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कर्णावत सेल अध: पतन उत्प्रेरण के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय तकनीक: ototoxic एजेंट प्रसव के लिए माउस राउंड खिड़की दृष्टिकोण

Published: November 26, 2015 doi: 10.3791/53131
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Sciences, Medical University of South Carolina, 3Intuitive Surgical, Inc

Introduction

जांचकर्ता श्रवण प्रणाली के सामान्य कार्य के साथ ही सुनवाई हानि के pathophysiology अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल की एक विस्तृत सरणी का इस्तेमाल किया है। इन मॉडलों को भी विभिन्न वैकृत प्रक्रियाओं के खिलाफ हस्तक्षेप अध्ययन के संचालन के लिए अत्यधिक उपयोगी होते हैं और मानव विषयों में translational अनुप्रयोगों के लिए नींव के रूप में सेवा करते हैं। कोक्लीअ और उसके संबंधित श्रवण रास्ते से जुड़े ज्यादातर अनुसंधान के लिए, क्षति या विघटन के कुछ डिग्री व्यवस्था करने के लिए पेश किया जाना चाहिए। अक्सर, नुकसान जानबूझकर जांचकर्ताओं सामान्य कार्य पर कि घाव, साथ ही यह से उबरने के लिए कर्णावत क्षमता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, एक विशिष्ट घाव पैदा करने के उद्देश्य से है। नुकसान को शुरू करने के लिए एक विशेष जानवर मॉडल और / या तकनीक (एस) का चयन करते हैं, कारकों की एक संख्या सबसे अच्छा संभव परिणाम प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। एक तकनीक का प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष प्रभाव हो सकता है, जबकि विभिन्न पशु मॉडल, हस्तक्षेप करने के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया हो सकती हैवांछित परिणाम के लिए पूरी तरह से हानिकारक। ज्यादातर मामलों में, आदर्श भीतरी कान क्षति प्रोटोकॉल तेजी, प्रणालीगत विषाक्तता से बचने और मज़बूती से क्षति का उत्पादन, एक सटीक और सुसंगत घाव बनाने के लिए, और, कार्यात्मक सेलुलर और आणविक परिवर्तन के आगे के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए survivable होगा। आदर्श रूप में, इन तरीकों में भी संभव सबसे बड़ी हद तक कोक्लीअ के नाजुक माइक्रोआर्किटेक्चर और विद्युत ढ़ाल रक्षा करेगा।

तिथि करने के लिए, जांचकर्ताओं भीतरी कान चोट प्रेरित करने के लिए तकनीकों का एक नंबर स्थापित करने में सफल रहा है। इनमें से अधिकांश या तो प्रणालीबद्ध या शल्य दृष्टिकोण के माध्यम से एक ototoxic एजेंट को कोक्लीअ को उजागर करना पड़ेगा। तकनीक perilymphatic छिड़काव के साथ पैरेंट्रल इंजेक्शन, इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन, ट्रांस-मध्य कर्ण इंजेक्शन, अन्त: कर्णोदकीय थैली इंजेक्शन, और cochleostomy शामिल हैं। इन तकनीकों में इस तरह के furosemide, जेंटामाइसिन, ouabain, और heptanol रूप ototoxic एजेंटों की एक किस्म को पेश करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। 1-5विशिष्ट कर्णावत घावों बनाने में सफल है, जबकि ऊपर की तकनीक भी सीमाओं को स्वीकार किया है। प्रणालीगत इंजेक्शन जानवर को अत्यधिक विषाक्त हो सकता है और अनायास ही कर्णावत अपमान और असंगत परिणामों के साथ जुड़ा हो सकता है। उत्तरार्द्ध कमी भी ट्रांस-मध्य कर्ण इंजेक्शन के साथ संबद्ध किया गया है। ऐसे cochleostomy और perilymphatic छिड़काव के रूप में तकनीक, तेजी से और अत्यंत विश्वसनीय घावों उत्प्रेरण के लिए सक्षम है, जबकि भीतरी कान की संरचना और कार्य करने के लिए सीधे आक्रामक हैं। शल्य दृष्टिकोण के कई लोग भी तकनीकी कठिनाई का एक उच्च डिग्री के साथ जुड़े रहे हैं और इस तरह के एक micropump Infuser के रूप में पशु में विदेशी वस्तुओं, छोड़ने की आवश्यकता हो सकती है। 2-4,6-8 कोई भी तकनीक कमियों से मुक्त है, और जांचकर्ताओं का चयन करना होगा तरीकों को ध्यान से उनकी प्रयोगात्मक जरूरतों को फिट करने के लिए। यहाँ, हम विस्तार में, वयस्क चूहों में ototoxic एजेंटों की सामयिक वितरण के लिए, गोल खिड़की आला (RWN) आवेदन तकनीक का वर्णन है।

फाईएक एवियन मॉडल में संवेदी बाल सेल अध: पतन पर जेंटामाइसिन के प्रभाव का अध्ययन करते हुए आरएसटी 1998 में अल HUSMANN एट द्वारा वर्णित है, इस तकनीक से जुड़े विषाक्तता से परहेज करते हुए, प्रणालीगत जेंटामाइसिन आवेदन की तुलना में काफी अधिक विश्वसनीय घावों के उत्पादन में सक्षम होना पाया गया। 9 तब से, एक हमारी प्रयोगशाला सहित अन्य जांचकर्ताओं की संख्या, महान सफलता के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है। 2004 में, Heydt एट अल। एक माउस मॉडल करने के लिए इसे अनुकूलित और जेंटामाइसिन की सांद्रता बदलती में भिगो absorbable जिलेटिन स्पंज के साथ RWN भरने से घाव आकार को नियंत्रित करने के लिए एक बढ़ाया क्षमता का वर्णन किया। 10 एट अल।, 2010 में, बीटा-Bungarotoxin की ototoxic प्रभाव का अध्ययन Palmgren, एक शक्तिशाली ताइवान के जहर में तत्व वयस्क चूहों के RWN करने के लिए यह एक जलीय प्रपत्र को लागू करने से, टोकरा बंधी। 11 इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला से पिछले अध्ययनों में से एक नंबर furosemid की ototoxic प्रभाव का अध्ययन करने के लिए गोल खिड़की दृष्टिकोण का उपयोग किया हैई, ouabain, और heptanol। इन अध्ययनों के 5,6,12-15 परिणाम कर्णावत तरल पदार्थ और सामान्य सुनवाई पर आयन homeostasis के महत्व का प्रदर्शन किया है, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि और कर्णावत पार्श्व दीवार में सेल proliferative क्षमता की खोज की है, और के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाया उम्र से संबंधित सुनवाई हानि।

निम्नलिखित दृष्टिकोण शल्य चिकित्सा द्वारा एक postauricular चीरा और बोनी मध्य कर्ण बुल्ला की आंशिक unroofing के माध्यम से मध्य कान तक पहुँचने शामिल है। यह एक चयनित ototoxic एजेंट सीधे लागू किया जा सकता है जो करने के लिए RWN और झिल्ली के उत्कृष्ट प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है। तरल एजेंट तो RWN के कप की तरह खोखला में पूल (या धीरे-धीरे RWN में पैक एक संतृप्त absorbable जिलेटिन स्पंज वाहक से नालियों) और कर्णावत बरोठा की perilymphatic अंतरिक्ष में गोल खिड़की झिल्ली के माध्यम से diffuses। कोई प्रत्यक्ष cochleostomy इस दृष्टिकोण में किया जाता है। इस तकनीक का लाभ भीतरी कान माइक्रोआर्किटेक्चर, परिहार के संरक्षण में शामिलइंट्रा-पशु नियंत्रण कान के प्रणालीगत विषाक्तता, भत्ता की, प्रभाव के शीघ्र शुरू होने, कुछ कर्णावत प्रकार की कोशिकाओं में चयनात्मक अध: पतन (जैसे।, प्रकार मैं ouabain जोखिम और कर्णावत प्रकार heptanol के उपचार से प्रेरित द्वितीय fibrocytes साथ नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स सर्पिल), और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य / विश्वसनीय परिणाम है। इस तकनीक चूहों, गिनी सूअरों, और gerbils सहित अन्य कृंतक प्रजातियों के बीच कुछ परिवर्तन के साथ लागू किया जा सकता है। कमियां एक खड़ी तकनीकी सीखने की अवस्था और समय में एक ही बात करने के लिए विवश है कि ototoxic अपमान के रिश्तेदार सीमा में शामिल हैं।

Protocol

पशु अनुसंधान के सभी पहलुओं उचित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित की गई। यहाँ वर्णित सभी कशेरुकी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं दक्षिण कैरोलिना (MUSC) संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के चिकित्सा विश्वविद्यालय (IACUC) के दिशा निर्देशों के तहत अनुमोदित किया गया।

1. मॉडल चयन

  1. उपयोग के लिए तैयार है जब तक संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार दिनचर्या caretaking साथ एक कम शोर मछली पालने का बाड़ा में पशु मॉडल बनाए रखें। पशु अनुसंधान सुविधाएं (ARFs) में, एनआईएच मानकों को पूरा करने वाले कंपन स्थिरता, शोर भिगोना, प्रतिदिन प्रकाश, प्रस्तुत करने का स्थान है, सतह खत्म, सील और caulking, और वेंटिलेशन बनाए रखें।
    नोट: ARFs और एक कम शोर मछली पालने का बाड़ा के रखरखाव के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशा-निर्देशों पर समीक्षा की जा सकती है: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
  2. सभी प्रयोगों के लिए, प्रयोगात्मक कान के रूप में सही कान का उपयोग करें। बाएं कान इंट्रा-पशु नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और शल्य चिकित्सा बदल नहीं है।
  3. मध्य या बाहरी कान संक्रमण के लक्षण के लिए पूर्व ऑपरेशन मॉडल जानवर का निरीक्षण किया। संभावित लक्षण जानवर के कान से तरल पदार्थ या मवाद के जल निकासी, सूजन पंख ऊतक, और / या सुस्ती शामिल हो सकते हैं। यह असामान्य है, लेकिन ध्यान दिया, तो आगे सर्जरी से बचने के लिए और उचित रूप से पशु का इलाज।

2. शल्यक्रिया पूर्व प्रक्रिया

  1. सर्जरी से पहले और ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) और xylazine (20 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) का इंट्रा-पेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से किसी भी perioperative प्रक्रियाओं के लिए पशु 30 मिनट anesthetize। एक सकारात्मक पैर के अंगूठे चुटकी पलटा द्वारा न्याय के रूप ketamine (25 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) और xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) का एक कम खुराक के साथ, आवश्यक के रूप में संज्ञाहरण अनुपूरक। खुराक में उम्र उचित समायोजन के साथ चूहों के लिए संस्थागत अनुमति प्रोटोकॉल के अनुपालन में खुराक का निर्धारण करते हैं।
  2. पूर्ण एस के लिए चेकमॉडल के edation। एक नियमित रूप से साँस लेने की दर, एक (चूहों में) ठीक पलटा की कमी है, और पेडल और नेत्रच्छद की कमी (पैर के अंगूठे चुटकी) सजगता द्वारा चिह्नित वर्णित प्रोटोकॉल की सम्पूर्णता के लिए संज्ञाहरण के एक चरण 3 विमान के लिए जाँच करें। संज्ञाहरण के इस स्तर पर पशु बनाए रखें। इस सर्जरी के दौरान दर्द और शल्य चिकित्सा आंदोलन, खून बह रहा है, और मध्य तरल पदार्थ का रिसाव की न्यूनतम के लिए सर्वोपरि है।
  3. एक बंद लूप हीटिंग पैड के साथ 37.5 डिग्री सेल्सियस पर जानवर के शरीर के तापमान को बनाए रखें।
  4. Buprenorphine के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से एनलजेसिया प्रशासन। किसी भी शल्य परेशानी को कम करने के लिए analgesia के रूप में buprenorphine (सर्जरी से पहले 0.1 मिलीग्राम / किग्रा वर्ग में एक बार 30 मिनट) वितरित करें। संस्थागत मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल पर चयनित मॉडल के लिए उपयुक्त आधार खुराक और विकल्प। अच्छा सड़न रोकनेवाला तकनीक अभ्यास किया गया है, तो एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग आवश्यक नहीं है। दर्द और संकट के संकेत मिल रहे हैं, तो जानवरों पोस्ट ऑपरेटिव analgesia प्राप्त करते हैं।
  5. पीएच प्रदर्शन करनाpreoperatively ysiologic परीक्षण। जानवर के बलिदान करने के लिए श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) परीक्षण और / या पूर्व ऑपरेशन और बस से पहले दोनों विरूपण उत्पाद optoacoustic उत्सर्जन परीक्षण (DPOAE) के प्रदर्शन माउस की सुनवाई पर चुना ototoxic एजेंट के प्रभाव के लिए एक उद्देश्य माप के रूप में कार्य करता है।

3. शल्य चिकित्सा की तैयारी और पोजिशनिंग

  1. पूर्व ऑपरेशन संस्थागत मानकों के अनुसार सभी उपकरणों जीवाणुरहित। प्रक्रिया के दौरान अनावश्यक प्रयास और आंदोलन से बचने के लिए एक, सुसंगत बाँझ, और संगठित तरीके से सर्जिकल उपकरणों और मैदान तैयार करें। विशिष्ट उपकरणों तेज विदारक कैंची, जौहरी टिप्स, एक otologic लेने, एक otologic curette, और एक द्विध्रुवी विद्युतदहनकर्म इकाई (चित्रा 1) के साथ धातु संदंश के कई जोड़े शामिल की आवश्यकता है।
  2. तैयार है और एक्स 1 में एक्स 1.25 में पोंछ (~ 0.7 की एक छोटी त्रिकोणीय टुकड़ा काटने से अग्रिम में labwipes से बने कागज wicks बाँझ।75 में) और एक हाथ (~ में 1.25) के अंगूठे और तर्जनी के बीच कसकर घुमा। एक कसकर मुड़, अत्यंत पतली बाती का सृजन प्रक्रिया की सफलता के लिए सर्वोपरि है। सर्जरी से पहले 15-20 wicks (चित्रा 2) के कुल तैयार करें।
  3. जल्दी से एक नियंत्रित फैशन में मध्य कर्ण बुल्ला की हड्डी छेदना करने के लिए एक दंत ड्रिल का प्रयोग करें। एक 1 या 2 मिमी पतला टिप के साथ एक बेल्ट संचालित दंत हाथ ड्रिल का उपयोग बेहतर है। एक ऑपरेटिव माइक्रोस्कोप प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए आवश्यक है। (चरण 4.7 देखें)
  4. एक 28 जी, 1/2 'सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर टूबेरक्यूलिन सिरिंज में चयनित ototoxic एजेंट युक्त एक जलीय समाधान के 0.2 एमएल पूर्व आकर्षित। एजेंट का आम तौर पर 1 बूंद (~ 10 μl) पूरी तरह से माउस RWN भरने के लिए पर्याप्त है। एक तेज उठाव टिप द्वारा संरचनाओं अंतर्निहित को होने वाले नुकसान को रोकने, जबकि एक धातु, कुंद टिप सिरिंज सुई एजेंट की डिलीवरी को आसान बनाता है। बुलबुले अनजाने RWN भरने और / या उचित रोका जा सकता है के रूप में सिरिंज के भीतर किसी भी हवा निष्कासितदौर खिड़की ही करने के लिए एजेंट के आवेदन।
  5. बिजली संवारने की क़ैंची का उपयोग के बाद चुपचाप कान मे कहा त्वचा से फर निकालें। कंधे करधनी दुमदारी को rostrally auriculo-मस्तक क्रीज से विस्तार एक क्षेत्र में फर निकालें। Laterally जबड़े कोण करने के लिए पृष्ठीय, बाण के midline से बालों को हटाने का विस्तार। उचित फर हटाने के लिए एक साफ और स्पष्ट शल्य चिकित्सा क्षेत्र को बनाए रखने के लिए सर्वोपरि है। धीरे इरादा शल्य साइट की कतरनों से ब्रश।
  6. संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किए गए क्षेत्र की त्वचा जीवाणुरहित। 2 मिनट के लिए एक परिपत्र ढंग से topically इथेनॉल के साथ बारी-बारी betadine (povidone / आयोडीन) को लागू करें। अन्य एजेंटों संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  7. प्रक्रिया के दौरान लगातार शरीर स्थिति बनाए रखने के लिए एक फ्लैट सतह पर पशु रखें। 36-38 डिग्री सेल्सियस पर जानवर के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए प्रक्रिया के दौरान शरीर के तापमान को नियंत्रित करने के लिए मंच पर शरीर के नीचे रखा एक छोटा सा हीटिंग पैड का प्रयोग करें। Ove नहीं हैइस गंभीर त्वचा को नुकसान और / या जल्दी इच्छामृत्यु को हल्के करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में पशु rheat।
    1. एक काटने ब्लॉक / सिर धारक तंत्र के माध्यम से पशु के सिर को सुरक्षित करो। लंबी अक्ष के साथ 5 मिमी के अंतराल पर यह माध्यम से drilled 2-4 मिमी व्यास छेद के साथ पीतल से machined 2 सेमी काटने ब्लॉक से एक 0.5 सेमी का उपयोग। इस स्थिरता के आसपास पशु के मुंह खोलें और जानवर के आकार पर निर्भर करता छेद में से एक में ऊपरी केंद्रीय कृन्तक फिट बैठते हैं। धीरे पशु के थूथन जगह में पकड़ करने के लिए (चित्रा 3) की पीठ पर एक छोटे से दबाना कस लें।
    2. काटने ब्लॉक / सिर धारक सख्ती से एक यू के आकार articulating हाथ (चित्रा 3) के केंद्र से जुड़ा है कि पुष्टि करें। 'यू' के बाएं हाथ करने के लिए एक 1 सेमी चौड़े छड़ को सुरक्षित और एक बाईं ओर सिर बाकी के रूप में छड़ी का उपयोग करें (दाईं ओर हमेशा ऑपरेटिव पक्ष है)।
    3. एक बार जब मजबूती से सिर धारक में सुरक्षित, एक बाएं पार्श्व decubitus स्थिति के लिए माउस को घुमाएगी। शरीर carefu स्थितिlly फ्लैट ऑपरेटिंग सतह पर यह प्रक्रिया के दौरान स्थिर हो जाएगा सुनिश्चित करने और ग्रीवा कशेरुक पर अनुचित मरोड़ तनाव से बचने के लिए।
  8. एक ऑपरेटिंग 4x, 10x करने में सक्षम माइक्रोस्कोप, और शल्य चिकित्सा क्षेत्र से अधिक 20x बढ़ाई स्थिति। इस नीचे चर्चा दो हाथ शल्य प्रोटोकॉल के लिए आदर्श है के रूप में माइक्रोस्कोप एक हाथ से मुक्त ढंग से अपनी स्थिति को बनाए रख सकते हैं कि पुष्टि करें।
  9. छोटे जहाजों और ऊतक के विच्छेदन की दाग़ना में सहायता के लिए तत्काल उपलब्ध नहीं है कि एक स्थिति में ठीक इत्तला दे दी जौहरी के हाथ टुकड़ा के साथ एक द्विध्रुवी-सक्षम दाग़ना इकाई रखें। यह भी भारी रक्तस्राव का सामना करना पड़ा जाना चाहिए आवश्यक हो सकता है।

4. शल्य दृष्टिकोण

  1. सूक्ष्म बढ़ाई के तहत, एक 1-1.5 सेमी postauricular चीरा, auriculocephalic क्रीज पर लगभग 6-8 मिमी दुम बनाने के लिए तेज कैंची या एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें। पृष्ठीय midline से वयस्क माउस में, एक चीराlaterally जबड़ा के कोण के निकट एक बात करने के लिए पर्याप्त है। ध्यान से अंतर्निहित संवहनी संरचनाओं की रक्षा करने के लिए गहरा काटने से बचें।
  2. चर मोटाई का हो सकता है जो वसा की परत के माध्यम से सावधान कुंद विच्छेदन का संचालन। सुधार के प्रदर्शन करने के लिए यदि आवश्यक हो तो फैट सुरक्षित रूप से हटाया जा सकता है। बाहरी गले नस इस क्षेत्र बहती है और इस संरचना को नुकसान खून की कमी और शल्य चिकित्सा क्षेत्र की बाढ़ की बड़ी मात्रा में पैदा हो सकती है के रूप में एक उदर औसत दर्जे दिशा में विदारक जब सावधानी रखना। Absorbable जिलेटिन स्पंज और / या कपास छर्रों के साथ किसी भी अत्यधिक रक्तस्राव पर नियंत्रण रखें। भारी रक्तस्राव के लिए द्विध्रुवी दाग़ना का प्रयोग करें।
  3. मोटी परत ठीक से विभाजित है, एक बार ग्रीवा मांसलता का पर्दाफाश। Rostrally जबड़ा के कोण overlying केन्द्र उजागर शल्य चिकित्सा क्षेत्र के भीतर cleidomastoideus की बड़ी मांसपेशी शरीर, पेट के बल बाहरी गले नस, और कर्णमूलीय ऊतक सहित महत्वपूर्ण संरचनाओं पर ध्यान दें। एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर एक छोटे तंत्रिका branc हैcleidomastoideus के पीछे / पृष्ठीय किनारे के आसपास लपेटता है कि (कपाल तंत्रिका इलेवन की) एच पंख (चित्रा 4) की ओर rostrally विस्तार करने के लिए।
  4. धीरे एक पीछे / पृष्ठीय दिशा में cleidomastoideus पेशी शरीर को वापस लेना (आंकड़े 4, 5)। धीरे पेशी शरीर घेर पारदर्शी प्रावरणी विभाजित। एक समान तरीके में, धीरे विपरीत (पूर्वकाल / उदर) दिशा (चित्रा 5) में कर्णमूलीय और बाहरी गले नस वापस लेना।
  5. Cleidomastoideus पेशी शरीर की अच्छी त्याग के साथ, मध्य कर्ण बुल्ला periosteum के चमकदार गुंबद दृश्य (चित्रा 6) में आ जाएगा। बुल्ला की दुम पहलू में, एक गहरी ग्रीवा पेशी, sternomastoideus की प्रविष्टि, दृश्य (चित्रा 6) में आ जाएगा। पृष्ठीय और बुल्ला गुंबद का व्याख्यान चबूतरे वाला पहलू पर दिखाई हो जाता है जो चेहरे की हिम्मत, बचाना। एक आत्म बनाए रखना प्रतिकर्षक प्लेस (बाँझ टाइटेनियम डिस्पोजेबल सिलिकॉन में एम्बेडेड shaft--ड्रिलिंग से पूर्व) चिपकाएं।
  6. दो हाथ तकनीक के साथ, धीरे अंतर्निहित हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए द्विध्रुवी डायाथर्मी साथ बुल्ला periosteum विभाजित। धीरे तरक्की और एक परिधीय दिशा में periosteum धक्का, संदंश या एक otologic curette का प्रयोग व्यापक रूप से बुल्ला गुंबद बेनकाब करने के लिए।
    नोट: 4.6 कदम मध्य कान अंतरिक्ष की शल्य चिकित्सा दृश्य को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है। ड्रिलिंग के बाद बुल्ला गुहा में खून बह रहा है और / या मध्य द्रव का रिसाव से बचने के लिए सावधानीपूर्वक और कोमल कोमल ऊतकों को संभालने का उपयोग।
  7. एक ठीक से उजागर बुल्ला गुंबद पर, बुल्ला का व्याख्यान चबूतरे वाला पहलू भर में विस्तार देने के गुंबद की दुम मार्जिन और (कान की झिल्ली का प्रतिनिधित्व) दिख अपारदर्शी लाइन के बीच एक दंत शल्य ड्रिल के साथ बुल्ला की हड्डी के माध्यम से एक 2 मिमी पायलट छेद ड्रिल (चित्रा 7)। ऐसे stapedial धमनी के रूप में आधारभूत संरचनाएं, संरक्षित करने के लिए केवल हड्डी के माध्यम से ड्रिल करने के लिए ध्यान रखना। <(बुल्ला की हड्डी के संयुक्त राष्ट्र के छत की सुविधा के लिए पास के एक दूसरे पायलट छेद ड्रिलstrong> चित्रा 7)।
  8. जौहरी की नोक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक पृष्ठीय और दुम दिशा (8 चित्रा) में बुल्ला हड्डी खुलना। उच्च वृद्धि के तहत एक टुकड़ों फैशन में हड्डी निकालें। इस धमनी से खून बह रहा प्रक्रिया समझौता हो सकता है, के रूप में बुल्ला टोपी के नीचे सीधे निहित है जो stapedial धमनी, पंचर मत करो। अभी भी उत्कृष्ट दृश्य और दौर खिड़की आला करने के लिए उपयोग (8 चित्रा) की अनुमति है जबकि मध्य कान में अत्यधिक तरल पदार्थ प्रवेश को रोकने के लिए हटा दिया हड्डी की मात्रा को कम।

Ototoxic एजेंट 5. दौर खिड़की आवेदन

  1. देखने में squarely RWN लाने के लिए सिर धारक के लिए सूक्ष्म घूर्णी समायोजन करें। RWN आम तौर पर मध्य कान अंतरिक्ष के पृष्ठीय और दुम पहलू पर स्थित है और कान का कैप्सूल हड्डी का एक कप की तरह दांतेदार बनाना रूप में प्रकट होता है। ज्यादातर मामलों में, stapedial धमनी इस के लिए 1-2 मिमी उदर / व्याख्यान चबूतरे चलाता है। RWN कभी कभी TUC किया जा सकता हैबुल्ला गुंबद की भारी कोणीयकरण तहत सतही तौर पर ked। ऐसे मामलों में, पशु के सिर से सावधान स्थिति सर्वोपरि है।
    1. सूखी हड्डी कल्पना की है, जब तक preoperatively तैयार कागज wicks का उपयोग करना, मध्य कान और RWN में दिखाई देने वाले सभी तरल पदार्थ को हटा दें।
      नोट: ~ ototoxic एजेंट के 10 μl (1 ड्रॉप) आसानी से इस द्रव से पतला किया जा सकता RWN के लिए आवेदन किया है, क्योंकि यह पूरे प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है।
  2. अधिकतम बढ़ाई के तहत, यह पूरी तरह से भरने, RWN को सीधे ototoxic एजेंट की एक बूंद (~ 10 μl) लागू करने के लिए एक 1 मिलीलीटर टूबेरक्यूलिन सिरिंज पर एक ठीक क्षमता सुई का उपयोग करें। Stapedial धमनी को बाधित और आला ठीक से भर रहा है कि एक संकेतक के रूप में एक सुस्त और धुंधला तरल पदार्थ meniscus के साथ एक सूखी आला के आधार पर एक छोटे से प्रकाश प्रतिबिंब के प्रतिस्थापन के लिए बारीकी से निरीक्षण नहीं करने के लिए ध्यान रखना।
    1. एजेंट लगभग 10 मिनट जोखिम समय के लिए RWN भीतर आराम करने के लिए अनुमति दें। इस के बाद, पूरी तरह से डब्ल्यूएजेंट बाहर Ick और एक ही एजेंट का एक नया आवेदन के साथ बदलें। एजेंट विनिर्देशों के अनुसार आवेदन के repetitions का निर्धारण करते हैं। इस प्रक्रिया में कुल जोखिम समय आम तौर पर 30 से 60 मिनट के बीच रहता है।
    2. प्रक्रिया के अंत में, पूरी तरह से एजेंट एक अंतिम समय दूर बाती और RWN के लिए ताजा एजेंट लागू होते हैं। अनकैप्ड बुल्ला छोड़ दो और शल्य साइट पर नरम ऊतक बंद करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  3. 4-0, गैर absorbable monofilament सीवन के साथ त्वचा के स्तर पर शल्य साइट सील। एक वसूली पिंजरे / स्टेशन में पशु रखें। नियमित रूप से आपरेशन के बाद जानवर के नैदानिक ​​स्थिति की निगरानी करें। तनाव को कम करने के लिए, मुलायम भोजन के साथ नरम बिस्तर और पूरकता के साथ आवास सहित उपयुक्त वातावरण की स्थिति में पशु बनाए रखें। संस्थागत IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार भविष्य प्रक्रियाओं और पोस्ट ऑपरेटिव शर्तों का निर्धारण।
  4. साधन बाँझ संस्थागत IACUC प्रोटोकॉल का उपयोगअगले जानवर पर उपयोग करने से पहले एस। साधन उपयोग के बीच उचित ठंडा समय के लिए अनुमति दें।

6. पश्चात प्रक्रियाओं और कर्णावत ऊतक कटाई

  1. 2.5 चरण में वर्णित है, postoperatively वांछित अंक पर सुनवाई के शारीरिक परीक्षण और पूर्व बलिदान करने के लिए। प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुसार पश्चात प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। किसी भी वांछित पश्चात दिन पर पशु बलि।
  2. आईपी ​​इंजेक्शन के माध्यम से पूर्ण संज्ञाहरण पर, संस्थागत IACUC प्रोटोकॉल प्रति आवश्यक रूप में, पशु बलि। तेज कैंची का प्रयोग, डब करने के लिए सिर्फ दुम पशु सिर काटना। तेजी से पृष्ठीय और उदर midline के साथ कैंची से कपाल तिजोरी खोलने के लिए और व्यापक रूप से फैला। धीरे लौकिक हड्डियों को बेनकाब करने के मस्तिष्क के ऊतकों बाहर निकालना।
    नोट: कोक्लीअ में पोस्ट एक्सपोजर परिवर्तन की जांच के लिए प्रक्रियाओं की संख्या इस बात से शाखा कर सकते हैं और चर्चा अनुभाग में उल्लेख किया जाएगा। सबसे प्रासंगिक खोजी विधि का निर्धारणप्रयोगात्मक उद्देश्य के लिए टी। कोक्लीअ sectioned हैं के बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की योजना बनाई है, तो ऊतक पूर्व ठीक करने के लिए कार्डियक कैथीटेराइजेशन का उपयोग करें। यह इस चर्चा के दायरे से बाहर है और कहीं और गहराई में शामिल किया गया है। 13
  3. कैंची के साथ खोपड़ी के आधार के बाहर अस्थायी हड्डियों कट और तुरंत लगानेवाला समाधान में रखा। आरटी पर 1.5 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में सीधे हड्डियों को विसर्जित कर दिया। लंबी अवधि के बाद के चरणों में ऊतकीय विश्लेषण के परिणाम को सीमित कर सकते हैं, के रूप में निर्धारण समय की निगरानी करें। अम्लो व्दारा कैल्सियम 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) में डुबकी के माध्यम से समय की एक चर अवधि के लिए हड्डियों को विच्छेदित।

Representative Results

ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग स्टीवंस एट अल द्वारा हाल ही में एक अध्ययन में, दोनों लिंग के वयस्क CBA / CAJ चूहों heptanol के दौर खिड़की प्रसार के माध्यम से अवगत कराया गया। 15 heptanol लक्षित उत्पादन के लिए जाना एक अंतराल जंक्शन संयुक्त राष्ट्र युग्मक, की कोशिकाओं के लिए वसूली चोट है कर्णावत पार्श्व दीवार। अध्ययन का उद्देश्य किसी भी क्षतिग्रस्त तत्वों की शल्य चिकित्सा के बाद उत्थान की जांच के लिए अनुमति देता है, लक्षित कर्णावत क्षति के लिए एक विश्वसनीय मॉडल का उत्पादन करने के लिए किया गया था। एक कार्यात्मक समापन बिंदु के रूप में सेवा पूर्व शल्य चिकित्सा और शल्य चिकित्सा के बाद सुनवाई थ्रेसहोल्ड। माइक्रोस्कोपी और immunohistochemical धुंधला तकनीक शब्द के भागों परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। ABR थ्रेसहोल्ड में उल्लेखनीय वृद्धि heptanol इलाज चूहों (9 चित्रा) में मनाया गया। बजाय heptanol का खारा के वितरण के साथ, नकली सर्जरी प्राप्त नियंत्रण जानवरों, किसी भी परीक्षण किया आवृत्ति पर महत्वपूर्ण दहलीज पारियों का प्रदर्शन नहीं किया था।

एक अंदर की ओर सुधार के खिलाफ Immunostainingपोटेशियम चैनल (कीर) 4.1 कर्णावत संरचनाओं की क्षति / वसूली दृश्यमान करने के लिए एक अप्रत्यक्ष विधि के रूप में कार्य किया। इस उपचार और नियंत्रण कान के बीच अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मतभेद का प्रदर्शन किया। कुल मिलाकर धुंधला तीव्रता स्पष्ट रूप से इन क्षेत्रों को लक्षित नुकसान की बड़ी मात्रा को दर्शाने, हलकी लीक vascularis (एसटीवी) के भीतर और 1-3 दिनों heptanol प्रदर्शन के बाद सर्पिल बंधन (SLF) की fibrocytes के बीच कम था। प्रकार द्वितीय और प्रकार चतुर्थ SLFs के क्षेत्रों (चित्रा 10) और एसटीवी (11 चित्रा) में कीर 4.1 धुंधला तीव्रता में एक खास कमी नहीं थी। बाधित परमाणु अखंडता और गुणसूत्र संक्षेपण / सेलुलर apoptosis के ठेठ blebs के साक्ष्य भी इन कर्णावत क्षेत्रों में परमाणु counterstains (10 चित्रा) पर देखा गया था। कीर 4.1 Vacuolated क्षेत्रों 7 दिनों में स्पष्ट रूप से हल किया और 14 दिनों में पूरी तरह से अनुपस्थित थे धुंधला हो जाना। कीर 4.1 धुंधला तीव्रता एसटीवी के क्षेत्रों में मात्रा निर्धारित किया गया था, जब इलाज किया कान एक initi का प्रदर्शन7 दिन heptanol जोखिम (चित्रा 12) के बाद वापस नियंत्रण तीव्रता की ओर एक महत्वपूर्ण बदलाव (पी <0.05) के बाद अल गर्त।

चित्र 1
चित्रा 1. साधन की स्थापना की। इंस्ट्रूमेंटेशन के पूर्व शल्य सेट-अप का चित्रण। सभी उपकरण बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र के भीतर आसानी से सुलभ होना चाहिए। ठीक घुमावदार टिप जौहरी के संदंश के साथ, और एक विद्युत दाग़ना यूनिट - ठेठ इंस्ट्रूमेंटेशन 2 तेज विच्छेदन कैंची, 2-3 सीधे और / या कान Curettes साथ घुमावदार टिप जौहरी के संदंश, घुमावदार शाफ्ट otologic चुनती (नहीं दिखाया बाद में रोजेन के साथ प्रतिस्थापित उठाता है) भी शामिल है बुद्धि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. शल्य चिकित्सा की आपूर्ति चित्रा। RWN पर्यावरण को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त आपूर्ति करती है। कागज बाती गठन (बाएं) के लिए निष्फल labwipe कटआउट, कसकर गठन कागज निष्फल प्रयोगशाला पोंछे (बीच में), और 4 मिमी कपास छर्रों (दाएं) दौर खिड़की आला में अतिरिक्त तरल पदार्थ और रक्त बाढ़ मिटा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं से बना WICKS। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र तीन
चित्रा 3. पशु सिर धारक। सिर धारक और काटने ब्लॉक चित्रण छवि। ब्लॉक में छेद फिट हैं और ऊपरी केंद्रीय कृन्तक सुरक्षित है। एक क्लैंप धीरे जगह में पशु सुरक्षित करने के लिए पृष्ठीय थूथन के ऊपर कड़ी कर दी गई है। एक सिर धारक का प्रयोग सफल शल्य outc के लिए महत्वपूर्ण हैome। आदर्श रूप में, इस प्रक्रिया के दौरान बुल्ला की शल्य चिकित्सा विचारों का अनुकूलन करने के लिए पशु का व्याख्यान चबूतरे वाला दुम धुरी के बारे में बारी बारी से करने में सक्षम होना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Cleidomastoideus एम। बुनियादी कृंतक ग्रीवा मांसलता की शारीरिक रचना और बाहरी गले नस के साथ अपने सहयोग का चित्रण। योजनाबद्ध ग्राफ। cleidomastoideus पेशी शल्य दृष्टिकोण के दौरान सबसे अधिक आसानी से पहचाना पेशी है। मध्य कर्ण बुल्ला (काले वृत्त) की ओर शल्य विच्छेदन निर्देशित करेंगे पेशी शरीर के पीछे / पृष्ठीय त्याग के द्वारा पीछा घेर प्रावरणी की रिहाई। अल देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की arger संस्करण।

चित्रा 5
5. सर्जिकल जोखिम क्षेत्र चित्रा। त्वचीय और वसा परतों के माध्यम से विच्छेदन के बाद जोखिम दर्शाया गया है। नोट के स्ट्रक्चरल स्थलों एक cleidomastoideus पेशी (ए), बाहरी गले की नस (बी) overlying कपाल तंत्रिका इलेवन की शाखा, और उजागर कर्णमूलीय ऊतक (सी) शामिल हैं। कपाल तंत्रिका इलेवन शाखा अक्सर एक छोटे पोत के साथ जुड़ा हुआ है और पहले कार्यवाही को विभाजित किया जाना चाहिए। सही छवि जानवर के व्याख्यान चबूतरे वाला दुम धुरी से मेल खाती है पर छोड़ दिया करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 बू उजागरlla। cleidomastoideus के त्याग और आसपास के ढांचे के बाद मध्य कर्ण बुल्ला का एक्सपोजर। उल्लेखनीय स्थलों cleidomastoideus पेशी शरीर (ए) / पीछे परिलक्षित पीछे शामिल हैं, चेहरे की नस (बी), और मध्य कर्ण बुल्ला periosteum (सी) के चमकदार गुंबद। इसके अलावा, मध्य कर्ण बुल्ला (तारांकन) के बाईं दुम पहलू पर sternomastoideus मांसपेशियों की प्रविष्टि ध्यान दें। बुल्ला की पृष्ठीय और व्याख्यान चबूतरे वाला पहलू पर चेहरे तंत्रिका की उपस्थिति बुल्ला की सही पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर है। सही छवि जानवर के व्याख्यान चबूतरे वाला दुम धुरी से मेल खाती है पर छोड़ दिया करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. दौर खिड़की आला उजागर मैं। छवि tympa चित्रणएनआईसी बुल्ला पूरी तरह overlying periosteum के विच्छेदन के बाद से अवगत कराया। पायलट छेद सबसे अच्छा बुल्ला गुंबद की दुम बढ़त और व्याख्यान चबूतरे वाला पहलू (कान की झिल्ली का प्रतिनिधित्व) बुल्ला भीतर कल्पना की एक सूक्ष्म अपारदर्शी लाइन के बीच आधे रास्ते बिंदु पर रखा गया है। एक दूसरा, आसन्न पायलट छेद बुल्ला की हड्डी का आसान संयुक्त राष्ट्र छत सुविधा हो सकती है। अंतर्निहित stapedial धमनी को चोट पहुंचाना नहीं के रूप में इतनी गहरी ड्रिलिंग से बचाव के लिए लिया जाना चाहिए। छवि के नीचे काले, धातु वस्तु टाइटेनियम नरम ऊतक प्रतिकर्षक है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा दौर खिड़की आला द्वितीय उजागर। दौर खिड़की आला (तीर) और stapedial धमनी के जोखिम के साथ अनकैप्ड मध्य कर्ण बुल्ला (लाल संरचना20x बढ़ाई तहत देखा के रूप में 1-2 मिमी) आला करने के लिए पार्श्व। आला अक्सर गुंबद की दुम पहलू पर कान का कैप्सूल के साथ बुल्ला गुंबद द्वारा गठित न्यूनकोण नीचे tucked एक स्थिति में देता है। यह आला का पूरा दृश्य से पहले ototoxic एजेंट या बाती के आवेदन करने के लिए प्राप्त किया जा आवश्यक है। मध्य द्रव / रक्त बड़े छेद बनाए गए थे जब गुहा बाढ़ की प्रवृत्ति के रूप में uncapping के दौरान अत्यधिक हड्डी को हटाने की भी बचा जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा 9. प्रतिनिधि परिणाम -। Heptanol प्रेरित सुनवाई हानि और वसूली श्रवण brainstem प्रतिक्रिया मीन (ABR) थ्रेसहोल्ड (DB एसपीएल) स्वर रंज के एक समारोह के रूप में प्लॉटआवृत्ति। माप पूर्व जोखिम (ब्लैक-नियंत्रण) और पोस्ट ऑपरेटिव दिन (Pod) 1, 7, और 14 (लाल) के अनुसार वर्गीकृत किया है। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा स्टीवंस एट अल से फिर से साजिश रची गई थी। 2014 15 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
चित्रा 10 प्रतिनिधि परिणाम - heptanol जोखिम भाग मैं heptanol के साथ इलाज कान की पोटेशियम इनर करनेवाला में परिवर्तन (कीर) चैनल 4.1 धुंधला हलकी लीक vascularis के भीतर (एसटीवी) और कान नियंत्रण के बाद कर्णावत क्षति लक्षित। (क) सामान्य कीर 4.1 कीर 4.1 (हरा) के लिए मजबूत strial सेल आत्मीयता के साथ नियंत्रण कान की ठेठ धुंधला हो जाना। POD1 पर (बी) के उपचार कान। Decr के बड़े vacuolized जोनोंढील कीर 4.1 आत्मीयता एसटीवी कीर 4.1 धुंधला तीव्रता में एक समग्र कमी के साथ-साथ एसटीवी (तीर) के भीतर देखा जाता है। नाभिक propidium आयोडीन (लाल) (बी) के साथ counterstained कर रहे हैं। स्केल बार 15 माइक्रोन =। चित्रा स्टीवंस एट अल से फिर से साजिश रची गई थी, 2014. 15 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 11
चित्रा 11. प्रतिनिधि परिणाम - heptanol जोखिम भाग द्वितीय के बाद कर्णावत क्षति लक्षित heptanol में इलाज कान की सर्पिल बंधन (एसएल) में परिवर्तन कान नियंत्रित करने के लिए की तुलना में।। सामान्य दिखने प्रकार द्वितीय सर्पिल बंध fibrocytes (द्वितीय) के साथ नियंत्रण कान की खासियत एसएल भीतर (ए) सामान्य कीर 4.1 धुंधला (हरा)। (बी) heptanol टीप्रकार द्वितीय सर्पिल बंध fibrocytes, परमाणु विघटन और apoptosis (तीर) के साथ संगत गुणसूत्र संक्षेपण / blebs के क्षेत्र में कीर 4.1 धुंधला तीव्रता में उल्लेखनीय कमी के साथ reated कान। नाभिक propidium आयोडीन (लाल) के साथ counterstained कर रहे हैं। स्केल बार 15 माइक्रोन =। चित्रा स्टीवंस एट अल से फिर से साजिश रची गई थी, 2014. 15 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 12
चित्रा 12. प्रतिनिधि परिणाम -। Heptanol प्रदर्शन के बाद कर्णावत धुंधला तीव्रता की रिकवरी 4.1 धुंधला बाद जोखिम दिन के एक समारोह के रूप में साजिश रची कीर की आपेक्षित मतलब। आपेक्षित heptanol इलाज में confocal माइक्रोस्कोपी के तहत कीर के रूप में 4.1 चिंतनशील तीव्रता गणना की जाती हैएड कान नियंत्रण कान में एक ही के एक प्रतिशत के रूप में लिया। नोट POD14-28 डेटा वक्र पर एक बिंदु के रूप में जमा कर रहे हैं। त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि ठोस हलकों मतलब मूल्यों प्रतिनिधित्व करते हैं। आपेक्षित का एक महत्वपूर्ण वसूली पॉड 7 और बाद की तारीखों (छात्र टी परीक्षण पी <0.05, तारांकन) के बीच प्रदर्शन किया गया। चित्रा स्टीवंस एट अल। से फिर से साजिश रची गई थी, 2014. 15 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम दोनों लिंग सहित एक CBA / CAJ माउस मॉडल में प्राप्त किया गया। यह जन्मजात तनाव में अच्छी तरह से अनुसंधान सुनवाई में एक "अच्छा सुनवाई" मानक और "सामान्य बुढ़ापे" मॉडल के रूप में स्थापित है। अन्य स्तनधारी मॉडल में इस प्रोटोकॉल के उपयोग की 16-23 विवरण इस पाठ के दायरे से बाहर है। पाठक RWN आवेदन तकनीक स्तनधारी भीतरी कान का अध्ययन करने के लिए कई लाभ प्रदान करता है, तथापि, ध्यान देना चाहिए। इनमें से सबसे उल्लेखनीय यह नाजुक शारीरिक संरचना के प्रत्यक्ष व्यवधान और कान का कैप्सूल की दीवारों के भीतर मौजूद है कि जैव रासायनिक ढ़ाल से बचा जाता है। ऐसे cochleostomy और आसव पंप का आरोपण प्रक्रिया के रूप में सीधे स्थायी सीमा पारियों के लिए अग्रणी भीतरी कान संरचनाओं का उल्लंघन करने के लिए प्रवृत्ति है; परिणामों का विश्लेषण करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि एक तथ्य है। आक्रामक metho से कर्णावत पार्श्व दीवार संरचनाओं के विघटनडी एस भी ऐसे जिसका विशिष्ट क्षेत्र प्रभाव के उस स्थान तक ही सीमित है। इस तरह के पार मध्य कर्ण इंजेक्शन और Parenteral इंजेक्शन के रूप में 15,24 वैकल्पिक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण अविश्वसनीय परिणामों और से ग्रस्त हो गया है furosemide या heptanol, के रूप में ototoxic एजेंटों के उपयोग को सीमित कर सकता / या पशु मॉडल के लिए प्रणालीगत विषाक्तता। यह आवेदन विधि के ऊपर चर्चा की और अधिक आक्रामक तरीके आ कि स्थिरता का एक स्तर को प्राप्त करने, इन कमियों से दोनों से बचने के लिए साबित कर दी है।

इस तकनीक के अन्य लाभ पशु मॉडल और व्यवहार्यता के एक नंबर करने के लिए अपने व्यापक प्रयोज्यता एक मौजूदा प्रयोगशाला बुनियादी ढांचे में शामिल करने के लिए किया जाता है शामिल हैं। बाद के बारे में कोई विशेष अभिकर्मकों या रसायनों चुना ototoxic एजेंटों, निश्चेतक, और दर्दनाशक दवाओं से अलग आवश्यक हैं। Ototoxic एजेंट आमतौर पर विचार के लिए समय की लंबी अवधि के लिए पिछले करने के लिए समाधान (5 एमएल) का एक बड़ा पर्याप्त मात्रा में एक निश्चित एकाग्रता में उपयोग किया और मिश्रित कर रहे हैंप्रत्येक आवेदन आईएनजी (चूहों में) के बारे में 10 μl का उपयोग करता है। इस प्रकार, आपूर्ति और उपकरणों की प्रारंभिक खरीद के बाद, जांचकर्ताओं समय लेने समाधान तैयारी या सामग्री की लगातार प्रतिस्थापन से अपेक्षाकृत स्वतंत्र हैं। इस तकनीक को भी perilymphatic आसव पंप या cochleostomies का आरोपण से जुड़े प्रक्रियाओं की तुलना में जब महत्वपूर्ण हो सकता है, जो ऑपरेटिव समय में कटौती ले सकते हैं। तकनीकी दक्षता का एक स्तर तक पहुँचने पर, बंद करने के लिए प्रारंभिक चीरा से हमारे औसत समापन समय ototoxic एजेंट के लिए वांछित जोखिम की लंबाई पर निर्भर करता है जो आम तौर पर 20 मिनट से 1.5 घंटे की थी। तीन या चार सर्जरी आसानी से वृद्धि की दक्षता और सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए वृद्धि की क्षमता के लिए अनुमति देता है, एक ही दिन में पूरा किया जा सकता है। ऊपर वर्णित है, इस तकनीक को भी आसानी से चूहे, चूहे, गिनी सूअरों और gerbils सहित कृंतक मॉडल की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।

इस विधि की सीमाओं पर केंद्रित कर रहे हैंमामूली तेजी से सीखने की अवस्था में यह गुरु की जरूरत है और तकनीकी दक्षता तक पहुँच जाता है, परिणाम की उम्मीद कम किया है। नीचे अधिक से अधिक विस्तार से चर्चा की जाएगी के रूप में, शल्य दृष्टिकोण या शल्य चिकित्सा क्षेत्र की अपर्याप्त दृश्य के दौरान छोटी त्रुटियों लगभग हमेशा एक गरीब परिणाम को बढ़ावा मिलेगा। ऐसे एजेंट गिराए दौर खिड़की झिल्ली या मध्य द्रव के लिए एजेंट का एक उप मिलीमीटर मोटी हवा बुलबुला अवरुद्ध उपयोग के रूप में एक नौसिखिया पहचान करने के लिए विफल हो सकता है कि सूक्ष्म निष्कर्ष, सराहना करते हैं और उन्हें दूर करने के लिए आवश्यक psychomotor कौशल विकसित करने के लिए समय ले लो। हालांकि, इन बाधाओं को आसानी से दूर किया है और ऊपर उल्लिखित आक्रामक तरीके की तुलना में कुछ जांचकर्ताओं के लिए एक कम चुनौतीपूर्ण तकनीकी चुनौती का गठन कर रहे हैं प्रक्रिया के बार-बार के प्रदर्शन के साथ। अंत में, इस तकनीक कर्णावत चोट केवल शल्य प्रदर्शन के दौरान समय में एक भी बिंदु पर प्रेरित किया जा सकता है कि रिश्तेदार सीमा के साथ जुड़ा हुआ है। यह कुछ हद तक दूर किया जा सकता, Heydt एट अल द्वारा वर्णित किया गया था के रूप में एजेंट में भिगो absorbable जिलेटिन स्पंज के साथ RWN भरने के द्वारा। 10 absorbable जिलेटिन स्पंज समय के साथ resorb होगा, लेकिन अकेले एक जलीय समाधान के आवेदन के माध्यम से प्राप्त किया है की तुलना में अब जोखिम अवधि के लिए अनुमति दे सकता है।

इस तकनीक का पूरा लाभ का एहसास है और किसी भी नुकसान से बचने के लिए एक अन्वेषक के लिए आदेश में, यह इस तकनीक के दो महत्वपूर्ण तत्वों को पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है: 1) लगातार मध्य कान अंतरिक्ष और RWN के दृश्य बनाए रखने; और 2) क्षमता मध्य द्रव और / या रक्त के मुक्त शल्य चिकित्सा क्षेत्र में रखने के लिए। इनमें से पूर्व प्राप्त करने में, एक उचित सिर-धारक के महत्व पर बल से अधिक नहीं हो सकता है। पशु के सिर का सुरक्षित निर्धारण खुर्दबीन के नीचे एक स्थिर दृश्य सुनिश्चित करता है; सूक्ष्म इंस्ट्रूमेंटेशन काफी वृद्धि के तहत संरचनाओं की स्थिति में परिवर्तन जब जो के महत्व को आसानी से स्पष्ट हो जाता है। एक अच्छा जजानवर के व्याख्यान चबूतरे वाला दुम धुरी के बारे में बारी बारी से कर सकते हैं कि EAD धारक भी साइट के अन्वेषक की लाइन में महत्वपूर्ण गतिशील परिवर्तन की सुविधा। अक्सर, इस धुरी के बारे में रोटेशन के कुछ मिलीमीटर RWN के दृश्य और केवल कान का कैप्सूल हड्डी के दृश्य के बीच का अंतर हो सकता है। लगातार दृश्य को बदलने की क्षमता भी ठीक से आला की और गहराई से निकाल दिया जाता है मध्य द्रव सुनिश्चित करने के लिए सर्वोपरि है भी हमारे अनुभव, रक्त, संक्षेपण, या मध्य द्रव में भाग 5. के रूप में चर्चा ototoxic एजेंट पूरी तरह से अनुप्रयोगों के बीच निकाल दिया जाता है कि कि मध्य कान अंतरिक्ष पूरे प्रयोग के मामले में हस्तक्षेप करने की क्षमता है में प्रवेश करती है। Ototoxic एजेंट की छोटी राशि आसानी से बाहरी तरल पदार्थ की भी थोड़ी मात्रा के साथ संपर्क में आने से पतला किया जा सकता दौर खिड़की (~ 10 μl) के लिए आवेदन किया है, क्योंकि यह आश्चर्य की बात नहीं है। इस कारण से, सूक्ष्म शल्य विच्छेदन, मध्य कर्ण बुल्ला और सावधान preservat के टुकड़ों uncappingstapedial धमनी के आयन एक सफल प्रायोगिक परिणामों के लिए समान हैं।

ऊपर महत्वपूर्ण कदम मनाया जाता है और उम्मीद परिणामों अभी भी हासिल नहीं कर रहे हैं, तो समस्या निवारण शुरू करना चाहिए। हमारे अनुभव में, यह दो प्रक्रियात्मक तत्वों का परीक्षण विविधताओं के प्रदर्शन के लिए उपयोगी है। पहले ototoxic एजेंट दौर विंडो में मंगाया जाता है जिसके साथ आवृत्ति को संशोधित करने के लिए है। इस्तेमाल किया जा रहा एजेंट पर निर्भर करता है, कुल निवेश का समय पूरा बाती और एजेंट हर 10 मिनट के बाद के प्रतिस्थापन के साथ, 30 मिनट और 1 घंटे के बीच है। छोटी अवधि के लिए उजागर करते हैं, तो समग्र निवेश बढ़ाने एजेंट अधिक समय दौर खिड़की झिल्ली भर में फैलाना करने की अनुमति हो सकती है। अतिरिक्त जोखिम और भरपाई भी ऊपर चर्चा के रूप में रक्त, संक्षेपण, या मध्य द्वारा ototoxic एजेंट के अवांछित कमजोर पड़ने से बचने के लिए मदद मिल सकती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय यह अनजाने का खतरा बढ़ जाता है के रूप में सावधानी, तथापि, बनाए रखा जाना चाहिएLy stapedial धमनी घायल हो गए और / या RWN करने के लिए मध्य द्रव शुरू।

इस तकनीक को यह कर्णावत शरीर विज्ञान और pathophysiology की जांच करने के लिए क्या प्रदान करता है में महत्वपूर्ण है। यह न्यूनतम इनवेसिव तकनीक नाजुक जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का विस्तृत अध्ययन की अनुमति देता है और कर्णावत पुनर्योजी क्षमता का आकलन करने के उद्देश्य से हमारे अनुसंधान को आगे बढ़ाने में समान हो गया है। 12,24 यह शल्य दृष्टिकोण और जोखिम भी अन्य शाखा तकनीक की एक किस्म भर में reproduced है, और सफल परिणाम इस का उपयोग विधि कर्णावत स्टेम सेल आरोपण के अध्ययन में बताया गया है। 14 एक बड़ा सौदा हालांकि, जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध व्यापक साधन के साथ-साथ इस तकनीक का, इस ज्ञान का अंतर कम करने में सहायता करेंगे, कोक्लीअ के बारे में अनजान बनी हुई है।

Disclosures

कोई वित्तीय हितों की होड़। लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Heptanol 98% Sigma-Aldrich H2805  PubChem Substance ID 24895536
Ketaset Injectable  Patterson Veterinary 07-803-6637  Concentrate 100mg/ml
(Ketamine HCl) 10 ml Schedule CIII controlled substance
Anased Injectable Lloyd Laboratories NADA# 139-236 Concentrate 20mg/ml
Buprenex Injectable  Patterson Veterinary 07-850-2280  Concentrate 0.3 mg/ml
(Buprenorphine HCl) 5 ampules per box Schedule CIII controlled substance
Betadine Skin Prep Solution Medline MDS093941  1 Quart screw top bottle
0.9% Sterile Saline Variable For mixing solutions and injections
Operating Microscope Carl Zeiss 32192
Controlled Acoustics Environment Sound Booth Industrial Acoustics Company
Surgical Head Holder Custom Made –  Please see Figure 3
Medical University of South Carolina
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch World Precision Instruments 555801L Maximum spread 20 mm
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder
90N Dental Belt Driven Hand Drill  Emesco Vintage Item
Scalpel Handle Size 6 Bard-Parker MEDC-011990
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade  Bard-Parker SKU: 097-7215 50 Blades/Box
Via ACE Surgical Supply Code
Straight Tip Jewelers Forceps  Bernell MIL17304
Iris Scissors Curved Medline DYND04026 
Iris Scissors Straight Medline DYND04025 
Stevens Tenotomy Scissors Straight Medline MDG3222111 
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip MytaMed Item# 6.56.00 Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip MytaMed Item# 6.56.01
Kimwipes Delicate Task Wipers  Kimtech Science CODE 34155  White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.
House Ear Curette, 6” shaft, light angle Medline MDG0396486 
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 Medline IIS34201  Substitutions may be made
Cotton pellets #3 4 mm Richmond Manufacturer Code 100108
ElectroSurgical Unit 100 E M/M Elmed List No. 52-5770 Bipolar and Monopolar Capable
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle BD Product Number: 329410 Optional for delivery of Ototoxic agent
23G, blunt tip, 1” length needle Kendall Product Code 8881202397 For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery
Surgical Mask U-line S-10478
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves U-line S-12549
Precision Hair Clippers Wahl Multiple models may be substituted
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13 mm 3/8 circle needle Ethilon 1855G Substitutions may be made. 
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisher 01-812054
Dry Sterilizer ROBOZ Germinator TM 500

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References

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Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, … More

Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J. Vis. Exp. (105), e53131, doi:10.3791/53131 (2015).

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