Skräddarsydda Microdialysis Probe Design

Summary

Mikrodialys är en ofta använd teknik i neurovetenskaplig forskning. Därför kommersiella sonder är i stort demand.In detta arbete en sondenhet förklaras i detalj för att bygga en pålitlig, koncentrisk, skräddarsydda mikrodialyssond för mindre än $ 10.

Abstract

Mikrodialys är en ofta använd teknik i neurovetenskaplig forskning. Därför kommersiella sonder är i stort behov av att övervaka fysiologiska, farmakologiska och sjukliga förändringar i ryggmärgsvätskan. Tyvärr, kommersiella sonder är dyra för forskargrupper i offentliga institutioner. I detta arbete är en sondenhet förklaras i detalj för att bygga en pålitlig, koncentrisk, skräddarsydda mikrodialyssond för mindre än $ 10. Mikrodialyssonden består av en polysulfon-membran med en molekylär avskiljningsgräns vid 30 kDa. Probe in vitro-återvinningar av ämnen med olika molekylvikt (inom intervallet 100-1,600 Da) och olika fysikalisk-kemiska egenskaper jämförs. Sonden ger ett in vitro återhämtning på cirka 20% för små föreningar glukos, laktat, acetylkolin och ATP. In vitro återkrav för neuropeptider med en molekylvikt mellan 1,000-1,600 Da uppgår till 2-6%. Sålunda, även om högre molekyl wåtta av de neuropeptider sänkas i återvinnings vitro värden, dialys av föreningar i det lägre området (upp till 500 Da) av molekylvikter inte har någon stor inverkan på den in vitro-återvinningsgrad. Föreliggande förfarande tillåter användning av ett dialysmembran med andra cut-off-värde och membranmaterialet. Därför har denna skräddarsydd sondenhet fördelen av tillräcklig flexibilitet för att dialysera ämnen i en bred molekylviktsområde. Här presenterar vi en mikrodialyssond med en utbyteslängd av 2 mm, som är tillämplig för mikrodialys i mus och råtta hjärnregioner. Emellertid kan dimensionerna hos sonden enkelt anpassas för större utbyteslängder som skall användas i större djur.

Introduction

Mikrodialys är en ofta använd teknik i neurovetenskaplig forskning. Under de senaste 50 åren, har minimal-invasiva mikrodialysteknik kontinuerligt förbättras för att bli en väletablerad metod för att övervaka lokala koncentrationer av små molekylvikt föreningar i det extracellulära utrymmet. Nästan varje interstitiell vävnadsvätska kan undersökas i fritt rörliga djur.

Gaddum introducerade push-pull-teknik på 1960-talet. Han ändrade en strategi från Feldberg et al., I vilken tubokurarin perfunderades genom en kanyl som slutar i den laterala ventrikeln och samla utflödet också via en kanyl ^1. Gaddum utvecklat tryck-dragteknik i vilken en kanyl bestående av två koncentriska stålnålar implanterades i distinkta områden i hjärnan och perfunderades med en lösning samtidigt avlägsnande av signalsubstanser frisätts från neuronema omger spetsen ^2. Olyckligtvis vävnads damaGE orsakas av kanylen runt spetsen begränsat tillämpningen av denna metod. Som ett ytterligare framsteg för denna metod, Bito och medarbetare infört en dialyspåse metod i vilken den uppsamlade lösningen separerades från den omgivande vävnaden genom ett dialysmembran. De implanterade en dialys sac i den subkutana vävnaden av hund halsar. Innehållet i dialyspåsen är proteinfritt och kunde analyseras många veckor senare för joner och aminosyror ^3. Nästa utveckling var dialytrode, en primitiv mikrodialyssond, som ursprungligen beskrevs av Delgado 1972 ^4. Slutligen, Ungerstedt och kollegor förbättrat utformningen av mikrodialys sond så att det var mindre och fördrivna mindre vävnad ^5.

En koncentrisk mikrodialyssond beter sig på samma sätt som en blod kapillär. Systemet konstant perfunderas av en lösning med den joniska sammansättningen av den omgivande vävnadsvätska samtidigt som saknar analyten av intresse. The dialysmembran utsätts för extern lösning eller vävnad är semipermeabelt. Det tillåter passiv diffusion av ämnen i sonden längs sin koncentrationsgradient ^6. Permeabiliteten beror på många variabler såsom molekylvikt, form, laddning och pH hos föreningen. Den är också begränsad på grund av att egenskaperna hos membranmaterialet, porstorlek av membranet och flödeshastigheten ^7.

Figurerna 1 och 2 visar en koncentrisk mikrodialyssond. Perfusionen fluiden kommer in via en inloppsslangen in i metallhylsan, som omger den smält kiseldioxid. Inuti metallhylsa, strömmar ner längs kvartsglas och lämnar den på sin spets. I utrymmet mellan dialysmembranet och polytetrafluoreten (PTFE) -tubing (såsom teflon) strömmar organgenomströmningsfluiden sedan uppåt. Här, diffusion av ämnen från vävnaden uppstår som omger membranet. Dialysatet lämnar sonden genom PTFE-slang, som är ansluten till utloppsslangen och kan uppsamlas.

Mikrodialystekniken har flera fördelar i förhållande till andra in vivo-tekniker. Sonden utgör en fysisk barriär med resultatet att dialysatet inte innehåller några enzymer eller celler. Därför finns det inget behov av rening av eluatet före analys, och ingen enzymatisk nedbrytning av analyter sker. Oxidativ nedbrytning kan inträffa under passagen av analyter i slangen, men detta kan ofta förhindras genom tillsats av en antioxidant (t ex askorbinsyra) till perfusatet. Alternativt, oxidativ skada på neuropeptider, till exempel, var effektivt undertryckas genom att byta ut utloppsröret med en spets för att samla dialysatet ^8. Dialysatet kan undersökas direkt med nästan alla typer av analysmetod och flera analyter kan hämtas samtidigt. Detta system kan användas i vakna djur, och nästan alla hjärnregioner kan varaundersökas. Dessutom är infusion av läkemedel genom sonden möjligt (retrodialysis). Det finns emellertid också begränsningar av mikrodialystekniken. Den något låg tidsupplösning ger inte realtidsinformation om signalsubstans förändringar. Eftersom det är en invasiv teknik orsakar sond implantation kirurgiskt trauma och anestesi, vilket kan påverka neurotransmittor koncentrationer krävs under detta steg ^7,9,10.

Föreningen koncentrationen i dialysatet innefattar endast en liten mängd av den faktiska föreningen koncentrationen i den extracellulära vätskan. För beräkning av den okända föreningen koncentrationen i den extracellulära vätskan, har relativt in vitro återhämtning ska beräknas. Fastställande av individuella släkting in vitro återvinningar för varje sond och varje förening är nödvändig innan in vivo-experiment. För detta ändamål är sonden doppas i en lösning innehållandeanalyt av intresse medan organgenomströmningsfluiden är samma lösning som saknar analyten av intresse. Efter bestämning av föreningskoncentrationer i dialysatet, dessa data måste hänvisas till deras koncentration i den omgivande vätskan. In vitro utbytesbestämningar av flera ämnen kan genomföras samtidigt ^9.

Många neurovetenskap forskargrupper använder mikrodialys teknik för att undersöka neurotransmittorer och metaboliter i det extracellulära utrymmet distinkta områden i hjärnan. Således kommersiella sonder är mycket efterfrågade i neurovetenskap forskningsmiljö. En stor fördel av kommersiellt tillgängliga prober är den höga funktionssäkerhet. Den experimentella set-up för kommersiella prober är väl etablerad och validerats för många kända neurotransmittorer och metaboliter. Men medan den kommersiellt tillgängliga mikrodialys utrustning är dyr och har mindre flexibilitet i tillämpningen ^11, i thär arbete en mikrodialyssondenhet presenteras i detalj, som kan anpassas till alla program och kan tillverkas för mindre än $ 10. Denna skräddarsydda sonden är en koncentrisk mikrodialyssond testas för undersökningar i olika områden i hjärnan ^8.

In vitro-sond återkrav av ämnen med olika molekylvikt (intervall av 100-1,600 Da) och med olika fysikalisk-kemiska egenskaper jämförs. In vitro återvinning bestämning av glukos, laktat och acetylkolin med en molekylvikt mindre än 200 Da, ATP med en molekylvikt av approximativt 500 Da och den neuropeptider angiotensin II, substans P och somatostatin med en molekylvikt över 1000 Da utförs.

Protocol

1. Förbereda PTFE-slang

1. Korta PTFE-slang i 2,5 cm stycke. Använd en skala papper för att uppskatta fysikaliska dimensioner. (Se figur 3a)
2. Skär ett slut på en vinkel för att underlätta anslutning av utloppsröret. (Se figur 3a)
3. Rugga PTFE-slang med hjälp av sandpapper för att möjliggöra vidhäftning av epoxilim.

2. Förbered smält kiseldioxid

1. Korta smält kiseldioxid till 2,25 cm stycke. (Se figur 3a)

3. Sätta i kvartsglas i PTFE-slang

1. Sätt i en 30 G kanyl in i den ihåliga PTFE-fibern att tränga igenom det på ett avstånd av 1 cm från den platta änden. Böj PTFE-slangen för att förenkla processen. (Se figur 3b)
2. Sätt i kvartsglas i PTFE-slang med hjälp av kanylen som vägledning. (Se figur 3c)
3. Ta försiktigt bort kanylen och säkra kvartsglas. (SeFigur 3d)
4. Den kvartsglas är tänkt att skjuta 5 mm vid den platta änden. (Se figur 3e)
5. Limma smält kiseldioxid på plats vid punktionsstället genom cyanoakrylatlim och låt det härda över natten. (Se figur 3e)

4. Förberedelse epoxilim (tvåkomponent lim)

1. Tillsätt 30 delar av gult härdare till 70 delar av svart epoxilim med hjälp av en fin nål och blanda försiktigt. Det är direkt klar att använda.

5. Tillämpning av membran (alla ytterligare steg måste utföras under mikroskop och en skala papper används för att uppskatta Fysiska mått)

1. Drag polysulfonmembran försiktigt över smält kiseldioxid, sedan dra membranet in i PTFE-slang och justera membranet till 5,5 mm med användning av en skarp skalpell. (Se fig 3f)
2. Ställ en markeringspunkt på membranet med en fin penna för att definiera utbytet längd 2 mmfrån änden av membranet.
3. Applicera en liten mängd epoxi lim för att täcka spetsen av membranet med hjälp av en fin nål. (Se fig 3g)
4. Förslut skarven mellan dialysmembran och PTFE-fiber med hjälp av samma fin nål används i steg 5.3) med epoxilim. (Se fig 3g)
5. Tillsätt tillräckligt epoxilim på membranet till markeringen punkten för att säkerställa utbyte längd av 2 mm. Låt det härda över natten. (Se fig 3g) Före bestämning av utbytet längden är membranet 5,5 mm. Efter applicering av epoxilim på membranet, är endast 2 mm av membranet tillgängligt för diffusion.

6. Tillämpning av metallhylsan

1. Skär en 25 G-nål i 1 cm metallhylsa bitar med hjälp av en böjnings tång.
2. Dra en cm metallhylsa (25 G) på den återstående delen av det sintrade kiselglassubstratet. Metallhylsan möjliggör anslutning av inloppsslangen med microdia senarelys sond. (Se fig 3h)
3. Täta fog mellan metallhylsan och PTFE-slang med den återstående epoxilim. Låt det härda i minst 24 timmar. (Se figur 3i)
4. Tillämpa varmt lim runt förgrening av sonden för ytterligare fixering och stabilisering.
   OBS: Inlopps inre volymen av sonden är 0,045 ^ il och utloppet inre volym är 2,5 | j, l. Därför, med en flödeshastighet av 1 | j, l / minut tar det ca 2,5 minuter efter anslutning av inloppsröret för att påbörja insamlingen av dialysatet. Med det nuvarande protokollet, ger sondmonteringsproceduren mikrodialyssonder som är 95% tillförlitliga.

7. Utförande av in vitro Recovery Experiment

1. Doppa sonden med en cut-off av 30 kDa och ett utbyte längd på 2 mm in i en förrådslösning som består av aCSF innehållande 1 mM glukos och 1 mM laktat och, i ett separat experiment i en CSF-innehållande 100nM ATP och 100 nM acetylkolin.
2. BEGJUTA sonder med aCSF. Ställ flödeshastigheten till en xl / min och utföra experiment vid rumstemperatur (22 ° C). Låt proberna i jämvikt under 1 h i förrådslösningen, och samla proverna var 30 min efteråt och förvara vid -80 ° C fram till mätningen.
3. För beräkning av in vitro-återvinningar, jämföra koncentrationer av analyter i dialysaten med de kända analytkoncentrationer i förrådslösningen. Uttryck resultatet i procent av substanskoncentration i dialys vs stamlösning.

Representative Results

Den koncentriska skräddarsydda mikrodialyssonden består av en polysulfon-membran med en molekylär avskiljningsgräns vid 30 kDa. Sondanordningen visas i figur 3.

Den uppvisade en in vitro-återhämtning för den lilla energimetaboliter glukos (180,16 Da) och laktat (112,06 Da) av 19,10 ± 1,2% och 21,2 ± 1,6%, respektive. För den positivt laddade acetylkolin med en molekylvikt av 181,66 Da, visade det en in vitro-återvinningsvärde av 22,6 ± 1,4%. ATP med en molekylvikt av 551,62 Da och tre negativt laddade fosfatrester gav ett in vitro återhämtning till en jämförbar grad (22,4 ± 0,7%). In vitro återkrav av små molekyler visas i figur 4A.

Neuropeptider med en molekylvikt över 1000 Da uppvisade lägre in vitro-återvinningar jämfört med mindre molekyler (<500 Da) (se Fi gur 4B). Bland de testade neuropeptider, är angiotensin II (1,046.18 Da) den minsta peptiden med 8 aminosyror. Den uppvisade en återhämtning på 6,1 ± 0,3% in vitro. Den 11 aminosyrarest substans P (1,347.63 Da) och 14 aminosyra somatostatin (1,637.88 Da) visade ungefär lika i återvinnings vitro värden av 2,2 ± 0,3% respektive 2,3 ± 0,1%, respektive. In vitro-återvinningar av våra 30 kDa prob är jämförbar med in vitro återvinningar på kommersiellt tillgängliga mikrodialyssonder (CMA Microdialysis, Stockholm, Sverige), t ex. laktat 23% och glukos 13% (se ansökan not no. 1)

Figur 1: Fotografera av en skräddarsydd sond.

8 / 53048fig2.jpg "/>
Figur 2: Schematisk bild av en mikrodialyssond (Utdrag ur Lietsche et al, 2014, med tillstånd från Elsevier.).

Figur 3: Schematisk bild av en sondenhet; steg AI för detaljer se protokollet (Utdrag ur Lietsche et al., 2014, med tillstånd från Elsevier).

Figur 4: Återvinning av små molekyler och neuropeptider (A) In vitro återkrav av glukos, laktat, acetylkolin och ATP.. Stamlösningen innehöll 1 mM glukos och laktat och alternativt 100 nM ATP och 100 nM acetylkolin för varje experimentell skick. Resultaten uttrycks som procentandel av substans concentration i dialysat / förrådslösning. Värden för testsubstanser är medelvärden ± SD, n = 22 för glukos, n = 22 för laktat, n = 11 för acetylkolin och n = 13 för ATP. (B) In vitro återvinningar av det neuropeptider angiotensin II, substans P och somatostatin. Stamlösningen innehöll 100 nM angiotensin II, substans P och somatostatin för varje experimentell skick. Resultaten uttrycks som procent av ämnets koncentration i dialysat / förrådslösning. Värden av kolumnerna är medelvärden ± SD, n = 6 för varje sond.

Discussion

Figur 3 visar ett exempel på sondanordningen. Dimensioner Rätt inre och yttre diameter måste observeras noggrant för slang (OD 1,6 mm, ID 350 nm), kvartsglas (OD 105 m; ID 40 pm) och dialysmembran (OD 245 m; ID 210 um). Det är också viktigt att hålla ett utrymme mellan membranet och smält kiseldioxid av (105 | j, m) och mellan membranet och slang (105 | j, m) samt. Om värdena skiljer sig åt, kan trycket i sonden stiga och leda till läckage av membranet.

Här presenterar vi en mikrodialyssond med en utbyteslängd av 2 mm, som är tillämplig för mikrodialys i mus hjärnregioner. Emellertid kan dimensioner enkelt anpassas för större utbyteslängder som skall användas i större djur.

Vissa delar av enheten kan bytas ut. Till exempel är det inte nödvändigt att använda PTFE-slang. Tillämpning av polyetenrör är också möjligt med samma yttre och inner dimensioner diameter. Uppruggning av röret är endast nödvändigt vid användning av en PTFE-slang. En ersättning av dialysmembranet är också möjlig. För föreliggande sondenhet, är en 30 kDa-cut-off-membran användes, men någon annan dialysmembran kan användas med identiska dimensioner. Därför har vår skräddarsydda sondaggregatet fördelen med stor flexibilitet för att dialysera ämnen med en bred molekylviktsområde; ju högre molekylvikt cut-off, desto högre molekylvikt av ämnet, som kan dialyseras. In vitro återvinningar brukar öka med molekylvikt cut-off av dialysmembranet.

För att täcka spetsen på membranet, epoxilim krävs för att avsluta skarven mellan dialysmembran och PTFE-slangen och för att bestämma utbytet längden. Applicering av cyanoakrylatlim är inte möjligt i detta steg, eftersom den påverkar dialysmembranet och leder till läckage. Ett cyanoakrylatlim att limma plastic bör tillämpas för fixering av kvartsglas med slangen på plats vid injektionsstället.

Det bör noteras att denna sond utformning inte har testats med styr kanyler. Vårt labb föredrar att implantera prober låg diameter för akuta experiment där vi har 48-72 timmar av experimentell tid innan astroglios orsakar fel på sonden. För denna typ av experiment, inte en styrkanyl inte erbjuda en fördel eftersom styrkanyler är större och orsaka mer vävnadsskada. Även med en styr kanyl på plats, har sonden alltid att föras in i frisk hjärnvävnad, som orsakar akut skada i området av dialysbehandlingen. Upprepat införande och avlägsnande av sonden genom styr kanyler orsakar upprepad skada, en situation som undvikes genom en-tid, dvs. akut införing. Blod-hjärnbarriären visades vara intakta några timmar efter implantation ^12. Över kanyler är emellertid föredraget när seriella mätningar have göras under flera dagar eller veckor. Slutligen bör flyktiga anestetika användas för sond implantering eftersom injicerbara anestesimedel störa efterföljande experiment under 1-2 dagar.

In vitro återvinningar för glukos, laktat, acetylkolin och ATP är ca 20%, det vill säga för alla testade små molekylvikt ämnen är återhämtningen in vitro nästan lika. Uppenbar, i det nedre området (upp till 500 Da), har molekylvikten ingen stor inverkan på in vitro-återvinningsgrad. Den molekylviktsgräns av 30 kDa möjliggör också att dialysera neuropeptider. På grund av den högre molekylvikten av de neuropeptider, är den in vitro-återvinningsvärdet lägre. Substans P (1348 Da) och somatostatin (1638 Da) kan dialyseras i samma utsträckning med in vitro återvinnings värden av 2-3%. Även om båda peptidema har en massförskjutning på ca 300 Da, in vitro återvinningar förblir desamma. Både substning P och somatostatin är positivt laddade i vattenlösning och kan uppvisa liknande fysikalisk-kemiska egenskaper. Angiotensin II med en molekylvikt av 1046 Da avslöjar en hög in vitro återhämtning upp till 6%, vilket är tre gånger större än de andra två neuropeptider. Därför molekylvikter över 500 Da påverkar tydligt återhämtningen in vitro, även om när ämnen debiteras neutral i vattenlösning. I detta fall är återhämtningen i vitro påverkas inte av laddningen av de dialyse ämnen. Men med användning av andra membranmaterial, återvinningar av laddade föreningar kan påverkas ^8.

Sammanfattningsvis, är monteringen av en skräddarsydd mikrodialyssond ett godtagbart alternativ till kommersiella sonder. Våra self-made proberna är robust, har hög tillförlitlighet och god reproducerbarhet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy glue	SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany
Fused silica ID 40 µm OD 105 µm	Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany	Art. No: 6.040105
Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600)	Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany	REF: F00001593
Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic)	Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany
TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm	SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany	Art. No: 969-195.219
Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10)	pfm medical ag, cologne, Germany	Art. No: 07310
Microscope	MEIJI Techno	EMZ-8TR
30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula  Sterican® Z	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	REF: 9324500
25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican®	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	REF: 9186166
Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4)	Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG	Art. No: 88/36
Hot glue  (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm)	Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany	Art. No: 4007841046910
Sandpaper P60 230 x 280	Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany	Catalog Number: 2608605397