Introduction
Сосудистый эндотелий является не только барьерный слой , который отделяет кровь и ткани, считается обширную эндокринную железу , которая простирается по всей сосудистой сети с площадью поверхности 400 квадратных метров 1. Благополучие эндотелия имеет важное значение для сосудистого гомеостаза. Дисфункциональной эндотелий участвует в различных сердечно - сосудистых заболеваний, в том числе атеросклероз, васкулит и ишемия / реперфузии травм и т.д. 2-4. На сегодняшний день конкретные клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в этих условиях болезни недостаточно хорошо изучены в связи с рассеянным анатомического характера эндотелий.
Мышь является важной моделью для исследования, поскольку генетические методы манипуляции более развиты, чем у мышей в любых других видов млекопитающих. Тем не менее, выделение первичных мышиных эндотелиальных клетках аорты считается особенно трудным, потому что малый размер аорты составляет enzymatIC переваривание эндотелий непрактичным. Некоторые из них сообщили процедуры для выделения и очистки КЭ требуют 5-7.
Целью этого протокола является использование простой метод, чтобы изолировать и расширить эндотелиальные клетки из аорты мыши без использования какого-либо специального оборудования. В этом протоколе, свежеизолированные аорту разрезают на небольшие сегменты и высевали на матрицу с эндотелием, обращенной вниз, чтобы позволить эндотелиальной всходов. После того, как сегменты будут удалены, эндотелиальные клетки разлагаются в эндотелий благоприятствования среде и готовы к экспериментам после двух или трех проходов. Преимущества описанного способа является то, что: 1) значительно большое число эндотелиальных клеток собирают из одной аорты; 2) жизнеспособность клеток хорошо сохраняется; и 3) никакого специального оборудования или техника не требуется. Это обеспечивает эффективное средство идентификации специфических клеточных и молекулярных механизмов в клеточной патофизиологии эндотелиальной. Для тех, кто заинтересован в изучении прimary культивируемые эндотелиальные клетки либо из генов мышей нокаут, ген нокаут у мышей, или мышиной модели заболевания, этот протокол является очень полезным и легко практиковать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение аорте мышей
Все процедуры, описанные здесь, были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитета Wayne State University по.
- Поместите мышь в индукционную камеру анестезии машины. Установите поток изофлуран до 4% в сочетании с 25% свежего воздуха и 75% O 2. Обезболить мышь при вдыхании изофлуран (4% для индукции, ± 1,0% для технического обслуживания) в сочетании с 25% свежего воздуха и 75% O 2 с помощью индукции камеры с последующим выделенным носовом обтекателе. Примечание: Анестезия с изофлуран может быть доставлен в 75% кислорода / 25% воздуха или в 100% кислорода.
- Проверьте мышью каждые 5 мин, пока соответствующий уровень анестезии не достигается (отсутствие вывода до пят крайнем случае).
- Возьмите мышь из индукции камеры и продолжают изофлуран ингаляции при том, что выделенный носовой конус, который подключен к анестезии машины. Переключитеизофлуран поток до 1% для поддержания анестезии.
- В то время как под наркозом, поместите курсор на операцию на площадку, расположенную на его спине. С помощью лабораторной ленты для фиксации конечностей.
- Используйте нагревательную лампу, чтобы сохранить тепло мыши. Держите лампу в подходящем расстоянии от мыши так, что мышь не будет чрезмерной жары.
- Спрей груди с 70% -ным этанолом.
- Используйте рассечение ножницами, чтобы открыть живот от средней линии, и подвергать брюшной аорты. Откройте грудной полости и обнажить сердце и легкие.
- Обрежьте брюшной аорты в середине с рассечение ножницами, чтобы выпустить кровь.
- Заполните 1 мл шприц (с 25 G иглой) с 1 мл PBS, содержащего 1000 Ед / мл гепарина. Вводят ПБС, содержащего 1000 ед / мл гепарина в левый желудочек и заливать аорту. Нажмите на сердце и легкие с щипцами на больших артерий к правой стороне мышей, чтобы обнажить грудную аорту.
- Быстрое удаление грудного отдела аорты с помощью микро-диssection пинцетом и поместить его в ледяной 1X PBS (стерильный), а затем транспортировать контейнер в ламинарного потока воздуха капотом.
- Вставьте шприц емкостью 1 мл, снабженный иглой 25 G в один конец аорты, и осторожно промывать аорту охлажденным льдом PBS, чтобы удалить кровь.
- Использование микро-рассечение пинцет, чтобы удалить как можно больше приложенном жировой ткани и небольшие боковые сосуды, как это возможно.
- Немедленно передать аорту в эндотелиальные среду для роста.
- Вырезать аорту в кольцах 1 мм с использованием стерильного лезвие скальпеля. Урожай около 8 - 10 колец в аорте.
- Откройте каждую аортального кольцо с помощью пары микро-рассечение ножницами.
2. Семя аортального Сегменты на матрице
- Когда устройство не используется, держите фактор восстановленное матрицу роста в -20 ° C, чтобы предотвратить затвердевание. Поместите фактор восстановленное матрицу роста в 4 ° С, по крайней мере в течение ночи, чтобы обеспечить полную оттепели.
- Предварительно охлаждать 6-луночного планшета, и советы пипеткой до -20 ° С в течение по крайней мере,10 минут. Помещенный 6-луночный планшет на льду и пальто одну лунку планшета с 1 мл матрицы без введения каких-либо воздушных пузырьков. Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 20 мин, чтобы позволить матрицу затвердеть.
- Имплантировать аортального частей на затвердевшей матрице с использованием стерильных микро-рассечение пинцет. Поместите части просвете стороной вниз на матрице, не касаясь эндотелий. 3 место - 4 аортальных сегментов близко друг к другу на матрице.
- Добавьте достаточно просто среду роста эндотелиальных клеток, чтобы держать сегменты мокрой (~ 200 мкл).
- Инкубируйте планшет при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 в течение от 4 до 6 ч. В конце концов, добавить достаточно просто среду, чтобы покрыть аортальных сегментов.
- Обратите внимание на аорте сегмент всходов периодически под фазово-контрастным микроскопом. Проверьте средний уровень и рост клеток каждый день. Добавьте среды, если это необходимо, чтобы держать сегменты аортального охвачены.
- На 4 - й день, аккуратно удалите среду и удалить аортального сегменты пПЗУ матрицу с помощью стерильной иглой, не прерывая растущих эндотелиальных клеток.
- Добавляют 2 мл новой среды для роста эндотелиальных клеток и позволяют эндотелиальные клетки продолжают пролиферировать на матрице в течение 2 - 3 дней.
3. Исходное Пассирование клеток мыши аортального эндотелиальных
- Шерсть новый T12.5 колбу с желатином (0,1%), инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
- Тщательно мойте матричные пластины со стерильным 37 ° C PBS.
- Добавляют 2 мл нейтрального протеиназы (50 ед / мл) с матричными пластин и инкубировать при комнатной температуре на платформе-качалке с периодическим встряхиванием. Проверьте клетки под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток отрываются.
- Добавляют 2 мл D-Val, чтобы инактивировать нейтральной протеиназы.
- Собирают супернатант осторожно в 15 мл центрифужную пробирку. Промыть пластины с 2 мл D-Val и собирают супернатант.
- Центрифуга клеточной суспензии при 900 мкг в течение 5 мин при РооТемпература м.
- Повторное приостановить осадок клеток в 4 мл среды эндотелиального роста клеток и пластины в колбе T12.5, покрытой желатином. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 2 ч.
- Замените среду. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 , пока они не 85% - 90% сплошности.
4. пассирования Клетки мыши эндотелия аорты
- Покрыть два новых T12.5 колб с желатином (0,1%), инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Предварительно подогревают трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина, 0,02 ЭДТА в PBS) и стерильный PBS при 37 ° С в течение приблизительно 15 мин.
- тщательно Вымойте клетки со стерильным 37 ° C PBS.
- Добавьте 0,5 мл трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина, 0,02 ЭДТА в PBS) и инкубируют при температуре 37 ° С в течение ~ 1 мин или пока большинство клеток оборачиваться.
- Добавляют 2 мл среды для роста клеток эндотелия, чтобы остановить пищеварение. Пипетировать клеточной суспензии вверх и вниз в колбу несколько раз. При необходимости, используйте ячейкускребок для сбора клеток.
- Собирают суспензию клеток в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга клеточной суспензии при 900 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Повторное приостановить осадок клеток в 4 мл среды эндотелиального роста клеток и пластины в 2-х T12.5 колбах, покрытых желатином. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 2 ч.
- Замените среду. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 , пока они не 85% - 90% сплошности.
- С помощью мыши эндотелиальных клеток аорты через 2 - 3 проходов.
5. Характеристика клеток мыши аортального эндотелиальных
- Повторная пластина клеток.
- Покройте 6-луночный планшет с желатином (0,1%), инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Промыть пластины с PBS.
- Предварительно нагреть трипсин-ЭДТА и стерильный PBS до 37 ° С в течение приблизительно 15 мин.
- Вымойте клетки стерильной PBS 3 раза. Добавить 0,5 мл трипсин / ЭДТА к клеткам, инкубировать в течение ~ 1 мин при 37 ° С ог до большинства клеток оборачиваться.
- Добавляют 2 мл среды для роста клеток эндотелия, чтобы остановить пищеварение. Пипетировать клеточной суспензии вверх и вниз в колбу несколько раз. При необходимости использовать сотовый скребок для сбора клеток.
- Собирают суспензию клеток в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга клеточной суспензии при 900 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалите супернатант, вновь приостановить клеток в среде для роста клеток эндотелия. Семенной клеток в 6-луночный планшет , покрытый желатином при плотности 3 × 10 5 / лунку.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2 , чтобы позволить клеткам прикрепиться к поверхности культурального.
- Дил-ас-ЛПНП uptaken и Улекс -lectin связывания.
- Хранить 1,1'-диоктадециламин-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-карбоцианиновых перхлорат-меченых ацетилированный ЛНП (разб-AC-ЛПНП) при -20 ° С. Перед окрашиванием, оттаивать Dil-AC-ЛПНП на льду. Запас Дил-ас-ЛПНП Солуции составляет 1 мг / мл. Хранить FITC-меченного Улекс еигораеиз агглютинин (Улекс -Lectin, 1 мкг / мл) при 4 ° С. Исходный раствор Улекс -Lectin составляет 1 мг / мл. Магазин компании Hoechst 33342 при температуре 4 ° С. 33342 раствор акций Hoechst составляет 100 мкг / мл.
- Добавьте 10 мкл Гомотетия-AC-ЛПНП маточного раствора до 1 мл культуральной среды, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкг / мл.
- Перед окрашиванием удалите старую среду и промыть клетки в каждую лунку с новой средой.
- Удалите новую среду и добавьте окрашивающий среду Дил-ас-ЛПНП.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 1 ч.
- Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза.
- Добавляют 1 мл 10% -ного формалина, чтобы зафиксировать клетки. Поместите пластину в комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин.
- Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза. Избегайте света.
- Добавляют 1 мл стерильного 1x PBS, содержащий 10 мкл Улекс -Lectin.
- Инкубируйте клетки при комнатной temperatuповторно в темноте в течение 1 часа.
- Удалите Улекс-Лектиновая путем промывки клеток стерильной 1X PBS 3 раза.
- Добавить Hoechst 33342 до конечной концентрации 1 мкг / мл, инкубируют 10 мин в темноте.
- Просмотр флуоресценции Дил-Ac-ЛПНП (красный, длина волны возбуждения 576 нм), Улекс -Lectin (зеленый, длина волны возбуждения 519 нм) и Hoechst (синий, длина волны возбуждения 361 нм) с перевернутой флуоресцентного микроскопа.
- Флуоресцентные окрашивание для CD31, VEGFR2, Енос, VE-кадгерина и Calponin.
- Магазин ФИТЦ-конъюгированное антитело против мышиных CD31 антитела, антитела Енос, VE-кадгерин антитела, FITC-конъюгированного антитела против кроличьего IgG при 4 ° С в темноте. Хранить VEGFR2 антитела в -20 ° C.
- Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза.
- Добавляют 1 мл 10% -ного формалина, чтобы зафиксировать клетки. Поместите пластину в комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин.
- Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза.
- Окрасить CD31, добавьте 1 мл стерильного 1xPBS, который содержит 10 мкл CD31-FITC антителом. Для того, чтобы окрасить либо VEGFR2, Енос, VE-кадгерин или calponin, добавьте 1 мл стерильного 1x PBS, содержащего 4 мкл VEGFR2, Енос, VE-кадгерин или calponin первичным антителом, соответственно.
- Инкубируйте клетки на льду в течение 1 ч в темноте.
- Удалить антитела путем промывки клеток стерильной PBS, 3 раза.
- Для окрашивания VEGFR2, Енос, VE-кадгерин или calponin, добавьте 1 мл стерильного 1x PBS, содержащего 10 мкл FITC-конъюгированным анти-IgG кролика. Инкубируйте клетки на льду в течение 1 ч в темноте. Удалите IgG путем промывки клеток стерильной PBS, 3 раза.
- Добавить Hoechst 33342 до конечной концентрации 1 мкг / мл, инкубируют 10 мин в темноте.
- Просмотр флуоресценции CD31, VEGFR2, Енос, VE-кадгерин, calponin (зеленый, длина волны возбуждения 518-535 нм) и Hoechst (синий, длина волны возбуждения 361 нм) с перевернутой флуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эндотелиальные клетки Проращивание
Спонтанное эндотелиальные клетки всходов начинается с сегмента мыши аорты. Сегмент мыши аорту позволяли расти на фактор-редуцированной матрицы роста затем в среде роста эндотелиальных клеток в течение 4-х дней. Ячейка прорастание эндотелиальной обычно появляется в течение 2 - 4 дней. Микрофотографии были взяты на 4 -й день (рисунок 1). Как показано на фотографии, многочисленные эндотелиальные клетки мигрируют от сегмента. Вновь сформированные побеги продолжают проходить от сегмента и ветви.
Эндотелиальные фенотипы клеток
Эти клетки продемонстрировали веретенообразных и булыжником подобные выступления после первого прохода (рис 2А). Прикрепленные клетки метили Dil-Ac-ЛПНП и Улекс -Lectin в течение одного часа. Как показано на фигурах 2В-2Е, большинство клеток были дважды положительными для Дил-AC-ЛПНП Поглощение (красный) и Улекс -Lectin связывания (зеленый). В то же время, после того, как второй проход, более чем 95% клеток были положительными для тромбоцитов молекулы адгезии эндотелиальных клеток 1 (CD31, РЕСАМ-1, рис 2F), VEGFR2 (рис 2G), VE-кадгерин (рис 2H), Enos ( Рисунок 2I) , но негативной для Calponin (рис 2J) , которая является гладкой мышечной клетки маркером.
Рисунок 1. эндотелиальные клетки Проращивание. Мышь аортальный сегмент высевали фактор-редуцированной матрицы роста и культивировали в среде для роста эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки всходов началось уже на 2 -й день (А, бар = 100 мкм) и увеличение в последующие 2 - 3 дней (B, C, бар = 100 мкм). Сегмент был удален на 4 -й день (D, бар = 500 мкм).
Рисунок 2. эндотелиальные клетки фенотипы. Прикрепленные клетки дисплей веретенообразные и булыжником подобные выступления (А, бар = 100 мкм), дважды положительная флуоресценция Дил-Ac-ЛПНП и Улекс -Lectin (BE, бар = 100 мкм). В то же время, тромбоцитов молекула адгезии эндотелиальных клеток 1 (CD31, РЕСАМ-1), VEGFR2, VE-кадгерин, Енос были положительными в> 95% клеток после второго прохода (FI, бар = 100 мкм) Большинство клеток были отрицательными для Calponin окрашивания, которая является гладкой мышечной клетки маркер (J, бар = 100 мкм).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование демонстрирует простой метод, чтобы изолировать и культуры эндотелиальных клеток из аорты мыши без какого-либо специального оборудования. Иммунофлюоресценции окрашивание показало, что большинство клеток были эндотелиальные клетки после второго прохода. Предполагается , что клетки в секунду до третьего прохода пригодны для в пробирке и в естественных условиях экспериментов по изучению эндотелиальной биологии.
Ключевые Записки из настоящего Протокола
Есть пять критических точек в порядке. Во-первых, просвет сосуда промывают PBS, содержащим гепарин, чтобы свести к минимуму активацию эндотелиальных клеток и образование тромбов. Во-вторых, время между остановкой сердца и обсеменения аортального сегмента на матрице имеет решающее значение для жизнеспособности эндотелия. При расчистке пери-артериальной жировой ткани и соединительной ткани, избежать растяжения аорты и ограничить время, проведенное на этом этапе до 10 - 15 мин. В-третьих, влитьпросто достаточно средств массовой информации, чтобы покрыть сегменты после того, как они высевают. Слишком много средств массовой информации приведет к аортальный сегменты плавать. В-четвертых, культуральная среда содержит высокую концентрацию добавки роста эндотелиальных клеток, что делает эндотелиальные клетки растут значительно быстрее, чем при культивировании в среде роста эндотелиальных-2. Разрастание эндотелиальных клеток подавляет другие типы клеток, такие как клетки гладких мышц и фибробластов. В-пятых, выбор времени, чтобы удалить сегмент аорте из матрицы также имеет важное значение для чистоты эндотелиальных клеток. Этот шаг предотвращает загрязнение фибробластами и клетками гладкой мускулатуры. Сегмент должен быть удален перед развитием сети труб. Задержка удаления аортального сегмента приведет к загрязнению других типов клеток, таких как фибробласты и клетки гладкой мускулатуры. Обратите внимание , что этот подход также используется для изучения ангиогенеза в пробирке и образованием капиллярных структур , как показывает ангиогенез емкость сегмента аорты. Основываясь на нашем еXperience, если отрезки будут удалены после того, как капиллярная структура, как в полной мере развивается, заболеваемость гладкомышечных клеток увеличивается загрязнения резко. Таким образом, мы считаем, что лучший момент времени, чтобы удалить сегмент, когда сеть начинает быть виден, но не полностью развита. Таким образом, мы можем собрать как можно больше эндотелиальные клетки, как это возможно, сохраняя при контаминации клетками гладких мышц к минимуму.
Ограничения для настоящего Протокола
Есть некоторые ограничения описанных способов. Во-первых, есть вероятность загрязнения фибробластов и клеток гладкой мускулатуры, если аортальный сегменты не удалены перед трубные сети развиваться. Фибробласты или гладкие мышечные клетки могут начать прикрепить к матрице и пролиферируют от 3 до 5 дней после посева. Поэтому, всегда удалить аортального сегменты своевременно. В качестве вторичной меры предосторожности, изменяя среду 2 часа после повторного -plating клетки на новую колбу также помогает устранить возможные загрязнения фибробластов и клеток гладкой мускулатуры. Во- вторых, эти клетки культивировали в пробирке в течение 7 - 10 дней после изоляции. Вполне возможно, что их фенотипы могут отличаться от свежеизолированных эндотелиальных клеток. Например, если эндотелиальные клетки из мышиной модели гиперлипидемии культивировали в среде для роста клеток эндотелия без высокой концентрации липидов, они не подвержены гиперлипидемией среде, как они были в животных. Культивируемые эндотелиальные клетки могут вести себя по- разному от свежеизолированных эндотелиальных клеток 8. Эта проблема существует во всех культивируемых ин витро первичных клеток и клеточных линий. Добавление патологических раздражителей в культуральную среду для имитации окружающей среды в естественных условиях может быть решением.
Эндотелиальные клетки демонстрируют различные фенотипы в различных Сосудистые Филиалы
e_content "> Сосудистая система представляет собой иерархическую структуру , состоящую из артерий, вен и капилляров. Неоднородность эндотелиальных клеток , которые находятся в определенных« зон »в сосудистую сеть играет большую роль при создании функционального разнообразия в сосудистой системе 9,10. Даже в одном сосудистом ложе, такие как аорта, эндотелиальной гетерогенность существует. ламинарный поток крови с высоким напряжением сдвига в прямой части аорты индуцирует эндотелиальной синтазы окиси азота и тромбомодулин 11. Следовательно, эндотелиальные клетки , которая находится в прямой части аорта демонстрируют антикоагулянт, анти-клей и противовоспалительными свойствами 12,13. В противоположность этому , турбулентный поток крови в тех районах , где артерии ветви или резко повернуть (дуги аорты) уменьшает экспрессию эндотелиальной синтазы окиси азота и индуцирует атерогенных гены в эндотелиальной клетки, т.е. хемотаксиса моноцитов белок-1 (МСР-1), и факторы роста тромбоцитов (PDGFs), В результате чего про-воспалительных и атеросклеротических эндотелиальной фенотипа 6. Кроме того, эндотелиальные клетки в сосудах каждого органа претерпевают анатомические и функциональные адаптивные изменения , которые являются специфическими для функций этого органа 14,15. Тем не менее, существует мнение, что некоторые клеточные поверхностные маркеры, функциональные гены и деятельность клеток могут быть использованы для характеристики эндотелиальных клеток происхождение. Эти маркеры клеточной поверхности включают молекулу эндотелиальных тромбоцитов клеточной адгезии (PCAM-1, CD31), фактор фон Виллебранда (VWF), сосудистый эндотелиальный-кадгерин (VE-кадгерин, CD144). Наиболее часто используемые функциональные гены включают эндотелиальной синтазы окиси азота (Енос) и сосудистый эндотелиальный фактор роста рецепторов (VEGFR). Деятельность клеток, которые обычно наблюдаются в клеточной линии эндотелия включают поглощение Дил-ад-ЛПНП и лектин, который образует шнур-подобных структур на матрице.Значение и перспективы применения Priмэри Выращенный Mouse аортального эндотелиальные клетки
Описанный здесь метод используется для изучения макрососудистых эндотелиальных клеток. Значение этого протокола заключается в том, что она предоставляет большие возможности для изучения эндотелиальные конкретной деятельности целевых молекул и может быть сделано в нокаут и трансгенных мышах, что делает его очень полезным при сердечно-сосудистых исследований. Способность расти большое число мышей эндотелиальных клеток аорты при определенных условиях делает эту идеальную технику для более точного определения фенотипа и функции эндотелия. Этот метод улучшает практичность тестирования перспективного потенциала эндотелиальной клеточной терапии в мышиных моделях, либо через внутривенные инъекции или приживления эндотелиальных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
