Abstract
Enzymatiske mikroelektrode biosensorer er ofte blevet brugt til at måle ekstracellulær signalering i realtid. Det meste af deres anvendelse er blevet begrænset til hjerneskiver og neuronale cellekulturer. For nylig er denne teknologi blevet anvendt på de hele organer. Fremskridt i sensordesign har muliggjort måling af cellesignalering i blod-perfunderet in vivo nyrerne. De nuværende protokoller liste over de nødvendige skridt for at måle ATP og H 2 O 2 signalering i rottenyre interstitium. To separate sensor designs anvendes til ex vivo og in vivo protokoller. Begge typer sensor er belagt med et tyndt enzymatisk biolayer oven på et lag permselektivitet at give reagerer hurtigt, følsomme og selektive biosensorer. Permselektiviteten lag beskytter signalet fra forstyrrende i biologisk væv, og den enzymatiske lag udnytter den sekventielle katalytiske reaktion af glycerol kinase og glycerol-3-phosphate oxidase i nærværelse af ATP for at fremstille H 2 O 2. Sættet af sensorer, der anvendes til ex vivo-undersøgelser påvist yderligere analyt ved oxidation af H 2 O 2 på en platin / iridium (Pt-Ir) trådelektrode. Sensorerne til in vivo undersøgelser er i stedet baseret på reduktion af H 2 O 2 om en mægler belagt guldelektrode designet til væv blod-perfunderet. Opdages slutkoncentration ændringer af real-time amperometri efterfulgt af kalibrering til kendte koncentrationer af analyt. Derudover kan specificiteten af amperometrisk signal bekræftes ved tilsætning af enzymer, såsom katalase og apyrase, som nedbryder H 2 O 2 og ATP tilsvarende. Disse sensorer også stærkt afhængige nøjagtige kalibreringer før og efter hvert forsøg. De følgende to protokoller fastslå undersøgelse af påvisning i realtid af ATP og H2O 2 i nyrevæv og kan modificeres yderligere at udvide den beskrevne fremgangsmåde til brug i andre biologiske præparater eller hele organer.
Introduction
Enzymatisk mikroelektrode biosensorer (også opført som sensorer i den nuværende manuskript) har været et værdifuldt redskab til at studere dynamiske signaleringsprocesser i levende celler og væv. Sensorerne giver øget tidsmæssig og rumlig opløsning af celle signalmolekyler i biologisk relevante koncentrationer. I stedet for prøveudtagning og analyse af ekstracellulære væsker taget med intervaller over lange perioder, disse sensorer reagerer så hurtigt, som deres enzymer reagerer på analyt, hvorved der produceres realtid målinger 1,2. Hurtig påvisning af interstitielle koncentrationer af autokrine og parakrine faktorer, ligesom puriner eller hydrogenperoxid, og dynamikken i deres løsladelse kan bruges til at oprette en profil for virkningerne af lægemidler i normale og patologiske tilstande 3. I øjeblikket har de fleste applikationer ved hjælp sensorer været i hjernevæv skiver og cellekulturer 4-10. De protokoller, der er beskrevet i dette manuskript formål atudvikle midler til nøjagtigt at måle realtid koncentrationer af analytter i hele nyrerne.
Følgende protokoller blev udviklet til at studere interstitiel ATP og H 2 O 2 signalering i nyrerne. I det oprindelige miljø i nyrerne, er ekstracellulært ATP hurtigt kataboliseres af endogene ectonucleotidases i sine derivater (ADP, AMP og adenosin). Sensorerne der anvendes her er meget selektive til ATP frem for andre puriner eller ATP nedbrydningsprodukter 11. Dette giver en stor fordel, da det tillader nøjagtig overvågning af den konstante og dynamiske koncentrationer af ATP frigivelsen og signalfunktion. Interstitiel ATP-koncentrationen måles ved hjælp af en kombination af to mikroelektroder, en ATP sensor og en Null sensor. Den Null sensor i kombination med katalase programmer er i stand til at opdage interstitiel H 2 O 2-koncentrationer 12. Følgende protokoller bruge to forskellige udformninger af sensors, der har egenskaber optimale for enten ex vivo eller in vivo-anvendelser.
Begge designs er baseret på den sekventielle katalytiske reaktion af glycerol kinase og glycerol-3-phosphat oxidase indeholdt i en sensor enzymatisk lag og drives af tilstedeværelsen af ATP. I sæt af sensorer, der anvendes i ex vivo-undersøgelser, H 2 O 2, det endelige enzymatiske reaktionsprodukt detekteres ved oxidation på et platin / iridium (Pt-Ir) trådelektrode. Sensorer til in vivo-undersøgelser er i stedet baseret på H 2 O 2 reduktion på en mediator overtrukket guldelektrode designet til væv blod-perfunderet. Vist i figur 1 er et skema over begge protokoller, der er beskrevet i dette håndskrift. Null sensor er identisk med den tilsvarende ATP sensor undtagen det mangler de bundne enzymer. Derfor, i tillæg til påvisning af H 2 O 2 med katalaseenzymet, Null sensor meaSURES uspecifikke interferens. ATP-koncentrationer beregnes ved at trække Null detekteret uspecifikke interferens og baggrund H 2 O 2 fra ATP følersignal. Flere sensorer er også kommercielt tilgængelige til påvisning af andre analytter, herunder adenosin, ionosine, hypoxanthin, acetylcholin, cholin, glutamat, glucose, lactat, D-serin til ex vivo applikationer eller adenosin, ionosine og hypoxanthin for in vivo, når parret med den tilsvarende Null sensor.
Evne sensoren til nøjagtigt at detektere analytter afhænger af korrekt før og efter kalibreringer 13. Dette sikrer, at analysen tegner sig for drift i sensorens følsomhed, der opstår under brug i biologisk væv. Sensoren besidder et depot af glycerol, der anvendes som et reagens i føleren enzymatiske reaktioner. Hvis sensoren ikke anvendes i bad opløsninger indeholdende glycerol, vil det udvaske over tid. Kortere rOptagelse tider er så nødvendig for at minimere sensorens afdrift. Derudover sensor tilsmudsning af endogene proteaser og protein fragmenter kan i høj grad mindske følsomheden af sensorerne 14.
Den foreliggende manuskript fastlægger anvendelsen af enzymatiske mikroelektrode biosensorer til ex vivo og in vivo nyre præparater. Real-time analyt kvantificering giver hidtil uset detalje i cellulær signalering, der kan afsløre nye indsigter i mekanismerne i nyresygdomme og farmakologiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende dyreforsøg klæbet til NIH Guide til pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Forudgående godkendelse blev opnået fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
BEMÆRK: Gennemgang af fabrikantens sensor anvisninger bør ske i løbet af eksperimentet design og forud for deres brug. Efter disse instruktioner vil producere optimale resultater ved brug af sensorer.
1. Føler kalibrering
- Friske stamopløsninger til opbevaring før starten af forsøget.
- Opret Buffer A indeholdende 10 mM NaPi buffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2 og 2 mM glycerol. PH justeres til 7,4 under anvendelse af NaOH. Opbevar ved 2-8 ° C.
- Brug af en bestand ATP-koncentration (100 mM), opbevaret ved -20 ° C, skabe en frisk 10 mM ATP kalibreringsopløsning ved tilsætning af 10 pi stock til 90 pi puffer A.
- Rehydrere ATP sensor ved at placere dens spids (Figur 2) i tHan rehydrering kammer indeholdende puffer A i mindst 10 minutter ved 2-8 ° C.
BEMÆRK: Efter rehydrering sensorerne bør ikke udsættes for luft i mere end 20 sek eller sensorens følsomhed kan reduceres. Hvis lange eksponeringer til luft forventes, dyppe sensoren kortvarigt i en opløsning af glycerol. Sensorerne kan bruges til flere forsøg, men disse skal ske på samme dag som sensor rehydrering. Sensorerne kan opbevares i rehydrering kammer med Buffer A for op til 24 timer. - Tænd for dual channel potentiostat (figur 3), og start optagelsen systemsoftware.
- Forbered en kalibrering kammer med 3 ml buffer A. Placer henvisningen elektrode ind i kalibreringskammeret. Tag hver sensor fra rehydrering kammeret, derefter vedhæfte den til manipulator og indsætte det i kalibreringskammeret løsning.
BEMÆRK: Brug en standard silikone belagt petriskål som en kalibrering kammer. Udfør alle kalibreringer og studies i et Faradays bur på en højtydende lab luftbord at reducere signal støj under amperometri optagelser (Figur 4). Kalibreringer er bedst så tæt på starten af dataindsamlingen som muligt. For in vivo anvendelser det optimale tidspunkt for kalibreringen er i dyret efter kirurgi restitutionsperiode. - Ex vivo kalibrering
- Udfør cyklisk voltammetri i kalibreringskammeret ved at cykle sensorerne fra -500 mV til 500 mV ved en hastighed på 100 mV / sek til 10 cykler. Dette forbedrer i høj grad følsomheden af sensorerne. I figur 5 sporene observeres fra de 10 cykler.
- Polarisere sensorerne til 600 mV efter sidste cyklus. Sensoren nuværende vil henfalde til en asymptote. En konstant læsning opnås efter mindst 5 min. Optag nul læsning.
- In vivo kalibrering
- Udfør ikke den cykliske voltammetri på in vivo-sensors. I stedet polarisere sensoren i kalibreringskammeret for 30 sek til +500 mV. Indstil derefter potentiostat til 0 mV og tillade sensoren strøm til at stige til et asymptote. Sensoren strøm vil tage mindst 2 min til asymptote. Optag nul læsning.
- Fortløbende tilføje sæt mængder af ATP-løsning ind i kammeret til at producere en kalibrering linje omfatter en ønsket detekteringsområde. Den ATP-opløsning frembringer en skarp top i sensorsignalet i første omgang, efterfulgt af en forfald ATP diffunderer ensartet i kammeret. Optag signalværdier, når signalniveauet er stabiliseret efter hver tilsætning ATP. Figur 6A og 7 viser spor og foreslog ATP-koncentrationer for både ex vivo og in vivo-undersøgelser, henholdsvis.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bekræfte selektiviteten af elektroderne ved at bruge skraldemanden af analytter. Den nuværende protokol, der bruges apyrase at teste specificiteten af ATP sensoren og katalase for H <sub> 2 O 2 signal (figur 6B). Hvis lægemidler, der skal indgives, bestemmes målinger af deres reaktivitet med sensorerne inden undersøgelsen. - Tilsæt 3 pi apyrase fra et lager af 2 mg / ml (89 UN / mg) for at teste specificiteten af ATP sensoren (den nuværende produceret af ATP ansøgning skal reduceres til nul niveau (figur 7).
- Tilsæt 3 pi katalase fra et lager af 2 mg / ml (100 FN / mg) for at teste specificiteten af null sensor (den nuværende fremstillet ved H 2 O 2 ansøgning skal reduceres til nul læsning).
2. Animal Surgery For Sensor Studies
- Kirurgi for ex vivo
- Bedøve forsøgsdyr med isofluran (5% induktion, 1,5 til 2,5% vedligeholdelse) / medicinsk kvalitet O 2 eller en anden godkendt metode. 15 '12 Dyrene skal løbende overvåges for at sikre et passende niveau af anæstesi. Ststand respirationsfrekvens og tå knivspids reaktion anvendes til at bekræfte korrekt anæstesi.
Bemærk: aflive dyret i henhold til godkendte IACUC protokoller. Ved afslutningen af alle ikke-overlevelse procedurer aflive dybt bedøvede dyr ved torakotomi inducere pneumothorax at sikre human død af dyret 12. - Placer rotte på et temperaturstyret operationsbord i rygleje. Mens opretholde en passende anæstetisk dybde, lave en midtlinjeincision på ca. 5 cm i overensstemmelse med den venstre nyre og udsætte den distale abdominale aorta.
- Wrap en ligatur omkring cøliaki og overlegne mesenteriske arterier, og den abdominale aorta over disse arterier, men ikke ligere. Wrap to ligaturer omkring abdominale aorta under de renale arterier.
- Klemme den abdominale aorta over ligaturer. Bind den nederste ligatur. Selvkaterisation den abdominale aorta med polyethylenrør (PE50). Fastgør kateteret med den anden aorta ligatur.
- Fjern klemmen og ligere mesenteriale og cøliaki arterier. Perfundere nyrerne på 6 ml / min med Hanks Balanced Salt Solution ved stuetemperatur i 2-3 min, indtil nyren er helt blancheret.
- Udskære nyrerne og kateteret, som er forbundet del af aorta. Placer nyren i en 3 ml petriskål fyldt med badopløsning.
Bemærk: Eksperiment protokol kan udføres ved stuetemperatur. Badet opløsning indeholder i mM: 145 NaCl, 4,5 KCI, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,35 justeret med NaOH.
- Bedøve forsøgsdyr med isofluran (5% induktion, 1,5 til 2,5% vedligeholdelse) / medicinsk kvalitet O 2 eller en anden godkendt metode. 15 '12 Dyrene skal løbende overvåges for at sikre et passende niveau af anæstesi. Ststand respirationsfrekvens og tå knivspids reaktion anvendes til at bekræfte korrekt anæstesi.
- Kirurgi for in vivo
- Bedøver rotten hjælp godkendte IACUC protokoller. Til in vivo analyser bedøver rotterne med ketamin (20 mg / kg im) og inactin (50 mg / kg ip). Dyrene skal løbende overvåges for at sikre et passende niveau af anæstesi. En stabil respirationsfrekvens og tå knivspids reaktion anvendes til at bekræfte korrekt anæstesi.
- Efter korrekt anæstesidybde er fåed placere rotte i liggende stilling på en temperatur-kontrolleret jordet overflade placeret på luft bordet. Overfladen skal forvarmes og holdt ved 36 ° C.
- Samtidig med at rette anæstetisk dybde, lave en midtlinjeincision ca. 5 cm i overensstemmelse med nyrerne.
- Brug en sutur at aflede og forankre det cutane og subkutane væv, således at hele nyren er synlig. Placer nyrerne i en nyre kop at minimere bevægelse artefakter.
- Brug en IV infusion af 2% BSA: 0,9% NaCl ved 1 ml / 100 g / time via halsvenen for at opretholde blodvolumen. Kanyle begge urinlederne til urinopsamling. Placer bånd omkring overlegne mesenteriale og cøliaki arterier og den distale aorta for manipulation af renal perfusion tryk (10A).
- Hvis anvendelsen af farmakologiske midler er nødvendig i løbet af in vivo eksperimenter, er indsættelse af en interstitiel kateter anbefales (fig 10B
3. Data Acquisition Setup
- Åbn datafangst programmet og sæt dens polaritet for både ex vivo og in vivo forsøg til Anodisk Positiv. Indstille programmet til at gemme data som ASCII-kode.
- Placer mikromanipulatorer til hurtig indføring af sensorerne i nyrerne.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge en dummy sonde fastgjort til mikromanipulator at bidrage til virkeliggørelsen af den ønskede placering af sensorer. - Ex vivo dataopsamling
- Perfundere nyrerne med badopløsning (fra 2.1.6) via kanyle aorta ved en konstant hastighed på 650 ul / min. Anvendelse af kirurgiske sakse, forsigtigt fjerne nyrekapslen, som er nødvendig for indsættelse sensor.
- Fastgør nyrerne med elastikker spændt over nyre og knyttet til silicone-belagt fad med stifter.
- Placer referenceelektroden tæt på nyren i petriskålen med sin spids nedsænket ipufferopløsningen.
- I erhvervelse vivo-data
- Placer nyrerne hos en nyre cup. Afhængigt af stammen og dyrets alder anvende en størrelse på koppen, der holder nyrerne løst. Figur 8 viser to størrelser af nyre kopper. Lignende kopper anvendes til forskellige fysiologiske tilgange fokuserer på analysen af nyrefunktionen, såsom micropuncture osv 16.
Bemærk: Placeringen af nyre koppen er kritisk at fjerne den mekaniske støj fra dyret vejrtrækning, men bør ikke forstyrre eller blokere nyre perfusion eller urin flow. - Tillad 45 minutter for inddrivelse tid, før du udfører dataindsamling.
- Ved hjælp af en 26-30G nål, gør en punktering hul på det ønskede sted og dybden af sensoren i nyrerne. Dup overfladen hul for at fjerne udstrålede blod. Tilføj glycerolopløsning på overfladen af nyren. Dette vil forhindre nyrerne overflade tørrer ud under eksperimentet. Fjern den første sensor fra rehydrering kammeret og fastgør den til mikromanipulator. Hurtigt, inden 20 sek, indsætte elektroden ind i frisk skabte hul i nyrerne. Gentag trin 3,5-3,9 for null sensor.
- Sæt referenceelektrode ind i nyren, ca. 1 cm fra fra sensorerne.
- Placer nyrerne hos en nyre cup. Afhængigt af stammen og dyrets alder anvende en størrelse på koppen, der holder nyrerne løst. Figur 8 viser to størrelser af nyre kopper. Lignende kopper anvendes til forskellige fysiologiske tilgange fokuserer på analysen af nyrefunktionen, såsom micropuncture osv 16.
- Tænd for potentiostat og aktivere optagelsen programmet på computeren. Figur 9 viser den endelige opsætning af ex vivo erhvervelse nyre data. Figur 10 viser den endelige opsætning af in vivo-nyre dataopsamling med et indsat kateter.
4. Data Analysis
- Importere ASCII data fil i Origin eller andet lignende software.
- Koncentration nuværende forhold
- Brug det lineære fit / ekstrapolere funktion til at bygge en lineær koncentration (x- akse) til strøm (y-aksen) forhold til ATP eller H2 2 kalibreringspunkter (figur 6 og 7).
lineær tilpasning linje: y = mx + b
- Brug det lineære fit / ekstrapolere funktion til at bygge en lineær koncentration (x- akse) til strøm (y-aksen) forhold til ATP eller H2 2 kalibreringspunkter (figur 6 og 7).
- Sidestille den nuværende koncentration
- Fratræk målte spor af null sensoren fra dem af ATP sensor til opnåelse af den faktiske strøm, der produceres ved intracellulær ATP.
- Konverter ATP værdier i pA opnået ved amperometri til nM hjælp kalibreringsligningen beskrevet i 4.2.1. Bestemme koncentrationen af det subtraherede data spor af ATP sensoren ved at importere hver justerede strøm ind i "x" værdi og løse for y (koncentrationen af analyt).
- Ligeledes beregner H 2 O 2 koncentration fra sin kalibreringsligningen hvis det er nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udformningen af den enzymatiske mikroelektrode biosensor tillader påvisning i realtid af analytter i hele nyrerne. Den generelle eksperiment design for enten ex vivo eller in vivo-undersøgelser er vist i figur 1 .De sensorer og kirurgiske procedurer varierer afhængig af, om undersøgelsen er ex vivo eller in vivo.
For at opnå reproducerbare resultater, nøjagtig før og efter kalibreringer er kritiske. Figur 6A viser et repræsentativt spor af det signal set fra ex vivo ATP sensoren under kalibreringer. Bemærk, at apyrase hurtigt elimineret ATP signal. Katalase havde ingen virkning på ATP-signalet og viser dens specificitet til H 2 O 2 skaber (figur 6B). Kalibreringsproceduren frembringer en lineær tilpasning, der bruges til at beregne de dynamiske ændringer i ATP (figur 6A, højre panel). I VIvo-sensor kalibrering producerer et lignende spor med den ex vivo sensoren. Men denne sensor registrerer reduktiv stedet for oxidative strømme og som sådan strøm, der produceres er negativ. Kalibrering af disse sensorer producerer også en lineær tilpasning i en 0,3-80 um (figur 7A højre panel). Specificitet af in vivo sensoren til ATP i forhold til andre purin produkter er vist i figur 7B.
Den her beskrevne metode giver os mulighed for at måle både basale niveauer af endogene stoffer og akutte ændringer som reaktion på narkotika infusion 12. Vist i figur 11 er Ang II-inducerede ændringer af interstitiel endogen koncentration af H 2 O 2 i salt-resistente og salt-følsomme rotter. Til disse eksperimenter blev frisk isolerede nyrer fra Sprague Dawley (SD) eller Dahl salt-følsomme (SS) rotter perfunderet med 1 uM Ang II under konstant laminar strømning (650 pl / min). Som shown i figur 11, Ang II inducerer akut frigivelse af H 2 O 2 i nyrerne fra både SD og SS rotter. Imidlertid blev den maksimale amplitude af hver reaktion signifikant forhøjet i SS rotter, især når dyrene blev fodret med en høj saltkost 12. Vist i figur 12 er en repræsentativ anvendelse af biosensorer in vivo. Infusion af katalase (5 ug / ml) fuldstændigt blokerer H 2 O 2 signal detekteres af biosensoren. Disse forsøg illustrerer anvendelsen af specifikke enzymatiske biosensorer kombineret med amperometrisk teknik til påvisning af basale niveauer af endogene stoffer og tidstro målinger af deres frigivelse som reaktion på farmakologisk intervention. Yderligere anvendelser af denne tilgang til at studere den rolle, purinergiske signalering og hydrogenperoxid vil forbedre vores viden og forståelse af renale patologier som salt-følsomme hypertension, renal okseidative stress og kronisk nyresygdom.
Figur 1. Skematisk af protokollerne. Kalibrering med analytten af interesse og kontrol af dets specificitet sker umiddelbart forud for starten af forsøgene. In vivo-protokollen bør følges for komplekse fysiologiske eksperimenter og ex vivo til farmakologiske anvendelser. Indlæg eksperiment kalibrering bør gøres og tages i betragtning under analysen af data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Enzymatisk mikroelektrode Sensor. De tosensor størrelser, der anvendes til ex vivo-anvendelser er vist, 50 um og 125 um diametre. Hver sensor ledning strækker sig ind i et kapillarrør at oprette forbindelse til en guld ende stik (ikke vist). Indsat viser en sensor tip overtrukket med enzymer til ATP detektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dual Channel Potentiostat. Potentiostaten kanaler mærket CH1 og CH2. 1) CH1 ATP følertilslutning og 2) CH2 null sensor tilslutning 3) forbindelser, der er elektrisk koblet til referenceelektroden. Klik her for at se en større version af dette tal.
ass = "jove_content" fo: holde-together.within-side = "altid"> 
Figur 4. Sensor Setup. Er erhvervelse Dataene udført i et Faradays bur for at reducere elektrisk støj og en højtydende lab bord til en vibrationsfri arbejdsflade. 1) En temperaturreguleret kirurgisk tabel anvendes til at opretholde dyrs kropstemperatur under fysiologiske forsøg 2) de mikromanipulatorer er fastgjort til magnetiske monteringsadapterne til fleksibel placering af sensorerne under forsøg 3) En lyskilde er behov for kirurgiske procedurer og sensor indsættelse 4 ) dual channel potentiostat 5) holder til sensorerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg "/>
Figur 5. Cyklisk voltammetri. For ex vivo undersøgelser, er sensoren cyklisk voltammetri gennemført for 10 cykler mellem -0,5 og 0,5 V, før kalibreringen protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Amperometri Kalibrering for Ex Vivo. (A) Kalibrering anvender tilsætning af kendte ATP-koncentrationer til badopløsningen. Tilsvarende amperometriske værdier registreres på asymptote niveau (sort trace). Strømmene opnået skabe en kalibreringsligningen. Et eksempel er vist på højre panel. Den røde kurve er den current af Null sensor, som reagerer på kun kræver tilsætning af H 2 O 2. (B) Den Null sensor kalibreres ved tilsætning af kendte H 2 O 2 koncentrationer (røde pile) til badopløsningen og asymptoterne amperometriske værdier registreres (tynde sorte pile). Tilsætning af katalase til badet opløsning (tyk sort pil) resulterer i hurtig strøm forfald. Den højre panel viser Null sensor kalibreringsligningen. Klik her for at se en større version af denne figur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Amperometri Kalibrering for;. In vivo kalibrering af in vivo elektroderne udføres på en lignende måde som den beskrevet i ex vivo undersøgelser, med undtagelse reduktionsreaktioner forårsage en omvendt strøm (polaritet). (A) Tilsætning af kendte ATP-koncentrationer frembringer en amperometrisk strøm på ATP sensor (sort trace), men har ingen virkning på Null sensor (rød spor). Tilsætning af apyrase slukker strømmen i ATP sensor. (B) Specificiteten af ATP sensor bekræftes ved tilsætning af 10 uM forskellige purinerge midler (UTP, UDP og adenosin). Yderligere anvendelser af ATP giver en stabil påviselig amperometrisk strøm. (C) mikrofotografi af de in vivo sensorer baseret på en mægler belagt guld elektrode. Klik her for at se en større version af denne Figure.
Figur 8. Nyre Cups. I in vivo studier er nyrer holdes stadig bruger rustfrit stål nyre kopper vist. To størrelser af kopper bruges til at rumme nyre størrelsesvariant. Disse kopper reducere bevægelse artefakter, der er genereret af dyrets respiration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Ex Vivo Isoleret og perfusionerede Nyre. Er Den isolerede nyre placeret i en 1) petriskål belagt med et tykt silicone bund for pin indsættelse 2) den renale arterie kanyle og fastgjort til en sprøjtepumpe for konstant perfusion under forsøg 3) ATP sensor, 4) og Null sensor indsættes i nyrerne 5) referenceelektroden er placeret nær nyrerne nedsænket ind i badet løsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. In vivo Blood perfunderet Nyre. (A) Den venstre nyre udsættes og anbringes i en nyre cup, højre nyre forbliver intakt inde i dyret. Begge sensorer er indsat i nyrerne. BSA: NaCl infunderes via kateteriseret halsvene for at modvirke den væsketab forårsaget by den store midt-line snit (B) Eksempel på in vivo-forsøg med en implanteret interstitiel kateter til direkte farmakologiske anvendelser 1) nyren er i besiddelse af en nyre kop 2) ATP sensor 3) Null sensor og 4) referenceelektrode indsættes ind i den ventrale overflade af nyren 5) kateter implanteret i nyren og fastgjort til en peristaltisk pumpe for laminare farmakologiske infusioner. Klik her for at se en større version af denne figur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11. Ex vivo-analyse af H2 sub> O 2 i nyrerne. Ang II perfusion forårsager H 2 O 2 frigivelse i rottenyren cortex. (A) Reelle tid ændringer i den gennemsnitlige H 2 O 2 koncentration (grå søjler viser standardafvigelsen) fra i alt n = 8 applikationer (4 nyrer fra 4 forskellige rotter). Bjælker øverst repræsenterer Ang II ansøgning. (B) Den maksimale H2O 2 koncentration amplitudeværdier løbet Ang II perfusion for Sprague Dawley (SD) og Dahl salt-følsomme (SS) rotter fodret med en lav og høj salt kost, henholdsvis. * - P <0,05 versus SD-rotter. Figuren er tilpasset fra henvisningen 12 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
Figur 12. In vivo-analyse af H 2 O 2. Eksempel på in vivo vurdering af interstitiel H 2 O 2 koncentrationen i medulla en SS rotte fodret med en diæt med lavt saltindhold (som vist i figur 10B). Den interstitielle anvendelse af katalase via et implanteret kateter til 5 min interval fremlagt en fuldstændig blokade af H 2 O 2 signal i den renale medulla. Reduktion af katalase, fra udvaskning ved renal blodgennemstrømning, resulterede i en delvis tilbagebetaling af signalet, der blev blokeret igen ved en ekstra katalase ansøgning (10 min). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nuværende protokoller blev udviklet til at give forbedret tidsmæssig og rumlig opløsning af ATP og H 2 O 2 signalering til ex vivo isolerede, perfunderet og in vivo nyrer blod-perfunderet. Forskellene mellem de protokoller og sensorerne her anvendte giver erhvervelse til enten farmakologiske midler eller fysiologiske studier optimale data. Protokollerne består af 1) sensor kalibrering, 2) kirurgisk procedure, 3) setup datafangst, og 4) dataanalyse. De gør det muligt real-time målinger af analytter for mange eksperimentelle betingelser. Dette vil føre til større indsigt i nyresygdomme og udvikling af mere effektive farmakologiske behandlinger. Her brugte vi sensorerne til at analysere ATP og H 2 O 2. Men sensorer for andre stoffer er også tilgængelige og kan anvendes. De her beskrevne protokoller blev anvendt til at studere ATP og H 2 O 2 i rottenyrer, men det samme method kan nemt justeres til anvendelse i mus. Således er denne fremgangsmåde har et stort potentiale i betragtning af overflod af genetiske gnavermodeller.
Det grundlæggende design af enzymatiske mikroelektrode biosensorer blev udviklet i 1960'erne af Clark og Lyons 2. Efter den indledende udvikling af biosensorer, har fremskridt er sket i både design 17-19 og applikationer 20. Llaudet et al. 21,22 udviklet princippet udformning af ATP sensorer, der anvendes i de foreliggende protokoller under anvendelse af metoder fra Cosneir et al. 23 til enzym belægning. Disse sensorer har opdaget ATP signalering i en række fysiologiske processer, herunder ATP frigivelse fra hjerneastrocytter 8, regulering af vejrtrækning 4,24, og skeletmuskulatur arteriole regulering 25. Senest ex vivo protokol er blevet anvendt til at måle ATP signalering i nyrerne 12. Målet med dette manuskript is at tilvejebringe effektive retninger og indsigt til detektering af endogene stoffer såsom ATP i nyrerne.
Enzymatiske mikroelektrode biosensorer har mange fordele i forhold til eksisterende midler til måling analytter in vivo. Dog bør anvendes særlige forholdsregler for dette metode som for enhver anden ny metode. Validering med en etableret fremgangsmåde giver tillid til de opnåede data. For eksempel blev mikrodialyse målinger som beskrevet tidligere 26,27. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem de maksimale koncentrationer bestemt af sensorer og dem, der opnås fra dialyse prøverne 12. Begrænsningen af mikrodialyse er, at den kun måler steady-state niveauer af analyt. Som sådan kan vurderingen af dynamiske ændringer i cellesignalering kun opnås ved anvendelse af de enzymatiske mikroelektrode biosensorer. Fabrikken specifikationer af sensoren svartider varierer mellem sensortyper. Ex vivo sensorer har en responstid på 5-10 sek og in vivo sensorer på 30-35 sek for signalet stige fra 10 til 90%. De kalibrering spor (figur 6 og 7) demonstrere tidsopløsning af analyt tilføjelse / fjernelse. For både sensor- og mikrodialyse metoder, er anvendelsen af specifikke enzymer til at blokere frembragt af analytter nødvendige for at sikre specificitet.
De beskrevne protokoller har flere udfordringer. Som med enhver sensor indføring i væv, er vævsbeskadigelse forekommer. Dette kunne aktivere signalveje, som kan have indflydelse på målingerne 28. For at minimere celleskader, ville tyndere sensorer være nødvendig. Det er imidlertid vanskeligt at trænge ind nyrekapslen med sensorerne, så nåle anvendes til at lave et lille indgangshul. Tynde sensorer er mere tilbøjelige til at bøje og forstyrre deres belægning på indsættelse. Sensorer med større diameter er mere modstandsdygtige bøjning og resultant skade på belægningen. Figur 3 viser en tynd og tyk sensor. Ud over den tykke sensorens modstand mod bøjning, de indeholder et tykkere lag af coating, hvilket giver øget beskyttelse af den enzymatiske lag. Den bekymring for vævsskader som følge af brug af tykke sensorer var betydeligt mindre i nyrer, end det ville være i hjernevæv. Indsættelsen dybde tilnærmes og den endelige placering bør kontrolleres efter målinger på nyrerne er afsluttet. Skøn mellem cortex og medulla lag ved hjælp af sensor tip længde som en indføring vejledning og er tilstrækkelig, da sensoren tip er 0,5 mm, og nyrerne cortex er 2-3 mm tyk. Tilsmudsning af sensoren forekommer også med en større hastighed i blod, hvilket begrænser sensorens anvendelse i lange in vivo protokoller til et enkelt forsøg. Optagelse tidspunkter af 1 til 1 ½ time resulterede i kun en lille sensor afdrift. De vigtigste kriterier ved vurderingen af den reducerede sensor ydeevne er den lave følsomhedtil analytten under kalibreringsprocessen. Øget elektrisk støj og ustabilitet af baseline strøm kan også indikere, at spidsen af sensoren er beskadiget. For nøjagtige målinger af ATP, skal begge sensorer (ATP og Null) har lignende støj og stabilitetsegenskaber for yderligere subtraktion af signalet. Ellers skal en af sensorerne udskiftes. For lav støj og detektering af små koncentrationer af analyt, er anvendelsen af nye sensorer for hvert dyr foreslået.
Flere trin er afgørende for en vellykket eksperimentelle resultater. Sensorerne er meget skrøbelige og skal håndteres forsigtigt for at undgå at beskadige sensoren spids. Også efter rehydrering, sensorerne bør ikke udsættes for luft i mere end 20 sek. Der kræves støjsvage optagelser for en vellykket detektion af biologiske signaler i væv. Til dette formål er en højtydende lab luft bord og korrekt elektrisk jordforbindelse kræves. Tilsætningen af nøjagtige mængder af analyt during kalibrerings- skridt er nødvendig for nøjagtig koncentration beslutsomhed i eksperimenter. Opnå god rydning af nyren i ex vivo nyre operationer vil resultere i vellykkede optagelser. Anvendelsen af enzymer apyrase og katalase i kalibreringer og eksperimenter giver mulighed for vurdering af sensoren specifik følsomhed og bekræfter målingerne.
Disse protokoller giver stærkt forbedret detalje af ekstracellulær signalering i nyrerne. Den forbedrede følsomhed og tidsmæssig opløsning ydes af sensorerne kan tillade os at løse ændringer i ATP-signalering i sygdomstilstande og efter farmakologisk manipulation, der tidligere var målbart. In vivo-protokollen er velegnet til komplekse fysiologiske studier, mens ex vivo er optimal for studiet af farmakologiske applikationer på nyrerne. Udformningen af in vivo sensoren bruges her giver hidtil uset modstand mod indgreb i BLood-perfunderet væv. Tilsammen disse sensorer giver en stor mængde applikationer, der tidligere var ikke muligt med eksisterende protokoller og teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sensorer til videooptagelse af dette manuskript blev tilvejebragt af Sarissa Biomedical Limited (Coventry, UK).
Acknowledgments
Vi sætter pris på Sarissa Biomedical for deres arbejde med at udvikle sensorerne anvendes i den foreliggende manuskript. Denne forskning blev støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute giver HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) og HL 122662 (A. Staruschenko og A. Cowley), et projekt finansieret af Medical College of Forskning Anliggender Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) og fremme en sundere Wisconsin Forskning og Education Program # 9520217, og den unge Investigator Grant for National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
