Abstract
Biossensores microeléctrodo enzimáticas têm sido amplamente utilizados para medir a sinalização extracelular em tempo real. A maioria da sua utilização tem sido limitada a fatias de cérebro e cultura de células neuronais. Recentemente, esta tecnologia tem sido aplicada aos órgãos inteiros. Avanços em design de sensor tornaram possível a medição de sinalização celular em em rins vivo perfusão de sangue. Listar os atuais protocolos os passos necessários para medir ATP e sinalização H 2 O 2 no interstício do rim do rato. Dois modelos de sensores separados são usados para o ex vivo e in vivo protocolos. Ambos os tipos de sensores são revestidos com uma fina biolayer enzimática no topo de uma camada de permeabilidade selectiva para dar resposta rápida, biossensores sensíveis e selectivos. A camada de permeabilidade selectiva protege o sinal a partir dos interferentes no tecido biológico, e a camada enzimática utiliza a reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e glicerol-3-fosphate-oxidase na presença de ATP para produzir H 2 O 2. O conjunto de sensores utilizados para os estudos ex vivo mais analito detectada por oxidação de H 2 O 2 em uma platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Os sensores para os estudos in vivo são, em vez baseado na redução de H 2 O 2 em um eléctrodo de ouro revestido mediador concebido para o tecido perfundido de sangue. Mudanças concentração final detectado por amperometria são em tempo real seguido de calibração de concentrações conhecidas de analito. Além disso, a especificidade do sinal amperométrico pode ser confirmada pela adição de enzimas como a catalase e apirase que quebram H 2 O 2 e ATP correspondentemente. Estes sensores também dependem fortemente de calibrações precisas antes e depois de cada experimento. Os dois protocolos seguintes estabelecer o estudo de detecção em tempo real de ATP e H 2O 2 em tecidos renais, e pode ser ainda modificado para prolongar o método descrito para o uso em outras preparações biológicas ou órgãos inteiros.
Introduction
Biossensores microeléctrodo enzimática (também referida como sensores no presente manuscrito) ter sido uma ferramenta valiosa para estudar processos dinâmicos de sinalização em células e tecidos vivos. Os sensores proporcionam uma maior resolução temporal e espacial das moléculas de sinalização celular nas concentrações biologicamente relevantes. Em vez de amostragem e análise de fluidos extracelulares tomadas em intervalos durante longos períodos de tempo, estes sensores responder tão rápido quanto suas enzimas reagem com o analito, produzindo, assim, as medições em tempo real de 1,2. Detecção rápida de concentrações intersticiais de factores autócrinos e parácrinos, como purinas ou peróxido de hidrogénio, e a dinâmica da sua libertação pode ser utilizada para estabelecer um perfil para os efeitos da droga em condições normais e patológicas 3. Actualmente, a maioria das aplicações que usam sensores têm sido cérebro em lâminas de tecido e culturas de células 4-10. Os protocolos detalhados nesta objetivo manuscrito paraestabelecer os meios para medir com precisão concentrações em tempo real dos analitos em rins inteiros.
Os seguintes protocolos foram desenvolvidos para estudar ATP intersticial e H 2 O 2 a sinalização em rins. No ambiente nativo do rim, ATP extracelular é rapidamente catabolizado por ectonucleotidases endógenos em seus derivados (ADP, AMP e adenosina). Os sensores usados aqui são altamente seletivas para ATP sobre outras purinas ou ATP produtos de degradação 11. Isto oferece uma grande vantagem, pois permite um acompanhamento preciso das concentrações constantes e dinâmicas de libertação de ATP e sua função de sinalização. Intersticial concentração de ATP é medida utilizando a combinação de dois micro-eléctrodos, um sensor de ATP e um sensor nulo. O sensor nulo em combinação com catalase aplicações é capaz de detectar intersticial H 2 O 2 a 12 concentrações. Os seguintes protocolos de usar dois modelos diferentes de sensoRS que possuem características ideais para tanto ex vivo ou em aplicações in vivo.
Ambos os modelos são baseados na reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e oxidase de glicerol-3-fosfato contido em uma camada de sensor enzimática e é accionado pela presença de ATP. No conjunto de sensores utilizados nos estudos ex vivo, H 2 O 2, o produto final da reacção enzimática, é detectada por oxidação sobre um catalisador de platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Sensores para estudos in vivo em vez disso são baseados em H 2 O 2 a redução em um eletrodo de ouro mediador revestidos específicos para o tecido perfusão de sangue. Mostrado na Figura 1 é um esquema de ambos os protocolos descritos neste manuscrito. O sensor Null é idêntico ao seu sensor de ATP correspondente exceto ela não tem as enzimas ligadas. Portanto, para além da detecção de H 2 O 2 com a enzima de catalase, o sensor de MEA nuloSures interferências não específicas. Concentrações de ATP são calculados subtraindo o Null detectadas interferências não específicas e fundo H 2 O 2 a partir do sinal do sensor de ATP. Vários sensores também estão comercialmente disponíveis para a detecção de outros analitos, incluindo a adenosina, ionosine, hipoxantina, acetilcolina, colina, glutamato, glucose, lactato, d-serina por ex vivo aplicações ou adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo, quando emparelhado com o nulo corresponde sensor.
A capacidade de o sensor detectar com precisão analitos depende da pré adequada e calibrações pós-13. Isto assegura que a análise representa o desvio na sensibilidade do sensor, que ocorre durante a utilização em tecidos biológicos. O sensor contém um depósito de glicerol que é utilizado como um reagente nas reacções enzimáticas do sensor. Se o sensor não é utilizado em soluções contendo glicerol de banho, que deve perder ao longo do tempo. Shorter recording vezes são, então, necessárias para minimizar a deriva do sensor. Além disso a incrustação do sensor por proteases endógenas e os fragmentos de proteínas podem diminuir significativamente a sensibilidade dos sensores 14.
O presente manuscrito estabelece o uso de biossensores microeletrodos enzimáticas para a ex vivo e em preparações in vivo de rim. Em tempo real quantificação do analito fornece detalhes sem precedentes de sinalização celular que pode revelar novos insights sobre os mecanismos de doenças renais e agentes farmacológicos.
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Protocol
Os seguintes procedimentos com animais aderiram ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação prévia foi obtida de Cuidado e Uso Comitê Institucional Animal (IACUC).
NOTA: Revisão das instruções do fabricante do sensor deve ser feito durante o delineamento experimental e antes da sua utilização. Seguindo estas instruções irá produzir os melhores resultados ao usar os sensores.
Calibração do Sensor 1.
- Preparar soluções de fresco, antes do início da experiência.
- Criar Tampão A contendo tampão NaPi 10 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, e 2 mM de glicerol. Ajustar o pH a 7,4 usando NaOH. Armazenar a 2-8 ° C.
- Utilizando uma concentração de estoque de ATP (100 mM) armazenado a -20 ° C, criar uma nova solução de calibração 10 mM de ATP pela adição de 10 ul de estoque de 90 ul de tampão A.
- Re-hidratar o sensor de ATP, colocando a sua ponta (Figura 2) em tele câmara de reidratação contendo Tampão A durante pelo menos 10 min a 2-8 ° C.
NOTA: Após reidratação, os sensores não devem ser expostos ao ar durante mais de 20 segundos ou a sensibilidade do sensor pode ser reduzida. Se longas exposições ao ar estão previstos, mergulhe o sensor brevemente em uma solução de glicerol. Os sensores podem ser usados para várias experiências, mas estas devem ocorrer no mesmo dia como sensor de re-hidratação. Os sensores podem ser armazenados na câmara de hidratação com tampão A para até 24 horas. - Ligue o potenciostato canal duplo (Figura 3) e iniciar o software do sistema de gravação.
- Prepara-se uma câmara de calibração com 3 ml de tampão A. Coloque o eléctrodo de referência dentro da câmara de calibração. Tome cada sensor da câmara de reidratação, em seguida, anexá-lo ao manipulador e inseri-lo na solução de câmara de calibração.
NOTA: Use um silicone revestido placa de petri padrão como uma câmara de calibração. Realizar todas as calibrações e studies em uma gaiola de Faraday em uma mesa de ar do laboratório de alta performance para reduzir o ruído do sinal durante as gravações amperometria (Figura 4). Calibrações são o melhor feito tão perto do início da coleta de dados possível. Para aplicações in vivo, o tempo óptimo para a calibração é animais durante o período de recuperação pós-cirurgia. - Ex vivo calibração
- Realizar voltametria cíclica na câmara de calibração e ligando os sensores de -500 mV a +500 mV a uma velocidade de 100 mV / seg durante 10 ciclos. Isto melhora grandemente a sensibilidade dos sensores. Veja a Figura 5 para os traços observados a partir dos 10 ciclos.
- Polarizar os sensores a +600 mV após o último ciclo. O sensor de corrente irá decair para uma assíntota. Uma leitura de equilíbrio é atingido após um mínimo de 5 minutos. Registre a leitura do zero.
- In vivo calibração do sensor
- Não execute a voltametria cíclica na in vivo sensors. Em vez disso, polarizar o sensor na câmara de calibração durante 30 seg a 500 mV. Em seguida, defina o potenciostato a 0 mV e permitir que a corrente do sensor de subir para uma assíntota. A corrente do sensor vai demorar pelo menos 2 min a assíntota. Registre a leitura do zero.
- Consecutivamente adicionar conjunto quantidades de solução de ATP para dentro da câmara para produzir uma linha de calibração que abrange uma gama de detecção desejado. A solução ATP produz um pico acentuado no sinal do sensor inicialmente, seguido por um decaimento como o ATP difunde-se uniformemente ao longo da câmara. Valores de sinal de gravação uma vez que o nível do sinal se estabilizou após cada adição de ATP. As Figuras 6A e 7 mostram traços e sugere concentrações de ATP para tanto ex vivo e estudos in vivo, respectivamente.
NOTA: É importante confirmar a selectividade dos eléctrodos usando sequestrantes dos analitos. O presente protocolo utilizado apirase para testar a especificidade do sensor de ATP e catalase para o H <sub> 2 sinal de O 2 (Figuras 6B). Se os medicamentos são para ser administrado, as medições da sua reactividade com os sensores deve ser determinada antes do estudo. - Adicionar 3 mL de apirase a partir de um stock de 2 mg / ml (89 NU / mg) para testar a especificidade do sensor de ATP (a corrente produzida por aplicação de ATP deveria reduzir ao nível zero (Figura 7).
- Adicionar 3 mL de catalase a partir de um stock de 2 mg / ml (100 ONU / mg) para testar a especificidade do sensor nulo (a corrente produzida por aplicação de H 2 O 2 deve reduzir a leitura de zero).
2. Cirurgia animal para estudos de Sensores
- Cirurgia para ex vivo
- Anestesiar o animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade O 2 ou outro método aprovado. 15 '12 animais devem ser monitorados continuamente para assegurar um nível adequado de anestesia. Streação taxa e toe pitada respiratório capaz são usados para confirmar a anestesia adequada.
Nota: eutanásia do animal de acordo com os protocolos aprovados IACUC. Após a conclusão de todos os procedimentos não-sobrevivência sacrificar animais profundamente anestesiados por toracotomia induzir pneumotórax para assegurar o desaparecimento humano do animal 12. - Colocar o rato sobre uma mesa cirúrgica de temperatura controlada em posição supina. Enquanto se mantinha uma profundidade anestésico adequado, fazer uma incisão na linha média de cerca de 5 cm em linha com o rim esquerdo e expor a aorta abdominal distai.
- Enrole uma ligadura ao redor do artérias celíaca e mesentérica superior ea aorta abdominal acima dessas artérias, mas não ligar. Enrole duas ligaduras em torno da aorta abdominal abaixo das artérias renais.
- Prenda o aorta abdominal acima das ligaduras. Amarre a ligadura inferior. Cateterize da aorta abdominal com tubo de polietileno (PE50). Fixe o cateter com a segunda ligadura aorta.
- Retire o grampo e ligar os mesentéricos e celíacos artérias. Perfundir rim de 6 ml / min com Solução Salina Equilibrada de Hanks à TA, durante 2-3 min, até que o rim é completamente branqueados.
- Excisar o rim e o cateter, ligado porção da aorta. Colocar o rim para um prato de Petri de 3 ml cheio com solução de banho.
Nota: protocolo de experiência pode ser realizada à temperatura ambiente. A solução do banho contém em mM: 145 de NaCl, 4,5 de KCl, 2 de MgCl2, 1 de CaCl2, 10 de HEPES, pH 7,35 ajustado com NaOH.
- Anestesiar o animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade O 2 ou outro método aprovado. 15 '12 animais devem ser monitorados continuamente para assegurar um nível adequado de anestesia. Streação taxa e toe pitada respiratório capaz são usados para confirmar a anestesia adequada.
- Cirurgia para in vivo
- Anestesiar ratos utilizando protocolos aprovados IACUC. Para a análise in vivo anestesiar os ratos com cetamina (20 mg / kg IM) e inactina (50 mg / kg ip). Os animais devem ser continuamente monitorado para garantir um nível adequado de anestesia. Uma reação taxa e toe pitada respiratório estável são utilizados para confirmar a anestesia adequada.
- Depois de profundidade anestesia adequada é obterEd, colocar o rato na posição supina sobre uma superfície ligada à terra, com temperatura controlada localizado sobre a mesa de ar. A superfície deve ser pré-aquecido e mantido a 36 ° C.
- Enquanto se mantinha a profundidade da anestesia adequada, fazer uma incisão na linha média cerca de 5 cm em linha com o rim.
- Usar um sutura para desviar e ancorar no tecido cutâneo e subcutâneo para que todo o rim é visível. Coloque o rim em um copo rim para minimizar os artefatos de movimento.
- Utilize uma infusão IV de 2% de BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr através da veia jugular para manter o volume de sangue. Canular ambos os ureteres para a coleta de urina. Coloque os laços em torno das artérias mesentéricas e celíacas superior ea aorta distal para a manipulação de pressão de perfusão renal (Figuras 10A).
- Se a aplicação de agentes farmacológicos é necessário durante os experimentos in vivo, a inserção de um cateter intersticial é recomendada (Figuras 10B
Setup 3. Aquisição de Dados
- Abra o programa de aquisição de dados e definir a sua polaridade para ambos ex vivo e in vivo para Anodic positiva. Configure o programa para salvar dados como código ASCII.
- Posicione os micromanipuladores para inserção rápida dos sensores para os rins.
NOTA: Como alternativa, utilizar uma sonda ligada ao manequim micromanipulador para ajudar a conseguir o posicionamento desejado de sensores. - Ex vivo de aquisição de dados
- Perfundir o rim com uma solução de banho (a partir de 2.1.6) através da aorta foi canulada com uma taxa constante de 650 ul / min. Utilizando uma tesoura cirúrgica, cuidadosamente remover a cápsula do rim, o que é necessário para a inserção do sensor.
- Fixar o rim com bandas de borracha sobre o rim amarrados e ligados ao prato revestido de silicone com pinos.
- Colocar o eléctrodo de referência próximo do rim na placa de Petri com a sua ponta submersa ema solução tampão.
- Na aquisição de dados vivo
- Coloque o rim em um copo de rim. Dependendo da estirpe e idade do animal usar um tamanho de copo que contém o rim frouxamente. A Figura 8 mostra dois tamanhos de copos nos rins. Copos semelhantes são usadas para diferentes abordagens fisiológicas voltadas para a análise da função renal, tais como micropunção etc 16.
Nota: A posição da taça do rim é crítica para remover o ruído mecânico produzido pela respiração animal, mas não deve interferir com a perfusão do rim ou bloquear o fluxo ou urina. - Permitir que 45 min de tempo de recuperação antes de realizar a coleta de dados.
- Usando uma agulha 26-30G, fazer um buraco punção no local desejado e a profundidade do sensor no rim. Blot o buraco superfície para remover o sangue emanava. Adicionar solução de glicerol na superfície do rim. Isto irá evitar que a superfície do rim de secar durante a experiência. Retire o primeiro sensor da câmara de reidratação e anexá-lo ao micromanipulador. Rapidamente, dentro de 20 segundos, inserir o eléctrodo dentro do buraco criado recentemente no rim. Repita os passos de 3,5-3,9 para o sensor nula.
- Insira o eletrodo de referência para o rim, aproximadamente 1 cm a partir dos sensores.
- Coloque o rim em um copo de rim. Dependendo da estirpe e idade do animal usar um tamanho de copo que contém o rim frouxamente. A Figura 8 mostra dois tamanhos de copos nos rins. Copos semelhantes são usadas para diferentes abordagens fisiológicas voltadas para a análise da função renal, tais como micropunção etc 16.
- Ligue o potenciostato e activar o programa de gravação no computador. A Figura 9 mostra a configuração final do ex vivo de aquisição de dados do rim. A Figura 10 mostra a configuração final do rim de aquisição de dados in vivo com um cateter inserido.
Análise 4. Dados
- Importar o arquivo de dados ASCII em origem ou qualquer outro software semelhante.
- Relação atual concentração
- Use a função de ajuste / extrapolar linear para construir uma concentração linear (eixo x) para corrente (eixo y) relação para a ATP ou H 2 O 2 pontos de calibração (Figuras 6 e 7).
linear linha de ajuste: y = mx + b
- Use a função de ajuste / extrapolar linear para construir uma concentração linear (eixo x) para corrente (eixo y) relação para a ATP ou H 2 O 2 pontos de calibração (Figuras 6 e 7).
- Equiparar a corrente a concentração
- Subtrair os vestígios de medição do sensor nulo das do sensor de ATP para obter a corrente real produzida pelo ATP intracelular.
- Converter os valores de ATP no PA obtidos por amperometria para nm, utilizando a equação de calibração detalhado em 4.2.1. Determinar a concentração do traço do sensor de ATP dados subtraídos importando cada corrente ajustada para o valor "X" e resolvendo para y (a concentração da substância a analisar).
- Da mesma forma, calcular H 2 O 2 a partir da sua concentração equação de calibração, se necessário.
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Representative Results
O design do biossensor microeléctrodo enzimático permite a detecção em tempo real dos analitos em rins inteiros. A concepção geral para qualquer experiência ex vivo ou estudos in vivo é ilustrado na figura 1 os sensores .Os utilizada e os procedimentos cirúrgicos diferentes, dependendo se o estudo é ex vivo ou in vivo.
Para obter resultados reprodutíveis, pré precisas e calibrações pós são críticas. A figura 6A mostra um traço representativo do sinal de visto a partir do sensor ex vivo ATP durante calibrações. Note-se que a apirase rapidamente eliminado do sinal de ATP. A catalase não teve qualquer efeito no sinal de ATP e demonstra a sua especificidade para o H 2 O 2 que cria (Figura 6B). O procedimento de calibração produz um ajuste linear que é usado para calcular as alterações dinâmicas de ATP (Figura 6A, painel direito). Em VIVO calibração do sensor produz um traçado semelhante ao do sensor ex vivo. No entanto, este sensor detecta redutiva em vez das correntes de oxidantes e, como tal, a corrente produzida é negativo. Calibração destes sensores também produz um ajuste linear numa gama de 0,3 a 80 um (Figura 7A painel da direita). Especificidade in vivo de sensor para ATP sobre outros produtos de purina é mostrado na Figura 7B.
A abordagem descrita aqui nos permite medir ambos os níveis basais de substâncias endógenas e alterações agudas em resposta à infusão de drogas 12. Mostrado na Figura 11 são Ang mudanças de concentração endógena intersticial de H 2 O 2 em ratos resistentes ao sal e sensíveis ao sal II-induzida. Para estas experiências, os rins isolados de fresco a partir de ratos Sprague Dawley (SD) ou (SS) Dahl sensíveis ao sal ratos foram perfundidos com 1 uM de Ang II sob fluxo laminar constante (650 mL / min). Como shoWN na Figura 11, a Ang II induz a libertação aguda de H 2 O 2 em rins de ratos SD e SS. No entanto, a amplitude máxima de cada resposta foi significativamente elevado em ratos SS, especialmente quando os animais foram alimentados com uma dieta de elevado teor de sal 12. Mostrado na Figura 12 é uma aplicação representativa dos biossensores in vivo. A infusão de catalase (5 ug / ml) bloqueia completamente o sinal de H 2 O 2 detectada pelo biosensor. Estas experiências ilustram a utilização de biossensores específicos, em combinação com a técnica amperométrico para a detecção de níveis basais de substâncias endógenas e medições em tempo real da sua libertação em resposta à intervenção farmacológica. Outras aplicações desta abordagem para estudar o papel da sinalização purinérgica e peróxido de hidrogênio irá melhorar o nosso conhecimento e entendimento das patologias renais, como a hipertensão sensível ao sal, boi renalidative estresse e doença renal crônica.
Figura 1. Esquema dos protocolos. Calibração com analito de interesse e testando a sua especificidade é feita imediatamente antes do inicio das experiências. O protocolo in vivo devem ser seguidas para experimentos fisiológicos complexos e ex vivo para aplicações farmacológicas. Publicar calibração experimento deve ser feito e levado em consideração durante a análise dos dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Enzimática microeletrodos sensor. Os doistamanhos de sensores utilizados para aplicações ex vivo são mostrados, 50 uM e 125 uM diâmetros. Cada sensor de fio estende-se para um tubo capilar para ligar a um conector de extremidade de ouro (não mostrado). O encarte mostra a ponta do sensor revestido com enzimas para detecção de ATP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Dual Channel potenciostato. Os canais marcados potencióstato CH1 e CH2. 1) CH1 a conexão do sensor ATP e 2) CH2 as conexões nulos sensor de conexão 3) que são acopladas electricamente ao eléctrodo de referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. Configuração do sensor. A aquisição de dados é executada em uma gaiola de Faraday para reduzir o ruído eléctrico e sobre uma mesa de laboratório de alta performance para uma superfície de trabalho livre de vibrações. 1) Uma mesa de cirurgia com controlo de temperatura é utilizado para manter a temperatura do corpo do animal durante as experiências fisiológicas 2) os micromanipuladores estão ligados a adaptadores de retenção magnética para um posicionamento flexível dos sensores durante a experiência 3) A fonte de luz é necessária para os procedimentos cirúrgicos e inserção do sensor 4 ) dual channel potencióstato 5) Suporte para os sensores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5. Voltametria cíclica. Por ex vivo estudos, sensor voltametria cíclica é realizada durante 10 ciclos entre -0,5 e 0,5 V antes de o protocolo de calibração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Calibração amperometria por ex vivo. (A) A calibração usa a adição de concentrações conhecidas de ATP para a solução de banho. Os valores correspondentes amperométricos gravados no nível asymptote (traço preto). As correntes obtidas criar uma equação de calibração. Um exemplo é mostrado no painel da direita. O traço vermelho é o current do sensor que responde a nulo apenas a adição de H 2 O 2. (B) O sensor nulo é calibrado com a adição de H 2 O 2 conhecido concentrações (setas vermelhas) à solução de banho e os valores assímptotas amperométricos são gravados (setas pretas finas). A adição de catalase para a solução do banho (espessura seta preta) resulta em deterioração rápida corrente. O painel da direita mostra a equação de calibração do sensor nulo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Calibração para amperometria;. In Vivo A calibração do in vivo eléctrodos é realizada de uma forma semelhante à que detalhada em estudos ex vivo as reacções de redução, excepto causar uma corrente inversa (polaridade). (A) A adição de concentrações conhecidas de ATP produz uma corrente no sensor amperométrico ATP (traço negro), mas não tem efeito sobre o sensor nulo (traço vermelho). A adição de apirase extingue a corrente do sensor de ATP. (B) A especificidade do sensor de ATP é confirmada pela adição de 10 uM de diferentes agentes purinérgicos (UTP, UDP e adenosina). Outras aplicações de ATP fornecer uma corrente estável amperométrica detectável. (C) Fotomicrografia dos sensores in vivo com base em um eletrodo revestido mediador ouro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figure.
Figura 8. Cups renais. Nos estudos in vivo, os rins são realizadas ainda usando os copos em aço inoxidável rim mostrados. Dois tamanhos de copos são utilizados para acomodar rim variação de tamanho. Estes copos de reduzir os artefatos de movimento que são gerados pela respiração do animal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. Ex Vivo rim isolado e perfundido. O rim isolado é colocada num prato 1) de Petri revestidas com um de espessura de Siinferior licone para inserção de pino 2) da artéria renal é canulada e ligada a uma bomba de seringa para perfusão constante durante a experiência 3) o sensor de ATP, 4) e sensor de nulo são inseridos no rim 5) o eléctrodo de referência é colocado perto do rim submersa na solução do banho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. In Vivo de sangue renal perfundido. (A) O rim esquerdo é exposto e colocado num recipiente de rim, o rim direito permanece intacto dentro do animal. Ambos os sensores são inseridos no rim. BSA: NaCl é infundido através da veia jugular cateterizada para contrariar a perda de fluido causado by o grande meados de linha de incisão (B) Exemplo do experimento in vivo com um cateter intersticial implantado para aplicações farmacológicas diretos 1) o rim é realizada por uma xícara de rim 2) sensor de ATP 3) Sensor nulo e 4) eletrodo de referência são inseridas na superfície ventral do rim 5) cateter implantado no rim e ligado a uma bomba peristáltica para infusões farmacológicos laminares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11. Análise ex vivo de H 2 sub> O 2 no rim. Ang II perfusão provoca H 2 O 2 a libertação, para o córtex de rim de rato. (A) alterações da média em tempo real de H 2 O 2 concentração (barras cinzentas mostram erro padrão) de um total de n = 8 aplicações (4 rins de ratos diferentes 4). Barras no topo representam aplicação Ang II. (B) A máxima H 2 O 2 durante os valores de amplitude de concentração de Ang II para perfusão Sprague Dawley (SD) e (SS) ratos Dahl sensíveis ao sal alimentados com dietas baixas e elevadas de sal, respectivamente. * - P <0,05 em relação ratos SD. A figura é uma adaptação da referência 12, com autorização prévia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 12. Análise in vivo de H 2 O 2. Exemplo da avaliação in vivo de H 2 O 2 intersticial concentração na medula de um rato SS alimentados com uma dieta de baixo teor de sal (tal como mostrado na Figura 10B). A aplicação intersticial de catalase por meio de um cateter implantado para o intervalo de 5 minutos produziu um bloqueio completo do sinal de H 2 O 2 na medula renal. Redução de catalase, de washout pelo fluxo sanguíneo renal, resultou em uma recuperação parcial do sinal, que foi bloqueado de novo por um aplicativo catalase adicional (10 min). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os actuais protocolos foram desenvolvidos para proporcionar maior resolução temporal e espacial da sinalização de ATP e H 2 O 2 para rins perfundido de sangue ex vivo isolados, perfundidos e in vivo. As diferenças entre os protocolos e os sensores usados aqui fornecem aquisição de dados ideal tanto para agentes farmacológicos ou estudos fisiológicos. Os protocolos consistem de 1) a calibração do sensor, 2) procedimento cirúrgico, 3) de configuração de aquisição de dados, e 4) a análise dos dados. Eles permitem que as medições em tempo real de analitos para inúmeras condições experimentais. Isso vai levar a maiores insights sobre doenças renais e o desenvolvimento de tratamentos medicamentosos mais efetivos. Aqui foram utilizados os sensores para analisar o ATP e H 2 O 2. No entanto, os sensores para outras substâncias também estão disponíveis e podem ser utilizados. Os protocolos aqui descritos foram aplicados ao estudo de ATP e H 2 O 2 em rins de ratos, mas o mesmo metod pode ser facilmente ajustado para aplicação em ratinhos. Assim, esta abordagem tem um grande potencial considerando a abundância de modelos de roedores genéticos.
O projeto básico de biossensores enzimáticos microeletrodos foi desenvolvido na década de 1960 por Clark e Lyons 2. Após o desenvolvimento inicial de biossensores, avanços foram feitos, tanto na concepção 17-19 e aplicações 20. Llaudet et al. 21,22 desenvolvido o desenho princípio dos sensores de ATP utilizados nas presentes protocolos enquanto usando métodos de Cosneir et al. 23, para o revestimento de enzima. Estes sensores de sinalização de ATP detectada num certo número de processos fisiológicos, incluindo a libertação de ATP a partir de astrócitos do cérebro 8, regulação da respiração 4,24, e no músculo esquelético arteríola regulação 25. Recentemente, o protocolo ex vivo tem sido utilizado para medir a sinalização de ATP em 12 rins. O objetivo deste manuscrito is para fornecer instruções e insights eficazes para a detecção de substâncias endógenas tais como ATP em rins.
Biossensores enzimáticos microeletrodos têm muitas vantagens sobre os meios existentes de medição de analitos in vivo. No entanto, as precauções especiais deve ser usada para esta abordagem como para qualquer outro método de novo. Validação com uma abordagem estabelecido fornece a confiança nos dados obtidos. Por exemplo, medições de microdiálise foram feitas tal como descrito anteriormente 26,27. Não se observou qualquer diferença significativa entre as concentrações de pico determinadas por os sensores e os obtidos a partir de amostras de diálise 12. A limitação de microdialysis é que ele só mede os níveis de estado estacionário de analisar. Como tal, a avaliação das alterações dinâmicas na sinalização de células só pode ser conseguido com a utilização de biossensores os microeléctrodos enzimáticas. As especificações confecção de os tempos de resposta do sensor diferem entre o sensortipos. ex vivo sensores têm um tempo de resposta de 5-10 seg e em sensores in vivo de 30-35 seg para o aumento do sinal de 10 a 90%. Os vestígios de calibração (Figuras 6 e 7) demonstraram a resolução de tempo de adição de analito / remoção. Para ambos os sensores e as abordagens de microdiálise, é necessária a utilização de enzimas específicas para bloquear o sinal produzido pelo analitos para assegurar a especificidade.
Os protocolos descritos têm vários desafios. Tal como acontece com qualquer inserção do sensor no tecido, dano tecidual ocorre. Isso pode ativar vias de sinalização que podem influenciar as medições 28. Para minimizar o dano celular, seria necessário sensores mais finas. No entanto, é difícil de penetrar a cápsula renal com as agulhas de modo sensores são usados para fazer um pequeno orifício de entrada. Sensores finas são mais susceptíveis de se dobrar e perturbar o seu revestimento sobre inserção. Sensores de maiores diâmetros são flexão mais resistente ea ResultaNT danos ao seu revestimento. A Figura 3 mostra um sensor de finos e grossos. Além disso a resistência do sensor de espessura à flexão, que contêm uma camada mais espessa de revestimento, proporcionando uma maior protecção para a camada enzimática. A preocupação de danos nos tecidos causados pela utilização de sensores de espessura foi consideravelmente menos em rins do que seria no tecido cerebral. A profundidade de inserção é aproximado e colocação final deverá ser verificada após medições sobre o rim estão concluídas. Estimativa entre as camadas córtex e medula usando o comprimento ponta do sensor como uma guia de inserção e é suficiente como a ponta do sensor é de 0,5 mm eo córtex renal é de 2-3 mm de espessura. Incrustações de o sensor também ocorre a uma velocidade maior no sangue, limitando assim a utilização do sensor em longa em protocolos in vivo para um experimento. Gravar tempos de 1 a 1 ½ h resultou em apenas um pequeno desvio do sensor. Os principais critérios ao avaliar a redução do desempenho do sensor é a baixa sensibilidadepara o analito durante o processo de calibração. O ruído e a instabilidade da corrente eléctrica da linha de base aumentou também pode indicar que a ponta do sensor está danificado. Para medições precisas de ATP, ambos os sensores (ATP e null) deve ter características de estabilidade e ruído semelhante para subtracção do sinal. Caso contrário, um dos sensores deve ser substituído. Por baixo ruído e detecção de pequenas concentrações da substância a analisar, é sugerido o uso de novos sensores para cada animal.
Vários passos são cruciais para os resultados experimentais de sucesso. Os sensores são muito frágeis e devem ser manuseados com cuidado para evitar danificar a ponta do sensor. Além disso, após rehidratação, os sensores não devem ser expostos ao ar por mais do que 20 seg. Gravações de ruído são necessários para o êxito da detecção de sinais biológicos em tecidos. Para o efeito, é necessária uma mesa de ar do laboratório de alta performance e aterramento elétrico adequado. A adição de quantidades exatas de analito during as etapas de calibragem é necessária para a determinação da concentração exacta em experiências. Conseguir uma boa limpeza do rim em cirurgias renais ex vivo resultará em gravações bem sucedidas. O uso de enzimas catalase e apirase em calibrações e em experiências permite a avaliação da sensibilidade do sensor não específica e confirma as medições.
Estes protocolos proporcionam muito maior detalhe de sinalização extracelular em rins. O maior sensibilidade e resolução temporal proporcionada pelos sensores podem nos permitir resolver alterações no ATP de sinalização em estados de doença e seguintes manipulação farmacológica que eram anteriormente indetectável. O protocolo in vivo é bem adequado para estudos fisiológicos complexos enquanto ex vivo é ideal para o estudo de aplicações farmacológicas em rins. O design do sensor in vivo utilizado aqui permite a resistência sem precedentes contra interferência em bltecido ood-perfusão. Tomados em conjunto, estes sensores oferecem uma grande quantidade de aplicações que previamente não eram possíveis com os protocolos e técnicas existentes.
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Disclosures
Sensores para a gravação do vídeo deste manuscrito foram fornecidas pela Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Reino Unido).
Acknowledgments
Agradecemos Sarissa Biomedical por seu trabalho no desenvolvimento dos sensores usados no presente manuscrito. Esta pesquisa foi suportada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122662 (A. Staruschenko e A. Cowley), um projeto financiado pelo Medical College of Comitê de Assuntos de Pesquisa Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e Avançando um Programa de Pesquisa e Educação saudável Wisconsin # 9520217, eo Young Investigator Grant do National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
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