Introduction
Det vaskulære endotel er ikke kun et barrierelag, der adskiller blod og væv, anses det for et stort endokrine kirtel, der strækker sig over hele vaskulære træ med et overfladeareal på 400 kvadratmeter 1. Den trivsel endotelet er afgørende for vaskulær homeostase. Den dysfunktionelle endotel deltager i forskellige kardiovaskulære lidelser, herunder åreforkalkning, vasculitis og iskæmi / reperfusionsskader osv 2-4. Til dato er de specifikke cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret i dette sygdomsstadie ikke godt forstået på grund af den spredte anatomiske karakter endotel.
Musen er en vigtig model for forskning, fordi genetiske manipulation teknikker er mere udviklet i mus end i nogen anden pattedyrarter. Imidlertid er isolering af primære murine aortaendotelceller betragtes særlig vanskelig, fordi den lille størrelse af aorta gør enzymatic fordøjelse af endotel upraktisk. Nogle rapporterede procedurer til at isolere og oprense EC'er kræver 5-7.
Målet med denne protokol er at bruge en simpel metode til at isolere og udvide endotelceller fra muse aorta uden brug af særligt udstyr. I denne protokol, er det frisk isolerede aorta skæres i små segmenter og podet på en matrix med endotel nedad for at give mulighed for endotel spiring. Efter segmenter er fjernet, er endotelceller ekspanderes i endotel stillede medium og er klar til forsøg efter to eller tre passager. Fordelene ved den beskrevne fremgangsmåde er, at: 1) betydeligt højt antal endotelceller høstes fra en enkelt aorta; 2) cellernes levedygtighed er velbevaret; og 3) ikke er behov for særligt udstyr eller teknik. Det giver et effektivt middel til at identificere specifikke cellulære og molekylære mekanismer i endotelceller patofysiologi. For dem der er interesseret i at studere PRimary dyrkede endotelceller fra enten gen-knock-out-mus, gen knock-i mus, eller en murin sygdomsmodel, denne protokol er meget nyttig og let at praktisere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering af Aorta fra mus
Alle her beskrevne procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Wayne State University.
- Sæt musen ind i induktion kammer anæstesiapparatet. Indstil isofluran flow til 4% sammen med 25% frisk luft og 75% O2. Bedøver musen ved inhalation af isofluran (4% til induktion, ± 1,0% for vedligeholdelse), sammenholdt med 25% frisk luft og 75% O 2 via induktion kammer efterfulgt af en dedikeret næsekegle. BEMÆRK: Anæstesi med isofluran kan leveres i 75% oxygen / 25% luft eller i 100% oxygen.
- Tjek musen hver 5 min, indtil et passende niveau af anæstesi er nået (manglende tilbagetrækning til tå knivspids).
- Tag musen ud af induktion kammeret og fortsætte isofluran inhalering selvom den dedikerede næse kegle, der er forbundet til anæstesiapparatet. Skiftisofluran strømme til 1% for at opretholde anæstesi.
- Mens det er under anæstesi, sætte musen på en operation pad, anbragt på ryggen. Brug laboratorium tape til at fastgøre benene.
- Brug en varmelampe for at holde musen varme. Hold lampen i en passende afstand fra musen, så musen vil ikke over-varme.
- Spray brystet med 70% ethanol.
- Brug dissektion saks til at åbne abdomen fra midterlinjen og eksponere den abdominale aorta. Åbn brysthulen og blotlægge hjertet og lungerne.
- Skær den abdominale aorta i midten med dissektion saks til at frigive blodet.
- Fyld en 1 ml sprøjte (med 25 G nål) med 1 ml PBS indeholdende 1,000 U / ml heparin. Injicer PBS indeholdende 1,000 U / ml heparin til venstre hjertekammer og perfundere aorta. Skub hjertet og lungerne med pincet på de store arterier til højre af musene at eksponere den torakale aorta.
- Hurtigt fjerne thorax aorta ved hjælp mikro-dissection pincet og sætte det i iskoldt 1x PBS (steril), derefter transportere containeren i en laminar luftstrøm hætte.
- Indsæt en 1 ml sprøjte forsynet med 25 G nål ind i den ene ende af aorta, og skyl forsigtigt aorta med iskold PBS for at fjerne blodet.
- Brug mikro-dissektion pincet til at fjerne så meget af den vedlagte fedtvæv og små laterale fartøjer som muligt.
- overdrage aorta til endotel vækstmedium.
- Skær aorta i 1 mm ringe anvendelse af en steril skalpel. Harvest omkring 8 - 10 ring per aorta.
- Åbne hver aortaringen anvendelse af et par mikro-dissektion saks.
2. Frø aorta segmenter på Matrix
- Når den ikke anvendes skal vækstfaktoren-reducerede matrix i -20 ° C for at forhindre størkning. Sætte vækstfaktoren-reducerede matrix i 4 ° C i det mindste natten over for at tillade en fuldstændig optøning.
- Forkøling en 6-brønds plade og pipettespidser til -20 ° C i mindst10 min. Sæt 6-brønds plade på is og pels én brønd i pladen med 1 ml matrix uden at indføre luftbobler. Pladen anbringes i en 37 ° C inkubator i 20 minutter for at tillade matrixen til at størkne.
- Implantere aorta stykker på størknede matrix med sterile mikro-dissektion pincet. Læg stykkerne lumen-side-down på matrixen uden at røre endotel. Place 3 - 4 aorta segmenter tæt på hinanden på matrixen.
- Tilføj lige nok endotelcellevækst medium til at holde segmenter våd (~ 200 uL).
- Inkubér pladen ved 37 ° C under 5% CO2 i 4 til 6 timer. I slutningen af dagen, tilsættes lige nok medium til at dække aortiske segmenter.
- Overhold aorta segment spiring periodisk under en fase-kontrast mikroskop. Kontroller medium niveau og cellevækst hver dag. Tilføj medium hvis det er nødvendigt for at holde aorta segmenter dækket.
- På den 4. dag, forsigtigt fjerne mediet og fjern aorta segmenter from matrixen under anvendelse af en steril nål uden at afbryde de voksende endotelceller.
- Tilsæt 2 ml af nye endotelcellevækst-medium og tillade endotelcellerne fortsat proliferere på matrix for 2 - 3 dage.
3. Indledende Passage af Mouse aortaendothelceller
- Coat en ny T12.5 kolbe med gelatine (0,1%), inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Vask matrix plader omhyggeligt med sterilt 37 ° C PBS.
- Tilsæt 2 ml neutral proteinase (50 U / ml) til matrixen plader og inkuberes ved stuetemperatur på platform rocker og lejlighedsvis omrystning. Kontroller cellerne under et fasekontrastmikroskop for at sikre de fleste celler er fritliggende.
- Der tilsættes 2 ml D-Val at inaktivere neutral proteinase.
- Opsaml supernatanten forsigtigt i et 15 ml centrifugerør. Vask pladen med 2 ml D-Val og indsamle supernatanten.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 900 xg i 5 minutter ved room temperatur.
- Resuspender cellepelleten i 4 ml endotelcellevækst-medium og pladen i T12.5 kolbe overtrukket med gelatine. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 timer.
- Udskift mediet. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2, indtil de er 85% - 90% sammenflydende.
4. Passage af Mouse aortaendothelceller
- Coat to nye T12.5 kolber med gelatine (0,1%), inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Pre-heat Trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,02 EDTA i PBS) og sterilt PBS ved 37 ° C i ca. 15 min.
- Vask cellerne forsigtigt med steril 37 ° C PBS.
- Tilsæt 0,5 ml trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,02 EDTA i PBS) og inkuberes ved 37 ° C i ~ 1 min eller indtil størstedelen af cellerne drejes rundt.
- Tilsæt 2 ml af endotelcellevækst-medium for at stoppe fordøjelsen. Pipetteres cellesuspensionen op og ned inden kolbens flere gange. Brug om nødvendigt en celleskraber til at opsamle cellerne.
- Opsaml cellesuspension i en 15 ml centrifugerør. Centrifuger cellesuspensionen ved 900 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellepelleten i 4 ml endotelcellevækst-medium og plade i 2 T12.5 kolber overtrukket med gelatine. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 timer.
- Udskift mediet. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2, indtil de er 85% - 90% sammenflydende.
- Brug musen aortaendotelceller efter 2 - 3 passager.
5. Karakterisering af muse aortaendotelceller
- Re-plade cellerne.
- Coat en 6-brønds plade med gelatine (0,1%), inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Skyl pladen med PBS.
- Forvarm Trypsin-EDTA og sterilt PBS til 37 ° C i ca. 15 min.
- Vask cellerne med sterile PBS 3 gange. Tilsæt 0,5 ml trypsin / EDTA til cellerne, inkuberes i ~ 1 minut ved 37 ° C or, indtil størstedelen af cellerne drejes rundt.
- Tilsæt 2 ml af endotelcellevækst-medium for at stoppe fordøjelsen. Pipetteres cellesuspensionen op og ned inden kolbens flere gange. Brug om nødvendigt en celle skraber til at indsamle cellerne.
- Opsaml cellesuspension i en 15 ml centrifugerør. Centrifuger cellesuspensionen ved 900 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, re-suspendere cellerne i endotelceller vækstmedium. Frø cellerne i 6-brønds plade overtrukket med gelatine med en densitet på 3 x 10 5 / brønd.
- Inkuber cellerne natten over ved 37 ° C, 5% CO2 for at tillade cellerne at fæstne til kulturen overflade.
- Dil-ac-LDL uptaken og Ulex -lectin binding.
- Opbevar 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'tetramethylindo-carbocyanin perchlorat-mærket acetyleret LDL (Dil-ac-LDL) ved -20 ° C. Før farvning, tø Dil-ac-LDL på is. Bestanden Dil-ac-LDL Solution er 1 mg / ml. Opbevar FITC-mærket Ulex europaeus agglutinin (Ulex -Lectin, 1 ug / ml) ved 4 ° C. Bestanden Ulex -Lectin opløsning er 1 mg / ml. Store Hoechst 33342 ved 4 ° C. Bestanden Hoechst 33342 løsning er 100 ug / ml.
- Tilsæt 10 uL af Dil-ac-LDL stamopløsning til 1 ml dyrkningsmedium at foretage en endelig koncentration på 10 mikrogram / ml.
- Før farvning, fjerne den gamle medium og vask af cellerne i hver brønd med nyt medium.
- Tag den nye medie og tilsæt Dil-ac-LDL farvning medium.
- Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i 1 time.
- Vask cellerne med sterile 1x PBS 3 gange.
- Tilsættes 1 ml 10% formalin til at fastsætte cellerne. Sæt pladen i stuetemperatur i ca. 30 min.
- Vask cellerne med sterile 1x PBS 3 gange. Undgå lys.
- Tilsæt 1 ml sterilt 1x PBS, der indeholder 10 pi Ulex -Lectin.
- Inkuber cellerne ved room tempere i mørke i 1 time.
- Fjern Ulex-lectin ved vask af cellerne med sterile 1x PBS 3 gange.
- Tilføj Hoechst 33342 til en slutkoncentration på 1 ug / ml, inkuberes 10 minutter i mørke.
- Vis fluorescensen af Dil-ac-LDL (rød, excitationsbølgelængde på 576 nm), Ulex -Lectin (grøn, excitationsbølgelængde på 519 nm) og Hoechst (blå, ekscitationsbølgelængde på 361 nm) med en omvendt fluorescerende mikroskop.
- Fluorescent farvning for CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin og Calponin.
- Store FITC-konjugeret anti-muse CD31-antistof, eNOS-antistof, VE-cadherin antistof, FITC-konjugeret anti-kanin IgG ved 4 ° C i mørke. Store VEGFR2 antistof i -20 ° C.
- Vask cellerne med sterile 1x PBS 3 gange.
- Tilsættes 1 ml 10% formalin til at fastsætte cellerne. Sæt pladen i stuetemperatur i ca. 30 min.
- Vask cellerne med sterile 1x PBS 3 gange.
- For at bejdse CD31, tilsættes 1 ml sterilt 1xPBS, der indeholder 10 pi CD31-FITC-antistof. For at plette enten VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin eller calponin, tilsættes 1 ml sterilt 1x PBS, der indeholder 4 pi VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin eller calponin primært antistof, hhv.
- Inkubér cellerne på is i 1 time i mørke.
- Fjern antistoffer ved vask af cellerne med sterile PBS 3 gange.
- Til farvning af VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin eller calponin, tilsættes 1 ml sterilt 1x PBS, der indeholder 10 pi FITC-konjugeret anti-kanin IgG. Inkubér cellerne på is i 1 time i mørke. Fjern IgG ved vask af cellerne med sterile PBS 3 gange.
- Tilføj Hoechst 33342 til en slutkoncentration på 1 ug / ml, inkuberes 10 minutter i mørke.
- Se fluorescensen af CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin, calponin (grøn, excitation bølgelængde på 518-535 nm) og Hoechst (blå, excitation bølgelængde på 361 nm) med et omvendt fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotel Cell Sprouting
Spontan endotelcelle Spirende startet fra en mus aorta segment. Musen aorta segment fik lov til at vokse på en vækstfaktor-reducerede matrix derefter i endotelcellevækst-medium i 4 dage. Den endotelcelle spiring normalt vises i 2 - 4 dage. Mikrofotografier blev taget på dag 4 (figur 1). Som vist i billederne, talrige endotelceller migrerer væk fra segmentet. De nydannede spirer fortsat strække sig fra segmentet og filialen.
Endotelcelle fænotyper
Disse celler demonstrerede tenformede og brosten-lignende udseende efter initial passage (figur 2A). De vedhæftede celler blev mærket med Dil-ac-LDL og Ulex -Lectin i en time. Som vist i figur 2B-2E, de fleste af cellerne var dobbelt-positive for Dil-ac-LDL optagelse (rød) og Ulex -Lectin binding (grøn). I mellemtiden, efter den anden passage, mere end 95% af cellerne var positive for blodplade endotelcelle-adhæsionsmolekyle 1 (CD31, PECAM-1, figur 2F), VEGFR2 (figur 2G), VE-cadherin (fig 2H), eNOS ( Figur 2I), men negative for Calponin (figur 2J), som er en glat muskelcelle markør.
Figur 1. Endotel Cell Sprouting. Mus aortasegment blev podet på vækstfaktor-reducerede matrix og dyrket i endotelcellevækst-medium. Endotelcelle spiring startes så tidligt som på dag 2 (A, bar = 100 um) og øget i følgende 2 - 3 dage (B, C, bar = 100 um). Segmentet blev fjernet på dag 4 (D, bar = 500 um).
Figur 2. endotelcelle fænotyper. De vedhæftede celler vise spindel-formet og brosten-lignende optrædener (A, bar = 100 um), dobbelt-positive fluorescens af Dil-ac-LDL og Ulex -Lectin (BE, bar = 100 um). I mellemtiden blodplade endotelcelle-adhæsionsmolekyle 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadherin eNOS positive i> 95% af cellerne efter den anden passage (FI, bar = 100 um) De fleste af cellerne var negative for Calponin farvning, hvilket er en glat muskelcelle markør (J, bar = 100 um).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser en simpel metode til at isolere og kultur endotel celler fra en mus aorta uden særligt udstyr. Den immunfluorescensfarvning viste, at størstedelen af cellerne var endotelceller efter den anden passage. Det foreslås, at celler ved andet til tredje passage er egnede til in vitro og in vivo forsøg for at studere endotel biologi.
De Hovednotater fra denne protokol
Der er fem kritiske punkter i proceduren. For det første er de vaskulære lumen skylles med PBS indeholdende heparin for at minimere endotelcelleaktivering og koageldannelse. Sekund, tiden mellem hjertestop og udsåning af aortasegment onto matrix er kritisk for endothel levedygtighed. Mens rydde peri-arterielle fedtvæv og bindevæv, undgå at strække aorta og begrænse den tid, der bruges på dette trin for at 10 - 15 min. Tredje, hældLige nok medier til at dække segmenterne efter at de er podet. For meget medier vil forårsage aorta segmenter til at flyde. For det fjerde indeholder dyrkningsmediet en høj koncentration af endotelcellevækst supplement, hvilket gør endotelceller vokser meget hurtigere end ved dyrkning i endotel-vækstmedium-2. Udvæksten af endotelceller vil undertrykke andre celletyper såsom glatmuskelceller og fibroblaster. Femte, timingen for at fjerne aortasegment fra matrix er også kritisk for renheden af endotelceller. Dette trin forhindrer forurening af fibroblaster og glatte muskelceller. Segmentet skal fjernes før udviklingen af røret netværk. Forsinket fjernelse af aorta segment vil medføre kontaminering af andre celletyper, såsom fibroblaster eller glatte muskelceller. Bemærk, at denne fremgangsmåde også anvendes til at studere angiogenese in vitro og dannelsen af kapillær lignende strukturer indikerer angiogenese kapacitet af aorta segment. Baseret på vores eRFARING, hvis segmenterne fjernes efter kapillarrøret-lignende struktur fuldt udvikler, forekomsten af glatte muskelceller kontaminering stiger drastisk. Derfor føler vi, at det bedste tidspunkt til at fjerne segment er, når netværket begynder at være synlige, men ikke er fuldt udviklet. På denne måde kan vi høste så mange endotelceller som muligt og samtidig holde forurening med glatte muskelceller til et minimum.
Begrænsningerne i denne protokol
Der er nogle begrænsninger af de beskrevne fremgangsmåder. Først, er der chancer for forurening af fibroblaster og glatte muskelceller, hvis aorta segmenter ikke fjernes før rør netværk udvikler. De fibroblaster eller glatte muskelceller kan begynde at knytte til matrixen og proliferere 3 til 5 dage efter podning. Derfor altid fjerne aorta segmenter i tide. Som en sekundær forholdsregel, ændrer mediet 2 timer efter re -plating cellerne på en ny kolbe også hjælper med at fjerne eventuel kontaminering af fibroblaster og glatte muskelceller. For det andet er disse celler dyrkes in vitro i 7 - 10 dage efter isolering. Det er muligt, at deres fænotyper kan være forskellige fra frisk isolerede endothelceller. For eksempel, hvis endotelcellerne fra en musemodel af hyperlipidæmi dyrkes i endotelcellevækst-medium uden en høj koncentration af lipider, er de ikke udsat for den hyperlipidæmiske miljø, som de var i dyr. De dyrkede endothelceller kan opføre sig anderledes end frisk isolerede endothelceller 8. Dette problem findes i alle in vitro dyrkede primære celler og cellelinjer. Tilføjelse de patologiske stimuli i kulturmediet for at efterligne in vivo miljøet kan være en opløsning.
Endotelceller Demonstrere Forskellige fænotyper i forskellige Vaskulære Filialer
e_content "> Det vaskulære system er en hierarkisk struktur bestående af arterier, vener og kapillærer. heterogenitet endotelceller, der bor i de specifikke zoner" af vaskulatur spiller en stor rolle i at skabe funktionel diversitet i karsystemet 9,10. selv i et enkelt vaskulære leje, såsom aorta, eksisterer endotel heterogenitet. Laminar blodgennemstrømning med høj forskydningsspænding i den lige del af aorta inducerer endotel nitrogenoxidsyntase og thrombomodulin 11. Derfor, endotelceller, der findes i den lige del af aorta demonstrere antikoagulant, anti-klæbende, og anti-inflammatoriske egenskaber 12,13. i modsætning hertil turbulent blodstrømning på områder, hvor arterier filial eller dreje skarpt (aortabuen) reducerer endotel nitrogenoxidsyntase ekspression og inducerer atherogene gener i endotel celler, dvs. monocytkemotaktisk protein-1 (MCP-1), og blodpladeafledte vækstfaktorer (PDGF'er), Hvilket resulterer i en pro-inflammatorisk og aterosklerotisk endothelial fænotype 6. Hertil kommer, endotelceller i fartøjer hvert organ gennemgår anatomiske og funktionelle adaptive ændringer, der er specifikt for den pågældende orgel funktioner 14,15. Ikke desto mindre er der enighed om, at adskillige celleoverflademarkører, funktionelle gener og celle aktiviteter kan anvendes til at karakterisere endothelceller afstamning. Disse celleoverflademarkører indbefatter Trombocyt endotelcelle-adhæsionsmolekyle (PCAM-1, CD31), von Willebrand faktor (vWF), vaskulær endotel-cadherin (VE-cadherin CD144). De hyppigst anvendte funktionelle gener indbefatter endotel nitrogenoxidsyntase (eNOS) og vaskulær endotelvækstfaktor Receptor (VEGFR). Cellens aktiviteter, der normalt ses i endotelceller afstamning omfatter optagelse af Dil-ad-LDL og lectin, som danner cord-lignende strukturer på matrixen.Betydningen og fremtidige anvendelser af Primary kulturperler Mouse aortaendothelceller
Den her beskrevne fremgangsmåde anvendes til at studere makrovaskulære endothelceller. Betydningen af denne protokol er, at det giver en god mulighed for at studere endotel-specifikke aktiviteter målrettede molekyler og kan gøres på knockout og transgene musemodeller, hvilket gør det meget nyttigt i kardiovaskulær forskning. Evnen til at vokse stort antal mus aortaendotelceller under definerede betingelser gør denne ideelle teknik til bedre at definere de fænotyper og funktioner endotel. Denne teknik forbedrer den praktiske gennemførlighed af afprøvning af potentielle potentiale endotelcelle-baseret behandling i murine modeller, gennem enten intravenøs injektion eller indpodning af endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
