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Neuroscience

Sur mesure Microdialyse Probe Conception

Published: July 21, 2015 doi: 10.3791/53048
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

Summary

Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Par conséquent sondes commerciales sont en grande demand.In ce travail un ensemble de sonde est expliqué en détail à construire une concentrique, sonde de microdialyse fiable, sur mesure pour moins de 10 $.

Abstract

Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Par conséquent sondes commerciales sont en grande demande pour surveiller les changements physiologiques, pharmacologiques et pathologiques dans le liquide céphalo-rachidien. Malheureusement, sondes commerciales sont coûteux pour les groupes de recherche dans les institutions publiques. Dans ce travail, un ensemble de sonde est expliqué en détail à construire une concentrique, sonde de microdialyse fiable, sur mesure pour moins de 10 $. La sonde de microdialyse est constitué d'une membrane en polysulfone avec un seuil de coupure moléculaire de 30 kDa. Probe in vitro recouvrements de substances ayant un poids moléculaire différent (dans la gamme de 100-1,600 Da) et différentes propriétés physico-chimiques sont comparées. La sonde donne un recouvrement d'environ 20% in vitro pour le petits composés de glucose, le lactate, l'acétylcholine et de l'ATP. In vitro recouvrements pour neuropeptides avec un poids moléculaire entre 1,000-1,600 Da montant à 2-6%. Ainsi, alors que le poids moléculaire plus élevéhuit des neuropeptides abaissé dans les valeurs de récupération in vitro, la dialyse de composés dans la fourchette basse (jusqu'à 500 Da) de poids moléculaires n'a pas grand impact sur ​​le taux de récupération in vitro dans. Le présent procédé permet l'utilisation d'une membrane de dialyse avec une autre valeur de seuil et le matériau de membrane. Par conséquent, cet ensemble de sonde sur mesure a l'avantage de la souplesse suffisante pour dialyser substances dans une large gamme de poids moléculaire. Ici, on introduit une sonde de microdialyse avec une longueur d'échange de 2 mm, ce qui est applicable pour microdialyse dans les régions du cerveau de souris et de rat. Cependant, les dimensions de la sonde peuvent être facilement adaptés pour les grandes longueurs change pour être utilisé dans de plus grands animaux.

Introduction

Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Au cours des 50 dernières années, la technique de microdialyse minimale invasive a été continuellement amélioré pour devenir une méthode bien établie pour surveiller les concentrations locales de petits composés de poids moléculaire dans l'espace extracellulaire. Presque chaque fluide de tissu interstitiel peut être étudiée chez les animaux se déplacent librement.

Gaddum introduit la technique push-pull dans les années 1960. Il a modifié une approche de Feldberg et al. Dans laquelle tubocurarine a été perfusé à travers une canule qui se termine dans le ventricule latéral et en recueillant l'effluent également via une canule 1. Gaddum développé la technique push-pull dans lequel une canule constituée de deux aiguilles en acier concentriques a été implanté dans des zones distinctes du cerveau et perfusé par une solution tout en enlevant simultanément les neurotransmetteurs libérés par les neurones entourant la pointe 2. Malheureusement, dama de tissusge causé par la canule autour de la pointe a limité l'application de cette méthode. Comme autre avancement de ce procédé, Bito et ses collaborateurs ont introduit une méthode des sacs de dialyse, dans lequel la solution recueillie a été séparée du tissu environnant par une membrane de dialyse. Ils ont implanté un sac de dialyse dans le tissu sous-cutané de cou de chien. Le contenu du sac de dialyse est exempt de protéines et pourrait être analysée plusieurs semaines plus tard pour les ions et les acides aminés 3. L'étape suivante fut l'dialytrode, une sonde de microdialyse primitive, qui à l'origine a été décrit par Delgado en 1972 4. Enfin, Ungerstedt et ses collègues ont amélioré la conception de la sonde de microdialyse de sorte qu'il était plus petit et moins de tissu déplacé 5.

Une sonde de microdialyse concentrique se comporte comme un capillaire sanguin. Le système est continuellement perfusé par une solution présentant la composition ionique du liquide de tissu environnant tout en manquant de l'analyte d'intérêt. The membrane de dialyse est exposé à la solution ou le tissu externe est semi-perméable. Elle permet la diffusion passive de substances dans la sonde le long de leur gradient de concentration 6. La perméabilité dépend de nombreuses variables telles que le poids moléculaire, la forme, la charge et le pH du composé. Il est également limitée en raison des propriétés du matériau de la membrane, la taille des pores de la membrane et le taux 7 couler.

Les figures 1 et 2 montrent une sonde de microdialyse concentrique. Le liquide de perfusion pénètre par une tubulure d'entrée dans le manchon métallique, qui entoure la silice fondue. A l'intérieur du manchon métallique, il ruisselle le long de la silice fondue et le laisse sur sa pointe. Dans l'espace entre la membrane de dialyse et le polytétrafluoroéthylène (PTFE) -tubing (tel que du Téflon) le liquide de perfusion circule alors vers le haut. Ici, la diffusion de substances à partir du tissu se produit qui entourent la membrane. Le dialysat laisse la sonde à travers la PTFE-tubes, qui est reliée à la sortie des tubes et peuvent être collectées.

La technique de microdialyse a plusieurs avantages par rapport aux autres dans des techniques in vivo. La sonde constitue une barrière physique, de sorte que le dialysat contient pas d'enzymes ou de cellules. Par conséquent, il n'y a pas besoin de purification de l'éluat avant l'analyse, et aucune dégradation enzymatique des analytes a lieu. La dégradation par oxydation peut se produire pendant le passage de substances à analyser dans le tube, mais cela peut souvent être évitée en ajoutant un antioxydant (par exemple l'acide ascorbique) pour le perfusat. Sinon, les dommages oxydatifs à neuropeptides, par exemple, a été efficacement réprimée par le remplacement de la tubulure de sortie avec une pointe de recueillir le dialysat 8. Le dialysat peut être étudiée directement avec presque tout type de méthode analytique et des analytes multiples peuvent être collectées simultanément. Ce système peut être utilisé chez les animaux éveillés, et presque toutes les régions du cerveau peut êtreexaminé. En outre, la perfusion de médicaments à travers la sonde est possible (retrodialysis). Cependant, il existe aussi des limitations de la technique de microdialyse. La résolution temporelle peu faible ne fournit pas d'informations en temps réel concernant les changements de neurotransmetteurs. Parce qu'il est une technique invasive, sonde implantation provoque un traumatisme chirurgical et d'anesthésie, ce qui peut affecter les concentrations neurotransmetteurs, est requis lors de cette étape 7,9,10.

La concentration en substance dans le dialysat comprend seulement une petite quantité de la concentration du composé réel dans le fluide extracellulaire. Pour le calcul de la concentration du composé inconnu dans le liquide extracellulaire, par rapport récupération in vitro doit être calculée. Détermination de l 'individu dans recouvrements in vitro pour chaque sonde et chaque composé est nécessaire avant de commencer l'expérience in vivo. A cet effet, la sonde est plongée dans une solution contenant leanalyte d'intérêt alors que le liquide de perfusion est la même solution dépourvue de la substance à analyser d'intérêt. Après détermination des concentrations de composés dans le dialysat, ces données doit être soumis à leur concentration dans le fluide environnant. In vitro déterminations de récupération de plusieurs substances peuvent être mises en œuvre simultanément 9.

Beaucoup de groupes de recherche en neurosciences utilisent la technique de microdialyse pour enquêter sur les neurotransmetteurs et de métabolites dans l'espace extracellulaire des zones distinctes du cerveau. Ainsi, les sondes commerciales sont en grande demande dans l'environnement de la recherche en neurosciences. Un grand avantage de sondes disponibles dans le commerce est la fiabilité de fonctionnement élevée. Le dispositif expérimental pour les sondes commerciales est bien établi et validé pour de nombreux neurotransmetteurs et de métabolites connus. Cependant, alors que l'équipement de microdialyse disponible dans le commerce est coûteux et a moins de souplesse dans l'application 11, dans eest fonctionne un ensemble de sonde de microdialyse est présenté en détail, qui peut être adapté à toute application et peut être fabriqué pour moins de 10 $. Cette sonde sur mesure est une sonde de microdialyse concentrique testé pour les enquêtes dans différentes zones du cerveau 8.

Dans les recouvrements de la sonde in vitro de substances ayant des poids moléculaires différents (gamme de 100-1,600 Da) et avec différentes propriétés physico-chimiques sont comparées. In vitro de détermination de récupération de glucose, le lactate et l'acétylcholine avec un poids moléculaire inférieur à 200 Da, de l'ATP ayant un poids moléculaire d'environ 500 Da et le neuropeptides angiotensine II, substance P et la somatostatine avec un poids moléculaire supérieur à 1000 Da est exécutée.

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Protocol

1. Préparation de tubes en PTFE-

  1. Raccourcir PTFE-tube dans 2,5 cm pièce. Utilisez un papier à l'échelle pour estimer les dimensions physiques. (Voir Figure 3a)
  2. Couper une fin à un angle pour faciliter la connexion d'un tube de sortie. (Voir Figure 3a)
  3. Rugueux PTFE tube par utilisation de papier de verre pour permettre le collage de la colle époxy.

2. Préparation de silice fondue

  1. Raccourcir la silice fondue en 2,25 cm pièce. (Voir Figure 3a)

3. Insertion de la silice fondue dans le tube PTFE-

  1. Insérez une canule 30 G dans la fibre de PTFE creux pour percer à une distance de 1 cm de l'extrémité plat. Plier le PTFE-tube pour simplifier le processus. (Voir Figure 3b)
  2. Insérez la silice fondue dans le PTFE-tubage à l'aide de la canule que l'orientation. (Voir figure 3c)
  3. Retirez délicatement la canule et de sécuriser la silice fondue. (VoirFigure 3d)
  4. La silice fondue est censé projeter 5 mm à l'extrémité plat. (Voir Figure 3e)
  5. Collez la silice fondue en place sur le site de ponction par la colle cyanoacrylate et laisser durcir pendant la nuit. (Voir Figure 3e)

4. Préparer Colle époxy (Glue deuxième volet)

  1. Ajouter 30 parties de durcisseur jaune à 70 parties de la colle époxy noir par l'aide d'une aiguille fine et mélanger délicatement. Il est directement prêt à l'emploi.

5. Application de la membrane (Tous les autres étapes doivent être effectuées sous le microscope et un Livre de l'échelle est utilisée pour estimer Dimensions physiques)

  1. Tirez la membrane de polysulfone attentivement sur la silice fondue, puis tirez la membrane dans le PTFE-tube et régler la membrane à 5,5 mm en utilisant un scalpel. (Voir Figure 3f)
  2. Définir un point de marquage sur la membrane avec une plume fine pour définir la longueur d'échange de 2 mmà partir de l'extrémité de la membrane.
  3. Appliquez une petite quantité de colle époxy pour couvrir la pointe de la membrane à l'aide d'une aiguille fine. (Voir la figure 3g)
  4. Fermez le joint entre la membrane de dialyse et de fibres PTFE par l'aide de la même aiguille fine utilisée dans l'étape 5.3) avec de la colle époxy. (Voir la figure 3g)
  5. Ajouter suffisamment de colle époxy sur la membrane jusqu'au point de marquage pour assurer une longueur d'échange de 2 mm. Laisser durcir pendant la nuit. (Voir la figure 3g) Avant de détermination de la longueur d'échange, la membrane est de 5,5 mm. Après l'application de la colle époxy sur la membrane, seulement 2 mm de la membrane est disponible pour diffusion.

6. Application de la Manche Métal

  1. Couper une aiguille de 25 G morceaux de 1 cm de manches en métal par l'aide d'une pince de pliage.
  2. Tirer le 1 cm manchon métallique (25 G) sur la partie restante de la silice fondue. Le manchon métallique permet par la suite de la connexion de la tubulure d'entrée avec la MICRODIAsonde de lyse. (Voir la figure 3h)
  3. Joint d'étanchéité entre le manchon métallique et PTFE-tube avec le reste de la colle époxy. Laisser durcir pendant au moins 24 heures. (Voir la figure 3i)
  4. L'application de la colle à chaud autour de la bifurcation de la sonde de fixation et de stabilisation supplémentaire.
    NOTE: Le volume interne d'entrée de la sonde est 0,045 pl et le volume interne de sortie est de 2,5 ul. Par conséquent, avec une vitesse de 1 pl d'écoulement / min, il faut environ 2,5 min après le raccordement du tube d'entrée pour commencer la collecte du dialysat. Avec le présent protocole, la procédure d'assemblage de la sonde donne des sondes de microdialyse qui sont 95% fiable.

7. Performance des expériences in vitro récupération

  1. Trempez la sonde avec une coupure de 30 kDa et une longueur d'échange de 2 mm dans une solution de réserve composée de aCSF contenant 1 mM de glucose et 1 mM de lactate et, dans une expérience séparée, dans un CSF contenant 100nM et 100 nM d'ATP acétylcholine.
  2. Perfuser les sondes avec aCSF. Réglez débit à 1 pl / min et réaliser des expériences à température ambiante (22 ° C). Laisser les sondes à équilibrer pendant 1 h dans la solution de réserve, et de recueillir les échantillons toutes les 30 minutes après et conserver à -80 ° C jusqu'à la mesure.
  3. Pour le calcul des recouvrements in vitro, comparer les concentrations d'analytes dans les dialysats avec les concentrations connues en analyte dans la solution de stock. Exprimez les résultats sous forme de pourcentages de concentration de la substance dans le dialysat vs. solution de stock.

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Representative Results

La sonde de microdialyse sur mesure concentrique est constitué d'une membrane en polysulfone avec un seuil de coupure moléculaire de 30 kDa. L'assemblage de sonde est illustrée sur la figure 3.

Il présentait une récupération in vitro pour le petit métabolites énergétiques glucose (180,16 Da) et lactate (112,06 Da) de 19,10 ± 1,2% et 21,2 ± 1,6%, respectivement. Pour l'acétylcholine chargé positivement avec une masse moléculaire de 181,66 Da, il a montré une valeur de récupération vitro dans de 22,6 ± 1,4%. ATP avec un poids moléculaire de 551,62 Da et trois résidus phosphate chargés négativement a donné une récupération in vitro à un degré comparable (22,4 ± 0,7%). In vitro recouvrements de petites molécules sont représentées sur la figure 4A.

Neuropeptides avec un poids moléculaire supérieur à 1000 Da montré plus bas dans les recouvrements in vitro par rapport aux molécules plus petites (<500 Da) (voir Fi figure 4B). Parmi les neuropeptides testés, l'angiotensine II (1,046.18 Da) est le plus petit peptide de 8 acides aminés. Il présentait une récupération in vitro de 6,1 ± 0,3%. Le 11 amino substance de résidus d'acides P (1,347.63 Da) et la somatostatine de 14 acides aminés (1,637.88 Da) ont montré peu près égale aux valeurs de récupération in vitro de 2,2 ± 0,3% et 2,3 ± 0,1%, respectivement. In vitro recouvrements de notre sonde 30 kDa sont comparable à recouvrements in vitro disponibles dans le commerce de sondes de microdialyse (CMA microdialyse, Stockholm, Suède), par exemple. lactate 23% et 13% de glucose (voir note d'application no. 1)

Figure 1
Figure 1: Photographie d'une sonde sur mesure.

8 / 53048fig2.jpg "/>
Figure 2: l'image schématique d'une sonde de microdialyse (Reproduit de Lietsche et al, 2014, avec la permission d'Elsevier.).

Figure 3
Figure 3: l'image schématique d'un ensemble de sonde; étape par intérim pour plus de détails voir le protocole (Reproduit de Lietsche et al., 2014, avec la permission d'Elsevier).

Figure 4
Figure 4: Recouvrements de petites molécules et des neuropeptides (A) dans les recouvrements vitro de glucose, le lactate, l'acétylcholine et de l'ATP.. La solution mère contenait 1 mM de glucose et de lactate et, subsidiairement, 100 nM et 100 nM ATP acétylcholine pour chaque condition expérimentale. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la substance concentration en solution dialysat / de stock. Les valeurs de substances d'essai sont des moyennes ± SD de n = 22 pour le glucose, n = 22 pour le lactate, n = 11 pour n = acétylcholine et de 13 l'ATP. (B) dans des recouvrements in vitro de l'angiotensine II neuropeptides, substance P et la somatostatine. La solution mère contenait 100 nM de l'angiotensine II, substance P et de la somatostatine pour chaque condition expérimentale. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la concentration de la substance en solution dialysat / de stock. Les valeurs des colonnes sont des moyennes ± SD de n = 6 pour chaque sonde.

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Discussion

La figure 3 montre un exemple de montage de la sonde. Dimensions de diamètre intérieur et extérieur correctes doivent être étroitement surveillés pour les tubes (1.6 mm OD; ID 350 um), la silice fondue (OD 105 um; ID 40 um) et la membrane de dialyse (DO 245 um; ID 210 um). Il est également important de maintenir un espace entre la membrane et de la silice fondue (105 pm) et entre la membrane et le tube (105 um), ainsi. Si les valeurs diffèrent, la pression dans la sonde peut augmenter et entraîner des fuites de la membrane.

Ici, nous présentons une sonde de microdialyse avec une longueur d'échange de 2 mm, ce qui est applicable pour microdialyse dans les régions du cerveau de la souris. Cependant, les dimensions peuvent être facilement adaptés pour les grandes longueurs change pour être utilisé dans de plus grands animaux.

Certaines parties de l'assemblage peuvent être remplacés. Par exemple, il est nécessaire d'utiliser des tubes en PTFE. Application de tuyaux en polyéthylène est également possible avec externe et auberge identiqueser cotes de diamètre. Grattage de la tubulure est seulement nécessaire lorsque l'aide d'un tube de PTFE. Le remplacement de la membrane de dialyse est également possible. Pour l'ensemble de sonde présente une membrane de coupure de 30 kDa est utilisé, mais toute autre membrane de dialyse peut être utilisé avec des dimensions identiques. Par conséquent, notre ensemble de sonde sur mesure a l'avantage d'une grande flexibilité pour dialyser substances avec une large gamme de poids moléculaire; plus le poids de coupure moléculaire, plus le poids moléculaire de la substance, qui peut être dialysée. recouvrements in vitro augmentent généralement avec le poids moléculaire de coupure de la membrane de dialyse.

Pour couvrir la pointe de la membrane, de la colle époxy est nécessaire pour fermer le joint entre la membrane de dialyse et PTFE-tubes et pour déterminer la longueur de l'échange. L'application de l'adhésif à base de cyanoacrylate est pas possible dans cette étape, car elle affecte la membrane de dialyse et conduit à des fuites. Un adhésif cyanoacrylate à coller plastic doit être appliquée pour la fixation de la silice fondue avec le tube en place au niveau du site de ponction.

Il convient de noter que cette conception de la sonde n'a pas été testé avec des canules de guidage. Notre laboratoire préfère implanter des sondes à faible diamètre pour des expériences aiguës dans lesquels nous avons 48-72 h de temps expérimentale avant la astrogliose provoque un dysfonctionnement de la sonde. Pour ce type d'expérience, une canule guide ne propose pas un avantage parce que les canules de guidage sont plus grandes et causent plus de dommages aux tissus. En outre, même avec une canule de guidage en place, la sonde doit toujours être insérée dans le tissu cérébral sain, causant des dommages aigus dans le domaine de la dialyse. L'insertion et le retrait répétés de la sonde à travers les canules de guidage provoque des dégâts répétés, une situation qui est évité par une seule fois, à savoir l'insertion aiguë. La barrière hémato-encéphalique a été montré pour être intacts quelques 12 heures après l'implantation. canules guides sont toutefois préférable, lorsque les mesures de série have à faire sur plusieurs jours ou semaines. Enfin, les anesthésiques volatiles doivent être utilisés pour la sonde implantation parce que les médicaments anesthésiques injectables interfèrent avec les expériences ultérieures pendant 1-2 jours.

Dans recouvrements in vitro pour le glucose, le lactate, l'acétylcholine et l'ATP sont environ 20%, soit pour tous testés petites substances de poids moléculaire, la récupération in vitro est à peu près égale. Évidemment, dans la fourchette basse (jusqu'à 500 Da), le poids moléculaire n'a pas grand impact sur ​​le taux de récupération in vitro dans. Le poids moléculaire de coupure de 30 kDa permet également de dialyser neuropeptides. En raison du poids moléculaire plus élevé des neuropeptides, la valeur en vitro de récupération est plus faible. La substance P (1348 Da) et la somatostatine (1638 Da) peuvent être dialysées dans la même mesure in vitro avec des valeurs de récupération dans de 2-3%. Bien que les deux peptides ont un changement de masse d'environ 300 Da, des recouvrements vitro rester le même. Les deux substance P et de la somatostatine sont chargées positivement en solution aqueuse et peuvent présenter des propriétés physico-chimiques similaires. L'angiotensine II ayant une masse moléculaire de 1046 Da révèle une forte in vitro reprise jusqu'à 6%, soit trois fois plus grande que les deux autres neuropeptides. Par conséquent, les masses moléculaires supérieures à 500 Da influent clairement sur ​​la récupération in vitro, même si lorsque les substances sont facturés neutre en solution aqueuse. Dans ce cas, la récupération in vitro est pas affectée par la charge des substances dialysés. Cependant, avec l'utilisation d'autres matériaux de membrane, les recouvrements de composés chargés peuvent être affectés 8.

En conclusion, le montage d'une sonde de microdialyse sur mesure est une alternative acceptable à sondes commerciales. Nos sondes de self-made sont robustes, ont une haute fiabilité et une bonne reproductibilité.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epoxy glue SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany    
Fused silica ID 40 µm OD 105 µm Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany Art. No: 6.040105
Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany REF: F00001593
Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany
TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany Art. No: 969-195.219
Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) pfm medical ag, cologne, Germany Art. No: 07310
Microscope MEIJI Techno  EMZ-8TR
30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula  Sterican® Z B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany REF: 9324500
25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany REF: 9186166
Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG Art. No: 88/36
Hot glue  (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany Art. No: 4007841046910
Sandpaper P60 230 x 280 Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany Catalog Number: 2608605397

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References

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