Introduction
4 -식이 지방과 지용성 약물과 비타민의 장내 흡수 연구는 림프 누공 모델 1을 사용하여 생체 내에서 수행 할 수있다. 그러나 관련된 수술 기법은 도전뿐만 아니라 비용이 많이 드는되지 않습니다. 생체 이용 될 수 분변 분석에 기반 방식이지만, 이들은 위장관 2,5- 의해 흡수 퍼센트를 결정 주로 사용된다. 이 문서에 설명 된 체외 모델은 비용 효과적이며, 관련 기술은 틀림없이 덜 도전이다. 유전자 변형 연구는 시간이 많이 걸리는 사람들이 체외 모델을 사용하여 수행 할 때 더 경제적이고 저렴합니다.
장 세포에 의해 흡수되는 지용성 물질 지단백질 -6,7-로 포장되어 있기 때문에, 리포 단백질을 생산하기 위해이 시험 관내 모델의 효과는 매우 중요하다. 두 가지 주요 intestinaL 지단백질은 카일로 마이크론과 매우 저밀도 지단백질 (VLDL)입니다. 지질은 위장 루멘에 풍부하게 존재하는 경우 직경이 80 nm 이상과 지질 단백질로 정의 카일로 마이크론은, 소장에 의해 엄격하게 생산된다. 그들이 가장 큰 지단백질이기 때문에, 카일로 마이크론은 생각할 가장 효율적인 지질 수송이다. 킬로 미크론 (8)을 제조 할 수있는 이러한 시험 관내 모델은,식이 지방 흡수에 의한 소화관 지용성 비타민의 흡수 및 지용성 약물 경구 생체 이용률을 연구하는데 사용될 수있다. 지단백질 분획에 지용성 분자, 비타민, 또는 약물의 존재는 소장 흡수하여 자신의 지표이다. 전술 한 바와 같이,이 모델은 경구 지용성 약물 생체 이용율 (6)을 향상 시키는데 사용될 수있다.
이 논문은 카코 2 세포 투과 막 또는 일반 조직 배양 접시, 어떻게 지질 마일에서 유지되어야한다 방법을 설명합니다지질 단백질 생산을 자극 xture는 렌티 바이러스 발현 시스템이 효율적인 과발현을 달성하기 위해 이용 될 수있는 방법을 준비해야하며, 절연 지단백질은 어떻게 분석되어야한다.
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Protocol
카코 2 셀 1. 유지 보수
- 일반 조직 배양 접시를 사용하여
- (FBS를 37 ℃의 수조에서 바이알을 배치하여 냉동 바이알로부터의 카코 -2 세포를 해동하고, 즉시 예열 된 성장 배지 (15 % 소 태아 혈청 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 추가 ) 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM))에서.
- 카코 -2 세포 50~70% 합류점에 도달 한 경우, 이들을 1 분할 : 그들은 분리 될 때까지 37 ℃에서 0.05 % 트립신 / 0.53 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 3 ㎖와 함께 세포를 배양하여 6 (15 분) . 세포 응집을 방지 부드러운 피펫 팅하여 세포를 여러 번 혼합합니다. 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 세포를 트립신 0.5ml를 추가.
- 부드럽게 좌우 방향으로 이어 전후 방향으로 요리를 여러 번 흔들어. 요리를 소용돌이 피으로는 불평등 한 세포 분산 될 수 있습니다.
- 5 % CO 2와 함께 제공되는 37 ° C의 배양기에서 평평한 표면에 요리를 놓습니다. 경사면은 불평등 세포 분산 될 수 있습니다.
- 배양을 시작한 후 성장 미디어에게 일을 변경합니다.
- 세포를 모니터링하고 그들이 합류에 도달 하루를 기록한다. 셀들이 분할 일로부터 합류에 도달하는 것은 약 1 주일 정도 걸릴 것이다.
- 세포가 합류에 도달하기 전에 일주일에 두 번 성장 미디어를 변경합니다. 세포가 합류에 도달하면, 매일 성장 미디어를 변경합니다. 세포가 7 일 후 합류 한 후 매일 성장 미디어를 변경합니다.
주 :이 13 일 후 합류 (그림 1) 때 세포 실험에 대한 준비가되어 있습니다. 세포는 결국 지질 단백질 생산에 덜 효과적이 될 것이기 때문에, 8 포스트 합류 13-17 - 일 사이에 세포를 사용합니다. 실험을 수행하는 방법에 대한 3 단계로 이동합니다.
- (FBS를 37 ℃의 수조에서 바이알을 배치하여 냉동 바이알로부터의 카코 -2 세포를 해동하고, 즉시 예열 된 성장 배지 (15 % 소 태아 혈청 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 추가 ) 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM))에서.
- 투과 막 시스템을 사용하여
- 단계 1.1.1.1에 기재된 투과성 막 인서트 카코 -2 세포를 시드. 위. 자신의 휴대 성장 (회복 기간) 일반적으로 느린 때문에 냉동 유리 병에서 세포를 사용하지 마십시오. 간단히, 미리 예열 성장 배지 10 ㎖를 포함하는 혀끝 챔버 (상단 구획)에 트립신 세포의 0.5 ml를 추가합니다. 또한, 기저 챔버 (낮은 구획)에 미리 예열 성장 배지 10 ㎖를 추가합니다.
참고 : 가장 좋은 방법은, 기저 챔버 먼저 다음 혀끝 챔버로 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. 이전 용지를 제거 할 때, 혀끝의 미디어하기 전에 기저 용지를 제거합니다. 이 막 파열 될 수 있으므로 폴리 카보네이트 막 파고하지 마십시오. - 인하여 폴리 카보네이트 막을 통해 열악한 셀 가시성 유사한 밀도 정규 조직 배양 접시에 카코 -2 세포를 시드 및 셀 합류 판단이 접시를 사용한다.
- 의에 따라TEPS 1.1.2-1.1.6 위.
- 단계 1.1.1.1에 기재된 투과성 막 인서트 카코 -2 세포를 시드. 위. 자신의 휴대 성장 (회복 기간) 일반적으로 느린 때문에 냉동 유리 병에서 세포를 사용하지 마십시오. 간단히, 미리 예열 성장 배지 10 ㎖를 포함하는 혀끝 챔버 (상단 구획)에 트립신 세포의 0.5 ml를 추가합니다. 또한, 기저 챔버 (낮은 구획)에 미리 예열 성장 배지 10 ㎖를 추가합니다.
2. 유전자 과발현
- 일반 형질 전환 방법을 사용하여
- 상술 1.1.1.1.-1.1.4에 기술 된 바와 같이 조직 배양 접시에 카코 -2 세포를 시드.
주 : 세포가 40-50 %의 컨 플루 언트 될 때, 형질 감염이 될 준비가된다. - microcentrifuge 관에서 감소 된 혈청 미디어의 472 μL에 형질 전환 시약의 67 μl를 추가합니다. 튜브 벽 희석 형질 전환 시약의 접촉을 피하십시오.
- pLL3.7 23 μg의이 형질 전환 시약 / 감소 혈청 미디어 혼합물에 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 9 향상된 추가합니다.
- RT에서 20 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
- DMEM에 10 % FBS 8 mL로 카코 2 세포의 성장 매체를 교체합니다.
- 드롭 현명한 접시에 DNA / 형질 전환 시약 / 감소 혈청 미디어 혼합물을 추가합니다.
- 조심스럽게 앞으로 바에서 요리를 여러 번 흔들어좌우 방향으로 이어 ckward 방향.
- 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 배양을 시작한 후 성장 배지 10 ml의 하루 접시에 미디어를 교체합니다.
- 유전자 발현을 모니터링합니다.
- 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 얼룩없이 유전자 발현을 모니터한다. 형광 현미경을 사용하여, 녹색 세포의 비율을 결정한다. 비율은 형질 전환 효율을 나타낸다.
- DAPI 염색과 유전자 발현을 모니터링합니다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세포를 씻으십시오.
- PBS (RT에서 10 분 동안 배양)에서 4 % 포름 알데히드를 10 ㎖를 첨가하여 세포를 고정.
- PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
- DAPI (500), 1 % BSA, 0.01 %의 디기 토닌 : 1을 함유하는 PBS의 8 mL를 실온에서 15 분 동안 어둠 속에서 세포를 배양한다.
- PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
- 유형광 현미경을 노래 블루 (그림 2 상단 패널) 된 것을 녹색 / 청색 상대적 세포의 수를 결정한다. 계산 된 비율은 형질 감염 효율을 나타낸다.
- 상술 1.1.1.1.-1.1.4에 기술 된 바와 같이 조직 배양 접시에 카코 -2 세포를 시드.
- 렌티 바이러스 과발현 시스템 (10)을 사용하여
- 15cm 조직 배양 접시에 씨앗 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포 (DMEM에 10 % FBS 성장 매체로).
주 : 세포가 60-70 %의 컨 플루 언트 될 때, 형질 감염이 될 준비가된다. - microcentrifuge 관 (11)에 감소 된 혈청 매체의 1,133 μL에 형질 전환 시약 162 μl를 추가합니다. 튜브 벽 희석 형질 전환 시약의 접촉을 피하십시오.
- 추가 24 pLL3.7 eGFP는 (또는 다른 구조물)의 μg의 15.6 레브 반응 요소 μg의 (RRE) REV 6.0 μg의 한 형질 감염 시약 / R로 포성 구내염 바이러스 당 단백질 8.4 μg의 (VSVG)educed 혈청 미디어 혼합물.
- RT에서 20 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
- DMEM에 10 % FBS 16 mL로 성장 매체를 교체합니다.
- 드롭 현명한 접시에 DNA / 형질 전환 시약 / 감소 혈청 미디어 혼합물을 추가합니다.
- 부드럽게 좌우 방향으로 이어 전후 방향으로 요리를 여러 번 흔들어. 이 시점에서 분리 HEK293T 세포의 일부를 참조하는 정상이다.
- 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 배양 24 시간 후, 성장 배지 25 mL를 접시에 미디어를 교체합니다.
- 다음 날, 렌티 바이러스 (제 컬렉션) 함유 증식 배지를 수집한다.
- 단계를 반복 2.2.10 더 렌티 바이러스 (두 번째 컬렉션)를 수집합니다.
- (5 분 동안 2,500 XG) 제 1 및 제 2 집합을 수영장, 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거한다.
- 일회용 병 톱 필터 (0.45 μm의 기공)과 컬렉션을 필터링하고,RT (JA-20 로터)에서 2 시간 동안 31,400 XG에서 컬렉션을 원심 분리하여 바이러스를 농축시킨다. 펠렛이있는 원심 분리 튜브의 하단을 표시한다. 상등액을 경사 분리하고, 약 15 분 동안 RT에서 반전 튜브를 떠난다.
- 1X PBS 100 ㎕와 바이러스 - 함유 펠렛을 재현 탁. 거품을 피하십시오.
- -80 ° C에서 집중 바이러스를 저장합니다. 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
- 적정에 의해 카코 2 세포를 형질 도입에 필요한 바이러스의 최적의 양을 결정합니다. 비용을 절약하기 위해, 24 웰 플레이트 (물론 성장 미디어 / 0.3 ml)을 대신 적정 10cm 조직 배양 접시를 사용합니다.
- 농축 된 바이러스의 양을 증가시키는 추가의 (0, 1, 2, 5, 10, 25, 50 μL / 웰) 40~70% 합류 카코 -2 세포에 폴리 브렌 (최종 농도 = 5 μg의 / ㎖)으로 보충. 1.1.2에 설명 된 바와 같이 부드럽게 24- 웰 플레이트를 흔들어.
- 자신의 유전자 발현 모니터 (단계 2.1.10를.) (그림 2 바닥4 패널).
- 형질 전환 유전자의 발현은 일반적으로 유지되어 있기 때문에, 미래의 실험 형질 세포를 유지하고 지속적으로 유전자 발현을 모니터한다 (단계를 2.1.10.).
- 15cm 조직 배양 접시에 씨앗 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포 (DMEM에 10 % FBS 성장 매체로).
3. 지단백질 분비를 자극
- 일반 조직 배양 접시를 사용하여
- 올레산 50 ㎎, 레시틴 40 mg의 나트륨 타우로 콜산 48 mg을 혼합하여 100X 지질 혼합물을 제조한다. (8 요리에 대한 충분한) PBS로 900 μL에 볼륨을 가져와. 적극적으로 지질 혼합물을 소용돌이.
- 성장 미디어의 89.1 ml의에 100X 지질 혼합물의 900 μl를 추가합니다. 혼합 및 지질 함유 미디어를 필터링 할 수 있습니다. 올레산, 레시틴, 및 나트륨 타우로 콜산의 최종 농도 (1X)는 2.0mm의 1.36 mm의 각각 1.0 mm의이다.
- 세포에 지질 함유 미디어의 10 ML을 추가합니다.
- (37)에서 4 시간 동안 지질 함유 매체를 사용하여 세포를 품어C 배양기를 °.
- PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
- 지질 단백질의 분비를 수집 세포 성장 배지 10 ㎖를 추가한다.
- 37 ° C 배양기에서 2 시간 동안 품어.
- 지질 단백질 함유 미디어를 수집합니다.
- 투과 막 시스템을 사용하여
- 단계에 따라 3.1.1-3.1.2 지질 혼합물을 제조.
- 혀끝 챔버 지질 함유 미디어 10 ㎖ 및 기저 챔버로 성장 매체의 10 ML을 추가합니다.
- 37 ° C 배양기에서 4 시간 동안 품어. 기저 챔버에서 지질 단백질 함유 미디어를 수집합니다.
4. 지단백 분리 (그림 3)
- 원심 분리 (5 분 2,000 XG)에 의해 지질 단백질 함유 매체에서 세포 파편을 제거합니다.
- 50 ㎖ 튜브에 미디어를 가만히 따르다.
- 미디어에 염화나트륨 5.95 g을 넣고.
- SA의 경우mple이 TEM에 의해 분석되며, 지단백질의 무결성을 유지하기 위해 1, 프로테아제 억제제 칵테일 정제를 추가한다.
- 물 23 ㎖의에 볼륨 (1.2 ㎍ / ㎖의 NaCl 농도 솔루션)를 준비한다.
- 완전히 용질을 녹여.
- 폴리 카보네이트 초 원심 분리기 튜브에 모든 용액을 경사 분리한다.
- 부드럽게 0.5 ml의 물 (1.0 ㎍ / ㎖ 농도)와 1.2 ㎍ / ㎖ 밀도 솔루션을 오버레이.
- 부피 중량이 아닌 튜브를 균형.
- 조심스럽게 T865 회 전자에 튜브를로드합니다.
- 4 ℃에서 24 시간 동안 429,460 XG에서 초 원심 분리기에서 샘플을 스핀.
- 즉시 부드러운 피펫으로 최고 0.5 ml의 솔루션을 격리 할 것. 가능한 한 여전히 튜브를 유지합니다.
5. TEM 분석
- (W / V) 및 6.0의 pH를 조절 2 % 포스 포 텅스텐 산을 5 ml를 준비한다.
- (0.2 ㎛의 공극 크기) 주사기 필터와 2 % 인 텅스텐 산 필터.
- 멸균 접시에 지질 단백질 샘플의 20 μl를 삭제합니다.
- 다음 같은 접시에 샘플로 필터링 2 % 인 텅스텐 산의 20 μl를 삭제합니다.
- 조심스럽게 무딘면이 샘플에 휴식과 EM 그리드를 놓습니다.
- 1 분 동안 실온에서 품어.
- 조심스럽게 그리드에서 샘플을 제거하기 위해 필터 종이에 EM 그리드의 측면을 누릅니다.
- 조심스럽게 무딘면이 2 % 인 텅스텐 산에 휴식과 EM 그리드를 놓습니다.
- 1 분 동안 실온에서 품어.
- 조심스럽게 그리드에서 포스 산을 제거하기 위해 필터 종이에 EM 그리드의 측면을 누릅니다.
- TEM을 사용하여, 지단백질 (도 4)의 이미지를 캡쳐.
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Representative Results
1 표시 정상 13 일 이후 합류 카코 2 세포를 그림. 돔형 구조 및 세포 내 지질 액 적의 모습 분화 카코 -2 세포의 특성이다. 카코 2 세포를 파종시에 동일하게 분산되지 않을 때, 그들은 덩어리와 접시의 특정 지역에서 자라다 것이다; 어떤 세포없이 접시에 몇 가지 영역이 될 것입니다. 소용돌이 경사면에 접시를 배치하는 것은 피해야한다. 이 후 합류 카코 2 세포가 새로운 성장 미디어가 너무 약 세포에 추가 될 때 초연에 더 취약 참고하는 것도 중요하다. 따라서, 새로운 미디어는 세포 분리를 방지하기 위해 부드럽게 추가해야합니다.
이러한 연구에 기초하여, 카코 -2 세포의 형질 전환 효율은 30~60% (도 2 상단 패널) 사이였다. 대조적으로, 렌티 바이러스 발현 시스템을 이용 카코 -2 전달 효율은 약 100 %였다 (도 2 그림 2는 농축 된 렌티 바이러스의 최적 량은 10 μL였다. 형질 카코 -2 세포는 12 계대까지 유지 하였다. 도시 된 바와 같이, 후에도 12 유로 형질 세포는 여전히 eGFP는 표현. 전달 효율은 명확하게 렌티 바이러스 농도에 따라 달라집니다. 형질 감염 / 형질 도입 효율의 확인은 중요하고, 실제의 실험에 앞서 예비 분석 루틴으로 수행되어야한다. 웨스턴 블롯 분석은 유전자 발현의 퍼센트 증가를 추정하는데 사용될 수 있지만, 형질 감염 / 형질 도입 효율을 결정하는 기본 방법이어야한다.
염화나트륨 밀도 구배 초원 심법 (도 3)를 사용하여, 카코 -2 세포에 의해 분비 된 지단백질은 절연 및 TEM 분석 하였다. 킬로 미크론의 일부는보다 큰 직경 80 nm의 지질 단백질,도에 도시 된4. 작은 지질 단백질, VLDLs도 참석했다. 또한 TEM에 모두 킬로 미크론과 VLDLs의 성공적인 분리를 확인하는 것이 필수적이다. 이전에 8을 설명하고있는 바와 같이, 생화학 분석은 확인의 기본 방법이어야한다. 리포 단백질의 부재는, 구체적으로 암죽 미립, 카코 -2 세포에 의한 지질 수송은 비효율적임을 나타낸다. 결과적으로, 그들은 지질 수송을 연구하는 좋은 모델이 될 수 없습니다. 지단백질 입자의 총 수를 기준으로 카이로 미크론 입자의 수는 8 카운트 될 수있다. 높은 비율의 효율적인 지질 전송을 나타냅니다.
그림 13 일 이후 합류 카코 2 세포의 1. 대표 현미경 사진. 세포 내 지질 방울은 일부 세포 (빨간색 화살표)에서 볼 수 있습니다. 독특한 돔 모양의 구조 (검은 색 화살표) FO일부 카코 2 세포에 의해 rmed는 세포가 합류에 도달 한 후에 만 일반적으로 존재한다. 배율 = 100X는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 지질 계 형질 감염의 효과 및 렌티 바이러스 발현 시스템 2. 비교 상판 :. 카코 -2 세포는 비 - 리포좀 형질 감염 시약 (눈금 막대 = 20 μm의)을 사용 pLL3.7 eGFP는 함께 형질 감염시켰다. 하단 패널 4 : 카코 -2 세포 pLL3.7 eGFP는이 농축 된 렌티 바이러스 (LV)의 변화량 (1, 2, 5, 10 μL)를 렌티 바이러스 발현 시스템을 이용하여 형질 도입시켰다. 표시 셀은 원래 형질 세포의 12 번째 유로로부터 있었다. 왼쪽 패널은 DAPI 염색을 보여, 중간 파넬스은 GFP 형광을 보여주고, 우측 패널은 병합 된 이미지를 나타낸다. 렌티 바이러스 발현 시스템은 분명히 지질 기반 형질보다 더 효과적이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
염화나트륨 밀도 구배 초 원심 분리를 이용하여 장내 지단백질도 3은 격리. 지단백질 - 함유 매체의 밀도는 염화나트륨 적당량 첨가하여 g / mL를 1.2로 조정한다. 그 붕괴를 방지하기 위해 전체 초 원심 튜브를 채울 수 있도록 시료의 부피는 또한 조절 될 필요가있다. 밀도 구배를 달성하기 위해, 물을 0.5 mL의 1.2 g / ml의 밀도 용액에 부드럽게 중첩된다. 샘플은 다음 T865을 사용하여 24 시간 동안 429,460 XG에 굴릴회 전자 (2.15 Svedberg 단위에 해당). 장 지질 단백질 즉시 부드러운 피펫 팅하여 복구 할 수 있어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
카코 -2 세포에 의해 생성 지단백질의 대표도 4의 전자 현미경 사진. 염화나트륨 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 단리 지단백질 부정적인 2 % 인 텅스텐 산 (PH 6.0)으로 염색 하였다. 암죽 미립은 지질 입자보다 큰 직경 80 nm의 한 VLDLs 이러한 80nm보다 작은 양으로 존재한다. 스케일 바 = 100 nm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 논문에서는 사용될 수 개의 시스템 카코 -2 세포, 즉, 정규 조직 배양 접시 투과 막을 기재되어 유지한다. 투과성 막 시스템을 사용할 때의 이점은 정점의 분리 및 기저 외측 구획하고, 지질 혼합물을 배양하는 동시에 지단백질 분비를 수집하는 기능을 포함한다. 다만, 투과 막 인서트 비싸고, 그 폴리 카보네이트 막 좋은 셀 가시성을 허용하지 않는다. 이 시험 관내 모델의 장점 중 하나는 유전자 조작 연구가 더 경제적이고 덜 시간 소모적이 될 것이라는 것이다. 더 나은 효과를 위해, 렌티 바이러스 발현 시스템이 사용되어야한다. 형질 카코 -2 세포는 일반적으로 자신의 유전자의 발현을 유지한다.
암죽 미립을 제조하기는 Caco-2 세포의 능력은 매우 중요하다. 이 기능이 없으면, 카코 2 세포는 efficie 할 수 없을 것입니다ntly, 친 유성 물질을 수송 포함하지만 liphophilic 약품, 비타민 A, D, E, K 및, 임의의 지용성 영양소에 한정되는 것은 아니다. 적절한 방법은 VLDL 입자와 카일로 마이크론 모두 설명되어 생산 카코 2 세포에 도전합니다. 이러한 지단백질 입자의 성공적인 분리는 TEM에 확인한다. 14 - 현재의 문헌에 의하면,이 카코이 모델은 다른 카코 2 모델 (12) 중 가장 효율적인 지질 수송을 제공한다. 그러나, 생체 내 림프 삽관 모델은 여전히보다 효율적으로 어떤 체외 모델보다 지질을 전송합니다. 근본적인 이유는 최근 카코 -2 세포는 Caco-2 세포는 모노 글리세리드에서 트리글리 세라이드를 합성 할 수, 아포지 단백질 B의 2 가지 이성체를 생성하고, 카이로 미크론의 생합성에 중요한 혈청 성분이 성장 배지에서 낮을 수 즉 때문에,도 8에 대해 논의 된 . 그것은이의 제한을 실현하는 것이 중요체외 모델; 이 체외 모델은 소화관 운동성, 창자의 해부학 및 기타 기관 시스템과의 상호 작용과 같은 몇 가지 잠재적 인 중요한 요인을 제외한다.
카코 -2 세포 암죽 미립을 제조 할 수 있도록 주요 요인은 효율적으로 사용될 지질 및 세포 분화 (8)의 종류 / 양이다. 이러한 요소의 적절한 조합없이, 카코 -2 세포는 킬로 미크론 (8)의 상당수를 생성하지 않을 것이다. 참고로, 염화나트륨 밀도 구배 초 원심 분리가 제대로 수행해야합니다. 지질 단백질의 성공적인 분리는 (상당한 지연없이 즉시) 타이밍에 따라 처리 좋은 샘플 (많은 동요하지 않고 튼튼한), 및주의 피펫 팅 (만 상단 층을 받고). 적절한 기술은 지단백질 층 (8)을 시각화하기 위해 미리 염색 지질을 사용하여 실시 될 수있다. TEM 외에도, 생화학 적 분석, 즉, 아포 지단백 B와 중성 지방 분석, 또한 U가 될 수 있습니다지단백질의 성공적인 분리를 확인 나오지. 우리가 이전 8보고 한이 생화학 적 분석은 또한 흡수를 정량화의 방법이 될 수 있습니다. 그러나, TEM 여전히 카이로 미크론 생산의 전위 과대 원인이 응집을 지단백질의 경향 때문에 수행되어야한다.
이 체외 모델은식이 지방 흡수와 친 유성 약물, 비타민 및 기타 지용성 영양소의 장내 흡수를 공부에 특히 유용하다. 또한 친 지성 약물의 경구 생체 이용률이 불량한을 향상 모델이 될 수있다. 지용성 물질 순환에 전송을 위해 장 세포에 의해 카일로 마이크론로 포장되어 있기 때문에, 유미 미립 생산 카코 2 세포는 친 유성 약물 흡수에 더 효율적입니다. 또한,이 모델은 조사자 거트 (약물 유전학)에 의한 약물 흡수에 특정 유전자의 역할을 결정할 수있다. 이 글은 다음 언어로도 할 수 있습니다vestigators 구강 친 유성 약물의 생체 이용률에 다양한식이 지방의 효과를 비교합니다. 이러한 응용 프로그램은 모두 이전에 6 논의되었다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
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- Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
- Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
- Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
- Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
- Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
- Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
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- Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
- Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).
