo con una pista de daños en la parte inferior izquierda con.
(B) Imagen de microscopía de fluorescencia confocal Representante de un micro láser irradiado núcleo teñido con Hoechst (azul) que expresa Rad52-miniSOG-mCherry que muestra el patrón característico de pequeños focos a lo largo de la pista daños (señal roja).
(C) TEM convencional, (D) ESI,
Imagen (G) ESI de otro núcleo U2OS que expresan establemente Rad52-miniSOG-mCherry que muestra una pista de daño inducido por láser en el contexto de todo el núcleo.
Figura 6. U2OS células que expresan establemente 53BP1-miniSOG-mCherry irradiados con 2 Gy y se fijaron después de 30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(I) a) imagen de fluorescencia que muestra la 53BP1 focos inducida por irradiación gamma. b) Transmitida imagen luz después de la fotopolimerización. c) Overlay de la fluorescencia con la imagen de luz transmitida. d) Imagen TEM baja magnificación (la franja negro es una barra de rejilla TEM). e) Superposición de la imagen fluorescente de la imagen de baja TEM ampliación con.
Enfoque (II) Daños marcado con un asterisco en la imagen de luz transmitida registrado en TEM normal y en modo ESI. a) Zero-pérdida, b) ESI, c) El fósforo, d) La proteína e) Superposición de ESI y la señal segmentada de la imagen de la pérdida de cero.
Enfoque (III) Daños marcado con una cruz en la imagen de fluorescencia registrada en TEM normal y en modo ESI. a) Zero-pérdida, b) ESI, c) El fósforo, d) La proteína e) Superposición de ESI y la señal segmentada de la imagen de la pérdida de cero.
Figura 7. Cambios en la estructura focos entre focos después de diferentes tiempos de irradiación. < / strong> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Células U2OS 53BP1 miniSOG mCherry expuestos a 6 Gy de radiación gamma fijo después de 3h (1A-E, FJ) y 6h (2A-E, FJ) respectivamente. 3 muestra un núcleo no irradiado U2OS 53BP1 miniSOG mCherry mostrando un foco críptica (AE). ESI imágenes se presentan en el orden ESI (ácido nucleico y proteína), ácido nucleico (solo), proteínas (solo), ESI (ácido nucleico y proteína) + segmentados señal miniSOG.
Figura 8. focos de reparación del ADN son todavía visibles en el modo de transmisión convencional cuando se omite posterior fijación con tetróxido de osmio. arge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Sección ultrafina (50 nm) de un núcleo U2OS que muestra dos focos 53BP1 partir de una muestra que no se trató con tetróxido de osmio. (A) En el modo TEM convencional, es posible ver los sitios manchados por el polímero DAB incluso sin mejorar el contraste con el mancha de metal pesado. (B) El contraste de los focos se puede mejorar aún más la toma de imágenes de pérdida de cero (el filtrado de distancia todos los electrones que el origen de los eventos de dispersión plural).
Figura 9. Determinación de los ajustes de la ventana de energía óptimos para el fósforo de mapeo
(A) Elemental mapa proporción registrada para el fósforo con el borde posterior a 155 eV y pre-borde a 120 eV.
contenido "> (B) Relación de Elemental mapa grabó para el fósforo con el borde posterior a 175 eV y pre-borde a 120 eV.(C) Cálculo de mapas de relación de fósforo a partir de una ventana de pre-borde constante a 120 eV pérdida de energía y una ventana de post-canto variable que van desde la pérdida de energía 140-200eV con el fin de determinar la combinación que es mejor en contraste. La diferencia en la intensidad de los más brillantes y dimmestpixel en una línea de exploración que abarca más de la misma fósforo región pobre rico y fósforo muestra valores de contraste más altos (rango dinámico) cuando se eligió una imagen posterior a la orilla de 175 eV pérdida de energía.
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Discussion
ESI puede servir como una herramienta excelente para examinar diferentes estados de la cromatina y ribonucleoproteínas en el núcleo debido a que es capaz de asignar específicamente a las zonas que son ricos en fósforo. Es profundamente aumenta la cantidad de detalle que se puede obtener por un microscopio electrónico y no depende de los métodos de contraste no específicos. Una desventaja de ESI es que requiere secciones más delgadas que TEM convencional al mismo voltaje de aceleración. Esto se puede superar mediante el trabajo con secciones en serie o utilizando métodos tomográficas 28.
Aunque una gran cantidad de información se puede obtener al observar las distribuciones de fósforo y nitrógeno, que es de interés para poder también un mapa de la distribución de ciertas proteínas. Con el método presentado en este trabajo, se demostró que ESI podría combinarse con métodos que se basan en la polimerización específica de sitio de diaminobencidina. Aunque este método no agrega un full nuevo color a ESI, es claramente útil para mapear la distribución de una proteína. Esto se aplica en particular a las proteínas que interactúan con la cromatina. Si un estudio necesita para visualizar más de una población de proteínas, los métodos de marcaje utilizando inmunoelectrónica todavía se puede utilizar cuando se aplica como tinción pre-incrustación, antes de la fotooxidación 9. En comparación con las líneas celulares estables, transfecciones transitorias tienen la desventaja de que los niveles de expresión pueden variar significativamente entre las células y por lo tanto hacer que sea difícil encontrar múltiples células que expresan cantidades similares de la proteína marcada. Por lo tanto, se recomienda la creación de líneas celulares estables. Sin embargo, es posible juzgar la cantidad relativa de expresión de la proteína usando imágenes de fluorescencia y seleccionar células con expresión intermedia después de la transfección transitoria.
Aunque la etiqueta de fusión miniSOG es fluorescente en sí, su rendimiento cuántico es significativamente peor que las buenas prácticas agrarias (0,37 vs. 0,6) 10. Para el purpose de la microscopía correlativa, la adición de una etiqueta de proteína fluorescente adicional como mCherry permite obtener imágenes en las células vivas sin la producción de oxígeno singlete que se produce con miniSOG de excitación. El nivel de expresión de las proteínas etiquetadas-miniSOG, la cantidad de oxígeno en la solución tampón que contiene DAB-, y el pH también puede afectar a la velocidad de la foto-oxidación. A veces puede ser bastante problemático para lograr homogénea fotooxidación en la región de interés, debido a la dependencia de la luz de la reacción de foto-oxidación. Prolongado foto-oxidación puede conducir a la tinción inespecífica y la deposición de un exceso de metal pesado en la muestra, lo cual puede complicar la detección de señales específicas de elementos por ESI. El proceso de foto-oxidación es bastante tiempo para que por lo general sólo una muy pequeña región que contiene unas pocas células en el cubreobjetos normalmente se tiñen.
Hemos demostrado que la combinación de proteínas etiquetadas con miniSOG ESI usando una monocapa de un adherente huHombre línea celular de cáncer. En principio, el método también se puede aplicar a cualquier otra muestra (levaduras, bacterias, tejido, embrión), siempre que es posible expresar la proteína miniSOG-etiquetados a niveles razonables y siempre y translucidez y la difusión de oxígeno y DAB es suficientemente alta para permitir la fotooxidación adecuada y por lo tanto la tinción homogénea. Para las células en suspensión, sería ventajoso para fijar la ubicación de celdas en una hoja de la cubierta utilizando un adhesivo tal como poli-L-lisina. Para muestras más gruesas, los objetivos con una apertura numérica menor lograrán una iluminación más homogénea, pero tardará más en foto-oxidar.
Hemos presentado el uso de las proteínas de fusión etiquetada con miniSOG tan cerca del protocolo original publicado por Shu et al 10 como sea posible -. Incluyendo el uso de tetróxido de osmio. No se pudo observar que, aparte de preferencialmente depositar sobre DAB-polímeros y membranas, tetróxido de osmio muestra cierta reactividad ydeposición sobre la mayor parte del material biológico en la muestra (10 Figura 3). El tetróxido de osmio tiene un borde elemental a 45 eV. Esta señal y sus plasmones se pueden superponer en el espectro de la pérdida de energía de electrones como el espesor de los aumentos de muestra y los electrones individuales se someten a múltiples eventos de pérdida de energía durante el paso a través de la muestra. Esto puede limitar la calidad de los mapas elementales de fósforo si altos OsO4 concentraciones se utilizan en la preparación de muestras. Las concentraciones que hemos utilizado aquí, que son significativamente más bajos que lo que se utilizó anteriormente 10, permitieron la generación de buenos mapas de fósforo calidad. En un experimento utilizando miniSOG proteínas etiquetadas con mayores exigencias que OsO4 concentraciones, la mejor concentración que todavía permite la creación de mapas buena fósforo tendrá que ser determinado empíricamente.
Hemos encontrado que el polímero de DAB que se forma en los focos de reparación del ADN es sufficiently densa para ser visto en el modo TEM convencional (o en el modo de pérdida de cero, incluso con mejor contraste), incluso cuando se omite post-fijación con tetróxido de osmio (ver Figura 8). La segmentación de las señales que fueron registrados de esta manera era tan robusto como el uso de las muestras que fueron tratados con osmio. Dependiendo de la proteína nuclear que tiene que ser visualizada, el tamaño de las estructuras se forma y la necesidad de visualizar los sistemas de membrana, podría no ser necesario el uso de tetróxido de osmio y su omisión eliminará el potencial de enmascarar la firma elemental de fósforo.
En comparación con otras publicaciones utilizando ESI 18,29,30 hemos utilizado diferentes configuraciones para los pre y post-borde imágenes con el fin de generar mapas de proporción elementales con la menor cantidad de ruido. Hemos determinado empíricamente los ajustes presentados en el manuscrito (véase la figura 9). Los ajustes seleccionados en los bordes deben conducir a corregir elemapas mentales a menos que las ventanas de recogida se solapan con otros elementos que están presentes en la muestra. En nuestro caso, el azufre puede ser un elemento de este tipo. Puesto que la concentración de azufre (que se produce en los aminoácidos metionina y cisteína) es muy bajo y contribuye al mapa calculado sólo en una cantidad insignificante, creemos que la mejor relación S / N que se obtuvo usando los ajustes utilizados aquí supera las desventajas que pudiera surgir a partir de las trazas de azufre en la muestra.
Hemos puesto de manifiesto la ultraestructura de DRF a resoluciones nanométricas utilizando las proteínas de reparación del ADN MDC1, 53BP1 y Rad52 combinados con técnicas ESI y TEM. La organización de la cromatina y DSB individuo proteína de reparación de localización se resolvió utilizando este enfoque. Se mostró su localización en dominios ricos en lesiones del ADN siguientes láser ADN micro-irradiación y la tendencia de las proteínas de reparación para rellenar el espacio entre las crestas de la cromatina. En el caso de Rad52, que plays un papel en la recombinación homóloga, la formación de estructuras esféricas nucleares-cuerpo como a lo largo de la pista por láser dañado podría ser observado y esto fue en contraste con las otras dos proteínas ensayadas. Cuando el daño se aplica por irradiación gamma, 53BP1 focos formado alrededor de la cromatina dañada. La composición relativa y la posición de la cromatina y la proteína en los focos parece cambiar con el tiempo. La relación entre estas proteínas y de la cromatina dañada, así como los cambios en la organización de la cromatina y la composición de los cuerpos nucleares puede ser fácilmente obtenida mediante la técnica de ESI mientras que la microscopía de campo claro convencional utilizando uranio y plomo como agentes contrastantes no se puede evaluar directamente estas propiedades. Por lo tanto, esta técnica muestra un alto potencial para el estudio de las relaciones estructura-función, en particular para procesos que actúan sobre el ADN.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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