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Biology

L'isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

Published: December 19, 2016 doi: 10.3791/52965
Automatic Translation
1, 2, 1
1Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, 2Third Xiangya Hospital and the Institute of Vascular Disease and Translational Medicine, Central South University

Introduction

L'endothélium vasculaire est non seulement une couche barrière qui sépare le sang et les tissus, on considère une vaste glande endocrine qui étend sur la totalité de l' arbre vasculaire avec une surface spécifique de 400 mètres carrés 1. Le bien-être de l'endothélium est essentiel à l'homéostasie vasculaire. L'endothélium dysfonctionnel participe à divers troubles cardiovasculaires, y compris l' athérosclérose, la vasculite et les blessures d' ischémie / reperfusion, etc. 2-4. À ce jour, les mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques impliqués dans ces paramètres de la maladie ne sont pas bien comprises en raison de la nature anatomique diffuse de l'endothélium.

La souris est un modèle important pour la recherche parce que les techniques de manipulation génétique sont plus développés chez les souris que chez les autres espèces de mammifères. Cependant, l'isolement des cellules endothéliales aortiques murins primaires est considérée comme particulièrement difficile en raison de la petite taille de l'aorte fait enzymatic digestion de l'endothélium impraticable. Certaines procédures pour isoler et purifier CEs nécessitent 5-7 signalé.

L'objectif de ce protocole est d'utiliser une méthode simple pour isoler et développer les cellules endothéliales de l'aorte de la souris sans utiliser aucun équipement spécial. Dans ce protocole, l'aorte fraîchement isolée est coupée en petits segments et ensemencées sur une matrice avec l'endothélium vers le bas pour permettre la germination endothéliale. Après segments sont enlevés, les cellules endothéliales sont développées dans le milieu de l'endothélium favorisée et sont prêts pour des expériences après deux ou trois passages. Les avantages du procédé décrit sont les suivants: 1) des nombres très élevés de cellules endothéliales sont récoltées à partir d'une seule aorte; 2) la viabilité des cellules est bien conservé; et 3) aucun équipement ou d'une technique spéciale est nécessaire. Il fournit un moyen efficace d'identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques dans la physiopathologie des cellules endothéliales. Pour ceux qui sont intéressés à étudier prles cellules endothéliales cultivées imary provenant soit des souris knock-out, le gène souris knock-in, ou un modèle murin de la maladie, ce protocole est très utile et facile à pratiquer.

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Protocol

1. Isolement de l'aorte de souris

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université Wayne State.

  1. Placer la souris dans la chambre d'aspiration de la machine d'anesthésie. Régler le débit de l' isoflurane à 4% en conjonction avec 25% d' air frais et de 75% de O 2. Anesthetize la souris par inhalation d'isoflurane (4% pour l' induction, ± 1,0% pour la maintenance) en conjonction avec 25% d' air frais et de 75% O 2 par chambre d'induction suivie d'un cône de nez dédié. NOTE: L'anesthésie avec de l'isoflurane peut être livré dans 75% d'oxygène / 25% d'air ou 100% d'oxygène.
  2. Vérifiez la souris toutes les 5 min jusqu'à ce que le niveau approprié de l'anesthésie est atteinte (absence de retrait pincement de l'orteil).
  3. Prendre la souris hors de la chambre d'induction et continuer l'isoflurane par inhalation si le cône de nez dédié qui est connecté à la machine d'anesthésie. Mettez leisoflurane écoulement à 1% pour maintenir l'anesthésie.
  4. Alors qu'il est sous anesthésie, mettez la souris sur un bloc de chirurgie, positionné sur son dos. Utilisez du ruban de laboratoire pour sécuriser les membres.
  5. Utilisez une lampe chauffante pour maintenir la chaleur de la souris. Gardez la lampe à une distance appropriée de la souris pour que la souris ne sera pas trop de chaleur.
  6. Vaporiser la poitrine avec 70% d'éthanol.
  7. Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir l'abdomen de la ligne médiane, et d'exposer l'aorte abdominale. Ouvrez la cavité thoracique et d'exposer le cœur et les poumons.
  8. Couper l'aorte abdominale au milieu avec des ciseaux de dissection pour libérer le sang.
  9. Remplir une seringue de 1 ml (avec 25 aiguille G) avec 1 mL de PBS contenant 1 000 U / ml d'héparine. Injecter du PBS contenant 1 000 U / ml d'héparine dans le ventricule gauche et perfuser l'aorte. Poussez le cœur et le poumon avec une pince sur les grandes artères du côté droit de la souris pour exposer l'aorte thoracique.
  10. Retirez rapidement l'aorte thoracique à l'aide de micro-dipinces ssection et le mettre dans la glace froide 1x PBS (stérile), puis transporter le conteneur dans une hotte à flux laminaire.
  11. Insérez une seringue de 1 ml équipé 25 aiguille G dans une extrémité de l'aorte, et rincer doucement l'aorte avec PBS glacé pour enlever le sang.
  12. Utilisez une pince micro-dissection pour enlever autant du tissu adipeux ci-joint et de petits vaisseaux latéraux que possible.
  13. transférer immédiatement l'aorte endothéliales milieu de croissance.
  14. Couper l'aorte en 1 mm anneaux à l'aide d'une lame de scalpel stérile. Récolte environ 8 - 10 anneaux par aorte.
  15. Ouvrez chaque anneau aortique en utilisant une paire de ciseaux micro-dissection.

2. Seed les Segments aortiques sur matrice

  1. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation, maintenir la matrice de facteur réduit la croissance de -20 ° C pour empêcher la solidification. Placer la matrice de facteur de croissance réduite à 4 ° C au moins pendant une nuit pour permettre une décongélation complète.
  2. Prérefroidissement un 6 puits conseils de plaque et de pipettes à -20 ° C pendant au moins10 minutes. Mettez la plaque de 6 puits sur la glace et le manteau d'un puits de la plaque avec 1 ml de matrice sans introduire de bulles d'air. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 min pour permettre à la matrice de se solidifier.
  3. Implanter les morceaux de l'aorte sur la matrice solidifiée en utilisant une pince micro-dissection stériles. Placez les morceaux du côté lumière vers le bas sur la matrice sans toucher l'endothélium. Place 3 - 4 segments aortiques proches les uns des autres sur la matrice.
  4. Ajoutez juste assez milieu de croissance des cellules endothéliales pour maintenir les segments humide (~ 200 pi).
  5. Incuber la plaque à 37 ° C sous 5% de CO 2 pendant 4 à 6 heures. A la fin de la journée, ajoutez juste assez moyen pour couvrir les segments de l'aorte.
  6. Observez le segment aortique germination périodiquement sous un microscope à contraste de phase. Vérifier le niveau moyen et la croissance cellulaire chaque jour. Ajouter moyen si nécessaire pour maintenir les segments aortiques couverts.
  7. Sur le 4 ème jour, retirez délicatement le moyen et retirer les segments de l' aorte felon la matrice à l'aide d'une aiguille stérile sans interrompre les cellules endothéliales en croissance.
  8. Ajouter 2 ml de nouveau milieu de croissance des cellules endothéliales et les cellules endothéliales permettent continuent de proliférer sur la matrice 2 - 3 jours.

3. repiquage initial des cellules endothéliales aortiques Souris

  1. Enduire un nouveau flacon de T12.5 avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  2. Laver les plaques de matrice avec soin stérile 37 ° C PBS.
  3. Ajouter 2 mL de proteinase neutre (50 U / ml) sur les plaques de matrice et incuber à température ambiante sur la plate-forme rocker avec agitation occasionnelle. Vérifiez les cellules sous un microscope à contraste de phase pour vous assurer que la majorité des cellules sont détachés.
  4. Ajouter 2 mL de D-Val pour inactiver la proteinase neutre.
  5. Recueillir le surnageant avec précaution dans un tube de 15 ml centrifugeuse. Laver la plaque avec 2 ml D-Val et recueillir le surnageant.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 xg pendant 5 min à room température.
  7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales et la plaque dans le flacon T12.5 enrobé avec de la gélatine. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 h.
  8. Remplacez le support. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu'à ce qu'elles soient 85% - 90% de confluence.

4. repiquage des cellules endothéliales aortiques Souris

  1. Manteau deux nouvelles fioles de T12.5 avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min. Pré-chauffage de la trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02 EDTA dans du PBS) et du PBS stérile à 37 ° C pendant environ 15 min.
  2. Laver les cellules avec soin stérile 37 ° C PBS.
  3. Ajouter 0,5 ml de Trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02 EDTA dans du PBS) et incuber à 37 ° C pendant environ 1 minute ou jusqu'à ce que la majorité des cellules se retourner.
  4. Ajouter 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales pour arrêter la digestion. Introduire à la pipette la suspension de cellules et vers le bas dans le temps de plusieurs flacons. Si nécessaire, utilisez une cellulegrattoir pour recueillir les cellules.
  5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales et de la plaque dans des ballons de 2 T12.5 revêtues de gélatine. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 h.
  7. Remplacez le support. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu'à ce qu'elles soient 85% - 90% de confluence.
  8. Utiliser les cellules endothéliales aortiques de souris après 2 - 3 passages.

5. Caractérisation des cellules endothéliales aortiques de souris

  1. Re-plaque les cellules.
    1. Enduire une plaque à 6 puits avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min. Rincer la plaque avec du PBS.
    2. Préchauffer la trypsine-EDTA et du PBS stérile à 37 ° C pendant environ 15 min.
    3. Laver les cellules avec du PBS stérile 3 fois. Ajouter 0,5 ml de solution de trypsine / EDTA pour les cellules, incuber pendant environ 1 min à 37 ° C or jusqu'à ce que la majorité des cellules se retourner.
    4. Ajouter 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales pour arrêter la digestion. Introduire à la pipette la suspension de cellules et vers le bas dans le temps de plusieurs flacons. Si nécessaire, utiliser un grattoir cellulaire pour recueillir les cellules.
    5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 g pendant 5 min à température ambiante.
    6. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance des cellules endothéliales. Ensemencer les cellules en plaque de 6 puits revêtus avec de la gélatine à la densité de 3 x 10 5 / puits.
    7. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2 pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de culture.
  2. Dil-ac-LDL uptaken et Ulex -lectin liaison.
    1. Stocker le 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate marqué LDL acétylé (Dil-ac-LDL) à -20 ° C. Avant la coloration, dégeler Dil-ac-LDL sur la glace. La solu Stock Dil-ac-LDLtion est de 1 mg / ml. Stocker le europaeus agglutinine marqué FITC Ulex (Ulex -Lectin, 1 pg / ml) à 4 ° C. La solution stock Ulex -Lectin est de 1 mg / mL. Magasin Hoechst 33342 à 4 ° C. La 33342 solution mère Hoechst est de 100 pg / mL.
    2. Ajouter 10 ul d'Dil-ac-LDL solution mère à 1 ml de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 10 pg / ml.
    3. Avant coloration, retirez l'ancien milieu et laver les cellules dans chaque puits par un nouveau milieu.
    4. Retirez le nouveau moyen et ajouter le milieu de coloration Dil-ac-LDL.
    5. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 1 h.
    6. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
    7. Ajouter 1 ml de formol à 10% pour fixer les cellules. Mettre la plaque dans la température ambiante pendant environ 30 min.
    8. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois. Évitez la lumière.
    9. Ajouter 1 mL stérile 1x PBS qui contient 10 pi de Ulex -Lectin.
    10. Incuber les cellules à chambre tempérare dans l'obscurité pendant 1 h.
    11. Retirer la Ulex lectine-en lavant les cellules avec du PBS stérile 1x 3 fois.
    12. Ajouter de Hoechst 33342 à une concentration finale de 1 pg / ml, incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité.
    13. Voir la fluorescence de Dil-ac-LDL (rouge, excitation longueur d'onde de 576 nm), Ulex -Lectin (vert, excitation longueur d'onde de 519 nm) et Hoechst (bleu, excitation longueur d'onde de 361 nm) avec un microscope à fluorescence inversé.
  3. coloration fluorescente pour CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine et calponine.
    1. Magasin de l'anticorps conjugué au FITC anti-souris CD31, un anticorps eNOS, la VE-cadhérine anticorps, conjugué à FITC IgG anti-lapin à 4 ° C dans l'obscurité. Magasin VEGFR2 anticorps -20 ° C.
    2. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
    3. Ajouter 1 ml de formol à 10% pour fixer les cellules. Mettre la plaque dans la température ambiante pendant environ 30 min.
    4. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
    5. Pour colorer CD31, ajouter 1 ml de 1x stérilePBS contenant 10 pi d'anticorps CD31-FITC. Pour colorer soit VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine ou calponin, ajouter 1 ml de solution stérile 1x PBS contenant 4 pi de VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine ou calponin anticorps primaire, respectivement.
    6. Incuber les cellules sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité.
    7. Retirer les anticorps par lavage des cellules avec du PBS stérile 3 fois.
    8. Pour la coloration de VEGFR2 eNOS, la VE-cadhérine ou calponin, ajouter 1 ml de solution stérile PBS 1x contenant 10 ul de FITC conjugué IgG anti-lapin. Incuber les cellules sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité. Éliminer les IgG en lavant les cellules avec du PBS stérile 3 fois.
    9. Ajouter de Hoechst 33342 à une concentration finale de 1 pg / ml, incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité.
    10. Voir la fluorescence de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine, calponin (vert, excitation longueur d'onde de 518-535 nm) et Hoechst (bleu, excitation longueur d'onde de 361 nm) avec un microscope à fluorescence inversé.

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Representative Results

Cellules endothéliales Germination

cellules endothéliales spontanée germination a commencé à partir d'un segment d'aorte de souris. Le segment d'aorte de souris a été autorisée à se développer sur une matrice de facteurs de croissance, puis réduit dans un milieu de croissance des cellules endothéliales pendant 4 jours. La germination des cellules endothéliales apparaît généralement dans 2 - 4 jours. Photomicrographies ont été prises le jour 4 (Figure 1). Comme le montrent les images, de nombreuses cellules endothéliales migrent loin du segment. Les germes nouvellement formés continuent d'étendre à partir du segment et de la branche.

Phénotypes cellulaires endothéliales

Ces cellules ont montré les apparences fusiforme et pavées comme après le passage initial (figure 2A). Les cellules fixées ont été marquées avec Dil-ac-LDL et Ulex -Lectin pendant une heure. Comme le montrent les figures 2B-2F, la plupart des cellules étaient double positif pour Dil-ac-LDL absorption (rouge) et Ulex -Lectin liaison (vert). Pendant ce temps, après le deuxième passage, plus de 95% des cellules étaient positives pour plaquettes molécule d'adhésion des cellules endotheliales 1 (CD31, PECAM-1, la figure 2F), le VEGFR2 (figure 2G), VE-cadhérine (figure 2H), eNOS ( la figure 2I) , mais négatifs pour calponine (figure 2J) qui est un marqueur des cellules musculaires lisses.

Figure 1
Figure 1. cellules endothéliales Germination. Souris segment aortique a été ensemencée sur une matrice de facteur de croissance réduite et mis en culture dans un milieu de croissance des cellules endothéliales. Cellules endothéliales germination a commencé dès le jour 2 (A, bar = 100 um) et augmenté dans les 2 suivants - 3 jours (B, C, bar = 100 um). Le segment a été enlevé le jour 4 (D, bar = 500 um).

ent "> Figure 2
Figure 2. endothéliales de phénotypes cellulaires. Les cellules attachées affichent des apparitions de la broche en forme et pavées comme (A, bar = 100 um), la fluorescence double positive de Dil-ac-LDL et Ulex -Lectin (BE, bar = 100 um). Pendant ce temps, plaquettes molécule d'adhésion des cellules endothéliales 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadhérine, eNOS étaient positifs dans> 95% des cellules après le deuxième passage (FI, bar = 100 um) La plupart des cellules étaient négatives pour calponine coloration, qui est un marqueur de cellules musculaires lisses (J, bar = 100 um).

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Discussion

Cette étude démontre une méthode simple pour isoler et cultiver des cellules endothéliales d'une aorte de souris sans aucun équipement spécial. La coloration par immunofluorescence a indiqué que la majorité des cellules sont des cellules endothéliales après le second passage. Il est suggéré que les cellules au deuxième à la troisième passage sont adaptés pour in vitro et in vivo des expériences pour étudier la biologie endothéliale.

Les billets clés du protocole actuel

Il y a cinq points critiques dans la procédure. Tout d'abord, la lumière vasculaire est rincée avec du PBS contenant de l'héparine pour réduire au minimum l'activation des cellules endotheliales et la formation du caillot. D'autre part, le temps entre l'arrêt cardiaque et l'ensemencement du segment aortique sur une matrice est essentielle à la viabilité endothélium. Bien que la compensation du tissu adipeux péri-artérielle et du tissu conjonctif, éviter d'étirer l'aorte et de limiter le temps consacré à cette étape à 10 - 15 min. Troisièmement, versezjuste assez médias pour couvrir les segments après qu'ils sont ensemencées. Trop médias causeront les segments aortiques de flotter. En quatrième lieu, le milieu de culture contient une concentration élevée de supplément de croissance cellulaire endothélial, ce qui rend les cellules endothéliales se développent beaucoup plus rapidement que lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu-2 de croissance endothéliale. L'excroissance des cellules endothéliales supprimera d'autres types cellulaires telles que les cellules et les fibroblastes musculaires lisses. Cinquièmement, le moment de retirer le segment aortique de la matrice est également essentielle à la pureté des cellules endothéliales. Cette étape évite la contamination par les fibroblastes et les cellules musculaires lisses. Le segment doit être retiré avant le développement du réseau de tube. élimination retardée du segment aortique va entraîner la contamination des autres types de cellules telles que les fibroblastes ou les cellules musculaires lisses. S'il vous plaît noter que cette approche est également utilisée pour étudier l' angiogenèse in vitro et la formation de capillaires comme des structures indique la capacité de l' angiogenèse du segment de l' aorte. Sur la base de notre experience, si les segments sont éliminés après que la structure de type capillaire se développe complètement, la fréquence des cellules musculaires lisses contamination augmente de façon spectaculaire. Par conséquent, nous pensons que le meilleur point de temps pour supprimer le segment est lorsque le réseau commence à être visible, mais est pas complètement développé. De cette façon, nous sommes capables de récolter autant de cellules endothéliales que possible tout en conservant la contamination par des cellules musculaires lisses au minimum.

Les limites du présent Protocole

Il y a quelques limitations des méthodes décrites. Tout d'abord, il existe des risques de contamination par des fibroblastes et des cellules musculaires lisses de l'aorte si les segments ne sont pas éliminés avant les réseaux de tubes se développent. Les fibroblastes ou de cellules musculaires lisses peuvent commencer à se lier à la matrice et proliférer 3 à 5 jours après l'ensemencement. Par conséquent, toujours retirer les segments aortiques en temps opportun. Par précaution secondaire, changer le milieu 2 heures après re -plating les cellules sur un nouveau flacon permet également d'éliminer la contamination possible des fibroblastes et des cellules musculaires lisses. D' autre part, ces cellules sont cultivées in vitro pendant 7 - 10 jours après l' isolement. Il est possible que leurs phénotypes peuvent être différentes des cellules endothéliales fraîchement isolées. Par exemple, si les cellules endotheliales à partir d'un modèle de souris de l'hyperlipidémie sont cultivées dans un milieu de croissance des cellules endothéliales sans une concentration élevée de lipides, ils ne sont pas exposés à l'environnement hyperlipidémie comme ils l'étaient chez les animaux. Les cellules endothéliales en culture peuvent se comporter différemment à partir de cellules endothéliales fraîchement isolées 8. Ce problème existe dans toutes les cellules primaires cultivées in vitro et des lignées cellulaires. L' ajout des stimuli pathologiques dans le milieu de culture pour mimer l'environnement in vivo peut être une solution.

Cellules endothéliales Démontrer différents phénotypes en Branches vasculaires Différentes

e_content "> Le système vasculaire est une structure hiérarchique composée des artères, des veines et des capillaires. L'hétérogénéité des cellules endothéliales qui se trouvent dans les« zones »spécifiques de vascularisation joue un rôle important dans la création de la diversité fonctionnelle dans le 9,10 du système vasculaire. Même dans un seul lit vasculaire, comme l'aorte, l' hétérogénéité endothéliale existe. flux sanguin laminaire avec forte contrainte de cisaillement dans la partie droite de l'aorte induit synthase endothéliale de l' oxyde nitrique et thrombomoduline 11 par conséquent, les cellules endothéliales. qui réside dans la partie droite l'aorte démontrent anti-coagulant, anti-adhésif, et les propriétés anti-inflammatoires 12,13. en revanche, le flux sanguin turbulent dans les zones où la branche d'artères ou tourner nettement (arc aortique) réduit endothéliale expression de la synthase d'oxyde nitrique et induit des gènes athérogènes dans endothéliale les cellules, à savoir, la protéine-1 chimiotactique monocytaire facteurs de croissance dérivés de plaquettes (MCP-1) et (PDGF), Ce qui entraîne un phénotype endothélial pro-inflammatoire et 6 athéroscléreuse. En outre, les cellules endothéliales des vaisseaux de chaque organe subissent des changements adaptatifs anatomiques et fonctionnels qui sont spécifiques aux fonctions de cet organe 14,15. Néanmoins, il existe un consensus selon lequel plusieurs marqueurs de surface cellulaire, des gènes fonctionnels et des activités cellulaires peuvent être utilisés pour caractériser la lignée des cellules endothéliales. Ces marqueurs de surface cellulaire endothéliale comprennent Platelet molécule d'adhésion cellulaire (PCAM-1, CD31), le facteur de von Willebrand (vWF), Vascular Endothelial-cadhérine (VE-cadhérine, CD144). Les gènes fonctionnels les plus fréquemment utilisés comprennent synthase endothéliale de l'oxyde nitrique (eNOS) et Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR). Les activités cellulaires qui sont habituellement vus dans la lignée des cellules endothéliales comprennent l'absorption de Dil-ad-LDL et de liaison lectine, qui forme des structures de type cordon sur la matrice.

L'importance et applications futures de PriCellules mary Cultured Souris endothéliales aortiques

La méthode décrite ici est utilisée pour étudier les cellules endothéliales macrovasculaires. L'importance de ce protocole est qu'il offre une excellente occasion d'étudier les activités spécifiques endothéliales de molécules ciblées et peut être fait en KO et modèles de souris transgéniques, ce qui rend très utile dans la recherche cardiovasculaire. La capacité de croître un nombre élevé de cellules endotheliales aortiques de souris dans des conditions définies rend cette technique idéale pour mieux définir les phénotypes et les fonctions de l'endothélium. Cette technique permet d'améliorer l'aspect pratique de tester le potentiel futur de la thérapie à base de cellules endothéliales dans des modèles murins, soit par injection intraveineuse ou la prise de greffe des cellules endothéliales.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4- or 6-week-old mice Jackson Laboratory #000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) Gibco #10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin Sigma Aldrich H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix BD Biosciences 356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) Life Technologies L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) Sigma L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody BD Biosciences 553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody Cell Signaling 9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase Abcam ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin Abcam 33168
Anti-mouse calponin Abcam 700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG Sigma F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle Fisher Scientific 50-900-04222
100 mm Peri dishes Fisher Scientific 07-202-516
Six-well cell culture plates Fisher Scientific 08-772-1B
T12.5 culture flask Fisher Scientific 50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane Webster Veterianary Supply 07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie cellulaire numéro 118 la culture primaire souris Aorte l'attachement du segment les cellules endothéliales germination endothéliale
L'isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris
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Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K.… More

Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (118), e52965, doi:10.3791/52965 (2016).

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