Introduction
Capire come le cellule acquisiscono proprietà specifiche durante lo sviluppo è fondamentale al fine di apprezzare la complessità di organi e il loro potenziale evoluzione verso condizioni patologiche. Vi è una grande spinta di ricerca per decifrare le reti di regolazione genica che sottostanno specificazione cellulare e la differenziazione da unrevealing profili di espressione genica a livello mondiale, Pol II lo stato di associazione, trascrizione fattore di occupazione su sequenze regolatrici o modificazioni post-traduzionali degli istoni.
Per valutare l'espressione genica in un microarray livello globale e sono utilizzati approcci RNA-Seq. Microarrays consentono di rilevare mRNA abbondanza, mentre RNA-Seq è meglio orientata a informare sui diversi tipi di RNA, tra cui codifica e RNA non codificanti, come microRNA, lncRNAs o snRNAs. Tuttavia, queste tecniche non possono distinguere attivamente-trascritte, steady-state mRNA, attivamente-traducendo mRNA, e mRNA di entrare nel processo di degradazione. Misurazione steady-stmangiato livelli di mRNA è noto per essere una cattiva stima composizione proteoma 1-3. Al contrario, l'identificazione e attivamente tradurre mRNA fornisce un quadro più preciso della produzione di proteine.
Tuttavia, gli studi trascrittomica sono principalmente state condotte a livello intero organismo confrontando il guadagno o la perdita di funzione di un fattore specifico di wild-type condizioni 4-7 o sul tessuto sezionato, rendendo profili di espressione genica di difficile interpretazione. I recenti progressi nella strumenti di targeting cellulari, purificazione per affinità e miglioramenti della sensibilità consentono ora di effettuare il genoma a livello di analisi su piccole popolazioni di cellule o cellule anche singoli in un organismo vivente.
In Drosophila, grandi collezioni di linee transgeniche permettono specifica temporale e spaziale di mira diversi tessuti e sottopopolazioni di cellule attraverso il sistema GAL4 / UAS 8-10 cedendo quantificazione più accurata dei meccanismi molecolari necessari per la funzione delle cellule.
11. Questo metodo basato su gradiente di saccarosio centrifugazione permette la selezione della frazione polysome e determinazione di mRNA tradotto genoma-larga se analizzati con microarray o sequenziamento. Polysome isolamento può essere accoppiato con nucleasi digestione per identificare impronte ribosomiale corrispondenti ai frammenti di RNA protetti dai ribosomi durante il processo di traduzione 12. Footprinting ribosomiale aumenta la precisione di quantificazione della traduzione RNA e risoluzione RNA-livello di sequenza e posizionamento ribosoma, consente di misurare la frequenza di traduzione. Tuttavia, fino ad oggi non è stato applicato a isolamento specifico a cellule translatomes, principalmente a causa della forte diminuzione della resa RNA ottenuto alla fine del processo footprinting ribosoma. Dato che la selezione del formato di RNA può generare potenziale falso-positives provenienti da diversi RNP che potrebbe anche essere proteggono l'RNA in un modo simile, sono necessari ulteriori sviluppi per migliorare ribosomiale footprinting e adattarlo agli approcci specifici delle cellule.
Uno di tali metodi, chiamato Traducendo ribosoma Affinity Purification (TRAP) è stata descritta nel 2008 da Heiman et al. e applicato per isolare il translatome da un sottoinsieme di neuroni nei topi. Con epitopi codifica una proteina ribosomiale in modo cellula-tipo specifico, polisomi possono essere selettivamente purificati senza il passaggio laboriosa di dissociazione delle cellule e smistamento. In questo caso, i 60S proteina ribosomale L10A sulla superficie del ribosoma stata contrassegnate con eGFP 13. Dal 2008, diversi studi hanno usato questo metodo in specie diverse, dai topi 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 e zebrafish Arabidopsis thaliana 24. Il metodo TRAP è stato adattato al modello Drosophila e usato per purify mRNA da cellule neuronali 25 e astrociti 26 specifiche cellule-tipo. Il sistema GAL4 / UAS binario versatile è stato utilizzato per esprimere la GFP-tagged RpL10A in maniera tessuto-specifica. Capi di mosche adulti sono stati sezionati per effettuare la selezione polysome da cellule neuronali (bersaglio da pan-neurali conducente Elav-GAL4) e RNA isolati sono stati sequenziati. Il gran numero di geni up-regolati corrispondeva a quelle note per essere espressa nel sistema nervoso, indicando che l'approccio ha buona specificità e ci spinge per adattarlo alle popolazioni cellulari rare (meno dell'1% delle cellule) presente in embrioni di Drosophila .
Nell'ambito del modello Drosophila, la fase embrionale è un modello di scelta per lo studio dei processi di sviluppo, come gli attori molecolari e dei movimenti morfogenetici sono evolutivamente conservati. Gli approcci trascrittomica solo specifici tessuti condotti finora in questo modello sono stati condotti utilizzando cellule o nucleare cosìrting e sono stati in grado di studiare steady-state trascrittoma 27-31 solo, creando la necessità di metodi dedicati al tessuto / cellule-specifiche translatome profiling in volo embrione. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicata agli embrioni di Drosophila. Con questo metodo, impegnati in-traduzione dell'mRNA in una popolazione di cellule molto ristretto di circa 100 cellule muscolari per embrione è stato isolato con successo con alta qualità e specificità. Il GAL4 / sistema UAS binario è usato per guidare l'espressione di RpL10A GFP-tagged in sottopopolazione di muscoli senza alcuna tossicità, non fenotipi apparenti o ritardo dello sviluppo, come illustrato in precedenza 25. Embrioni di Drosophila in possesso di 30 muscoli per hemisegment che daranno luogo alla muscolatura della larva. Usando una regione regolatrice scoperto in prossimità del gene dell'identità cava, 6 dei 30 muscoli multi-nucleate sono presi di mira. In questo saggio, ribosomi sono immobilizzati sulla mRNA utilizzando l'allungamento traduzioneinibitori cicloesimide. Estratti citosolici vengono poi utilizzati per la purificazione di affinità con sfere magnetiche GFP anticorpi rivestite. Qualità di RNA purificato è stato convalidato utilizzando Bioanalyzer. Quantitative PCR di trascrizione inversa (RT-qPCR) è stato utilizzato per determinare la specificità e la sensibilità di isolamento mRNA e ha dimostrato che il nostro protocollo ottimizzato è altamente efficiente.
Protocol
1. Fly Line Generation
- Generare due costrutti differenti. Nel primo costrutto, RpL10A cDNA (ribosomiale proteina subunità L10A) viene clonato a valle di GFP in pUASP-PL-GFP-nter plasmide (versione modificata dal 32). L'uso di un promotore germinale permette un utilizzo più polivalente della linea transgenica.
NOTA: Ottenere il secondo costrutto clonando la sequenza di regolamentazione di guida espressione tessuto-specifica del gene slouch monte di GAL4 (TF) utilizzando pPTGAL4 plasmide. - Iniettare plasmidi separatamente in w 1118 mosche e inserire costrutti in volo genoma mediante inserimento P-elemento (secondo procedura standard) 33.
- Selezionare i trasformanti, al fine di recuperare linee di volo con costrutti su due cromosomi diversi. La linea TRAP finale viene creata combinando queste due linee (croci genetici) al fine di ottenere una linea a doppio transgenici stabile. F0: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively amplificare questa linea e raccogliere gli embrioni desiderato-in scena.
2. embrioni Collection
- Preparare 8 grandi gabbie di popolazione cilindrica contenente circa 40 g di giovani mosche per gabbia (circa 180.000 mosche / gabbia).
- Procedere con i cosiddetti pre-lai che permettono mosche per eliminare gli embrioni in via di sviluppo dalle loro ovidotti. Per questo, gettare le mosche per 1 ora su due piatti 11 centimetri di diametro petri contenenti un miscuglio di agar e succo d'uva solidificato e coprire ⅓ della superficie con appena fatta lievito in pasta. Dopo 3 scambi di uva piastre succo di raccogliere gli embrioni reali su piatti appena fatti simili.
NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda dello sviluppo finestra temporale studiato. - Rimuovere le piastre da gabbie e lasciarli alla stessa temperatura per il tempo necessario per ottenere la corretta fase di sviluppo (ad esempio, 3 ore di ovideposizione + 10 hr di Additionale incubazione dà embrioni da stadio 10-13 ore dopo la deposizione delle uova (AEL)). Risospendere il contenuto di piatto (embrioni, lievito in pasta, mosche morte) con 50 ml di acqua con una spazzola.
- Passare attraverso una serie di setacci (700 micron, 355 micron, 112 micron) per separare embrioni da mosche e le restanti parti del corpo e raccogliere embrioni trattenuta dal setaccio di diametro minore, poi lavare brevemente in acqua deionizzata. Non utilizzare più di 18 piatti per la raccolta in quanto può ostruire i setacci.
- Embrioni Dechorionate in 4,5% di candeggina in acqua deionizzata per 2 minuti e risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata per 30-60 secondi. Incubare gli embrioni in PBS 0,01% Tween 20, 100 mg / ml cicloeximide, per 5-10 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione.
- Embrioni secco su fogli assorbenti cellulosa e trasferirli in provette da microcentrifuga. Pesare i tubi e flash-congelare gli embrioni per immersione in azoto liquido. In questa fase, gli embrioni secchi possono essere conservati per alcuni mesi a -80 ° C.
- Risospendere accuratamente Protein G sfere magnetiche nella bottiglia originale di agitazione.
- Trasferimento 90 ml di perline per un tubo RNasi-free e di raccoglierli in un magnete (30-60 sec). 90 microlitri di perline è necessario eseguire immunoprecipitazione (IP) con 1 ml di lisato contenenti 60-80 mg / mL proteine. Rispettare i rapporti per evitare la saturazione tallone. Utilizzare diversi tubi secondo la quantità di proteine.
- Perline Lavare con 1 × PBS 0,01% di Tween 20 (500 microlitri) e raccogliere perline sul magnete per scartare il surnatante. Aggiungere 30 mg di anticorpo GFP in 350 ml di PBS 0,01% Tween 20 al tallone e incubare con lenta fine oltre fine miscelazione per 30 minuti a RT.
- Raccogliere perle sul magnete (30-60 sec), scartare il surnatante e lavare in 500 ml di tampone di estrazione polysome (Hepes 10 mM, KCl 150 mm, MgCl 2 a 5 mm, DTT 0.5 mm, Triton 1%, cicloesimmide 100 mg / ml , Protease inibitore 1 ×, inibitore della RNasi 100 U).
- Raccogliere perline sul magnete e aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio (BSA 0,1 mg / mL, tRNA di lievito 0,1 mg / mL, glicogeno 0,1 mg / mL di tampone di estrazione polysome).
- Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e ripetere questo passaggio una volta con tampone di bloccaggio fresca.
- Raccogliere perline sul magnete e sciacquare in 500 ml di tampone di estrazione polysome, poi ricordare perline e procedere immediatamente alla fase immunopurificazione (paragrafo 6).
4. Preparazione del lisato
- Prima di iniziare, impostare il programma sul multi-direzionale perline velocità veloce grinder: 2 × 10 sec a 5.000 giri, 15 sec di pausa. Trasferimento degli embrioni secchi (1,5 g) a 15 ml provette prechilled su ghiaccio contenente tampone di estrazione polysome, e omogeneizzare subito. Omogeneizzare 1,5 g di embrioni in 4 ml di tampone di estrazione polysome.
- Diffusione omogeneizzato embrioni in due prechilled 2 mL e macinare il Embryos eseguendo il programma omogeneizzatore. Trasferire il lisato in microprovette prechilled fresche su ghiaccio e preparare un surnatante postnuclear per centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 2.000 g.
- Trasferire il surnatante in una provetta prechilled fresco sul ghiaccio, aggiungere 1/100 volume del campione del 10% Nonidet P-40 per il surnatante (concentrazione finale = 0,1%), e mescolare con cura capovolgendo la provetta.
- Pulse-centrifuga il campione in un minicentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo della provetta, aggiungere 1/9 volume del campione di 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentrazione finale = 30 mM ), mescolare delicatamente invertendo il tubo, e incubare la miscela in ghiaccio per 5 min (mix invertendo più volte durante l'incubazione).
- Preparare il supernatante post-mitocondriale mediante centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 20.000 g. Misurare concentrazione proteica con il metodo Bradford: concentrazione nel lisato deve essere compresa tra 60-80 mg / ml. Take il surnatante in una nuova provetta prechilled fresco e procedere immediatamente alla fase di pre-assorbimento (sezione 5).
5. Pre-assorbimento
- Risospendere accuratamente le sfere magnetiche agitando con attenzione e trasferire 30 ml di perle in una provetta a temperatura ambiente (30 ml di perline / 1 ml di lisato embrionale).
- Raccogliere perle sul magnete, pipetta il surnatante e risospendere le sfere nel buffer di estrazione polysome (500 microlitri). Raccogliere perle sul magnete, aggiungere lisato embrionale, e incubare per 1 ora a 4 ° C su un rotatore.
- Rimuovere perline e tenere surnatante in ghiaccio per il passo immunopurificazione. Prima immunopurificazione, tenere 100 ml di surnatante (ingresso) per confrontare campione di RNA globale con il campione di RNA raccolti dopo immunopurificazione, mediante RT-qPCR per esempio.
6. immunopurificazione
- Aggiungere 1 ml (corrispondente a 60-80 mg / ml di proteine) dilisato pre-assorbito in una provetta RNasi-free contenente 90 ml di perline bloccati accoppiate ad anticorpi GFP. Incubare i campioni a 4 ° C per 2 ore con miscelazione end-over-end dolce in un rotatore tubo. In alternativa, eseguire l'incubazione O / N a 4 ° C.
- Dopo l'incubazione, raccogliere perline sul magnete. Utilizzare un minicentrifuga a girare giù le perline, poi li risospendere in 500 ml di tampone di lavaggio (Hepes 10mm, KCl 350mm, MgCl 2 5mm, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mm cicloesimmide 100 mg / ml, RNasi inibitore 100 U ) e alla loro raccolta sul magnete. Ripetere questa operazione altre due volte.
- Modificare le perle in una nuova provetta RNasi-free prechilled e lavare due volte. Raccogliere perline su un magnete e procedere alla estrazione di RNA con l'aggiunta di 1 ml di Trizol direttamente ai talloni e seguire le istruzioni del produttore.
7. RNA Pulizia e valutazione della qualità
- Utilizzare un kit RNeasy Micro secondo le istruzioni del produttore. Al termine, Elute RNA con (x) ml di acqua RNase-free. Caldo per 2 minuti a 60 ° C, e conservare a scatto congelati campioni a -80 ° C. Controllare RNA qualità utilizzando bioanalizzatore (seguire le istruzioni del produttore).
- Per verificare la specificità del Traped RNA, eseguire trascrizione inversa su 3 ng di RNA purificato (input e IP) secondo le istruzioni del produttore (apice III). Utilizzare il cDNA ottenuto per qPCR utilizzando set di primer gene-specifici.
Representative Results
Il sistema muscolo somatiche embrionali Drosophila è composto da 30 muscoli per hemisegment, e ogni muscolo ha un insieme specifico di proprietà: codice di geni di identità, la posizione, il numero di eventi di fusione, siti di attacco e innervazione. Identificare tradotto mRNA in uno specifico sottoinsieme muscolo fornirà informazioni sulle proteine necessarie per formare queste caratteristiche muscolari specifici. Utilizzando il metodo basato TRAP-RNA da una sottopopolazione di muscoli che esprimono il gene cava di identità è stato purificato (Figura 1A-B). Una delle principali preoccupazioni di questo approccio è la qualità e la specificità del RNA isolato. Il protocollo ottimizzato riportata qui ha permesso il recupero sistematico di RNA di alta qualità valutata con l'analisi Bioanalyzer. Il profilo mostra ottenuti senza degradazione dell'RNA (Figura 1C).
In altri studi sviluppati attorno al metodo TRAP, questioni sono state sollevate sopra la specificità dei dati. Qui improve il metodo per sopprimere sfondo legato al legame del RNA alle perline o tubi non specifici e l'ottimizzazione del tampone di lavaggio. Al fine di valutare il livello di fondo e l'efficienza di isolare le cellule-slouch esprimere, abbiamo condotto studi RT-qPCR su 3 repliche dello stesso stadio embrionale. Piegare-arricchimenti di 4 geni diversi (MEF2, cava, prospero, soxNeuro) sono stati calcolati rispetto a input e normalizzato contro il gene RpL32 (Figura 1D). Questi risultati hanno mostrato l'arricchimento di 2,3 volte di MEF2 gene pan-muscolari e l'arricchimento 5.6 volte del gene slouch. Al contrario, i due geni espressi nel sistema nervoso sono stati confrontati impoverito all'ingresso. Molto simili modificare valori piega sono stati osservati su 3 repliche biologiche, dimostrando che il protocollo è robusto. Con autista Slouch-GAL4 e partendo da 1,5 g, intorno 1,5x10 ^ 6 embrioni sono stati ottenuti che contengono le 100 cellule GFP / embrione (totale di 150 × 10 ^ 6 positivocellule).
Dopo aver eseguito l'esperimento TRAP, la resa è di circa 25-45 ng di RNA specifico a seconda della percentuale di interessi. Questo materiale è sufficiente per eseguire analisi di microarray o RNA-Seq utilizzando un protocollo di amplificazione per costruire una libreria di RNA-Seq. L'efficienza dipende fortemente dalla forza del driver usato per esprimere RpL10A-EGFP.
Figura 1. La qualità e la valutazione specificità del TRAP-RNA isolato da Slouch-GAL4> embrioni UASRpL10A-EGFP.
(AB) immagini confocali di uno stadio embrionale-16 mostra espressione RpL10A-EGFP specificamente nelle cellule muscolari sei Slouch per hemisegment (A). Co-localizzazione di RpL10A-EGFP con il Beta3tubulin generale marcatore muscolare si osserva sulla foto merge (B). (C) Controllo della qualità dei Traped RNA ran su Bioanalyzer mostrando perfetta integrità di rRNA 18S e 28S. Analisi (D) RT-qPCR mostrando elevata specificità degli esperimenti mRNA TRAP-isolato su 3 repliche biologiche di stage-16 embrioni. Piegare variazione è calcolata rispetto all'ingresso e normalizzata contro il gene RpL32. Trascrizioni MEF2 presenti in tutti i lignaggi muscolari sono 2,3 volte arricchita, rispetto all'ingresso, mentre le trascrizioni slouch più ristretti sono-5.6-fold arricchito. Cellule neurali che esprimono prospero e geni soxN sono esaurite 2,2 volte e 5,5 volte, rispettivamente. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo documento descrive un protocollo modificato Translating ribosoma Affinity Purification (soprannominato 'TRAP-rc') dedicato allo studio delle popolazioni di cellule rare in embrioni di Drosophila. Le informazioni sono fornite sui passaggi chiave per il successo l'isolamento di RNA specifico con una resa adatta per microarray o l'analisi di RNA-Seq, cioè 1) la quantità di materiale biologico necessario e procedure ottimizzate per embrione lisi e l'estrazione polysome; 2) perline / anticorpo-to-lisato di copertura del immunoprecipitazione ottimale; 3) passi permettendo la riduzione di fondo tra cui lavaggio composizione del tampone in modo da eseguire esperimenti TRAP-rc con elevata specificità e sensibilità.
Questo protocollo produce dati riproducibili rendendo prontamente applicato ad altri tipi di cellule. Questa tecnica permette di analizzare l'espressione genica differenziale a livello di mRNA e attivamente tradurre e quindi aprire la strada per comprendere l'espressione della proteina in una specifica tipo di cellula ific in un intervallo di tempo specifico. Si noti tuttavia che la proteina abbondanza dipenderà dalla velocità dei processi di traduzione e degradazione. Una limitazione importante del metodo TRAP è la sua incapacità di misurare il contenuto proteico in maniera quantitativa accurata o per rilevare modificazioni post-traduzionali. Migliorare la quantificazione misurando la densità ribosoma lungo il corpo mRNA e, in tal modo, in maniera cella-tipo specifico può fare TRAP combinato con ribosoma footprinting uno strumento molto potente. In un recente lavoro 34, questa combinazione è stata eseguita in embrionali renali 293 cellule umane. Gli autori correvano footprinting nucleasi seguita da purificazione per affinità di una forma biotinilata inducibile di RpL10A utilizzando perline streptavidina. Questa è una prova di principio che è possibile eseguire footprinting ribosoma in un intero organismo mirando nel contempo un tipo specifico di cellule, la limitazione è la quantità di materiale biologico necessario per gli scopi.
"> Esecuzione di esperimenti TRAP in parallelo con analisi trascrittomica globali permetterà di monitorare le proporzioni tra neo-trascritto e actively- tradurre RNA. Questo sarà profondamente informativo dei potenziali meccanismi post-trascrizionali che si svolgono in contesti di sviluppo specifici o popolazioni di cellule specifiche microRNA -da per esempio.In conclusione, TRAP è un metodo molto efficiente, specifico e sensibile per identificare RNA legati ai ribosomi attivamente-traducono in maniera specifica delle cellule. Questo metodo può essere utilizzato in un'ampia varietà di organismi e tipi di tessuto. Il nuovo protocollo TRAP-rc qui descritto è stato ottimizzato per popolazioni cellulari rari (meno dell'1% del numero di cellule totale) e per una quantità di materiale sufficiente per la finale successive analisi a livello dell'intero genoma.
Una possibile limitazione di questo metodo è il requisito di un driver forte da produrre ribosomi targhette in quantità sufficiente di compete con quelli senza tag endogeni nel tipo di cellula bersaglio. In un recente studio 25, autori hanno stimato al 10-30% il rapporto di tag rispetto ribosomi senza tag.
Per superare questo problema crescente-EGFP UAS-RpL10A numero di copie dovrebbe migliorare notevolmente questo equilibrio. In alternativa, aggiungendo al background genetico descritto un transgene UAS-GAL4 amplifica la produzione di proteine GAL4 e, indirettamente, aumentare l'espressione di RpL10A-EGFP. Questo dovrebbe favorire una migliore occupazione dei ribosomi targhetta su mRNA.
Si noti che questo approccio già efficiente può essere reso ancora più potente, adattando metodi complementari per portare un aspetto più quantitativa o per scoprire e svelare i meccanismi molecolari che sono essenziali per il controllo dell'espressione genica.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
| 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
| Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
| Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
| Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
| Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
| Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
| Nuclease free water | Nalgene | ||
| Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
| Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
| Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
| Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
| TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
| MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
| Low binding filter tips | ClearLine | ||
| Rnase free tube 1.5 ml | ClearLine | 390689DD | |
| Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
| Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |
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