Introduction
Forskere har anvendt en bred vifte af dyremodeller for at studere den normale funktion af det auditive system samt patofysiologien af høretab. Disse modeller er også meget nyttig for udførelse interventionsstudier mod forskellige patologiske processer og tjene som grundlag for translationelle applikationer i mennesker. For de fleste forskning, som involverer cochlea og associerede auditive veje, må en vis grad af skader eller forstyrrelser blive introduceret til systemet. Ofte er skaden med vilje havde til formål at oprette en specifik læsion, så efterforskerne at studere effekten af denne læsion på normale funktion, samt cochlear evne til at komme sig efter den. Ved valg af en bestemt dyremodel og / eller teknik (r) til indføring skader, skal en række faktorer anses for at opnå de bedst mulige resultater. Forskellige dyremodeller kan reagere forskelligt på indgreb, mens de direkte og indirekte virkninger af en teknik kan værehelt skadelige for det ønskede resultat. I de fleste tilfælde vil den ideelle indre øre skader protokollen undgå systemisk toksicitet, hurtigt og pålideligt at producere skader, skabe en præcis og konsekvent læsion og være overleves at tillade yderligere undersøgelse af funktionelle, cellulære og molekylære ændringer. Ideelt set ville disse metoder også bevare den fine mikroarkitektur og elektrokemiske gradienter af cochlea i størst muligt omfang.
Hidtil har forskere lykkedes at etablere en række teknikker til at fremkalde indre øre skade. De fleste af disse medfører at udsætte cochlea til en ototoksisk middel enten systemisk eller via kirurgisk tilgang. Teknikker omfatter parenteral injektion, intraperitoneal injektion, trans-tympaniske injektion, endolymfatiske sæk injektion, og cochleostomy med perilymfatisk perfusion. Disse teknikker er blevet anvendt til at indføre en række ototoksiske midler, såsom furosemid, gentamicin, ouabain og heptanol. 1-5Mens vellykket på at skabe konkrete cochlear læsioner, også de ovennævnte teknikker har erkendt begrænsninger. Systemiske injektioner kan være meget giftige for dyret og kan være forbundet med utilsigtede cochlear fornærmelser og inkonsistente resultater. Sidstnævnte svaghed har også været forbundet med trans-tympaniske injektioner. Teknikker, såsom cochleostomy og perilymfatisk perfusion, mens stand til at inducere hurtig og meget pålidelig læsioner, direkte invasiv indre øre struktur og funktion. Mange af de kirurgiske metoder er også forbundet med en høj grad af tekniske vanskeligheder og kan kræve forlader fremmedlegemer i dyret, såsom en mikropumpe infuser. 2-4,6-8 ikke nogen enkelt teknik er fri for mangler og undersøgere skal vælge metoder omhyggeligt for at passe deres eksperimentelle behov. Her beskriver vi, i detaljer, det runde vindues fordybning (RWN) påføringsteknikken til topisk levering af ototoksiske stoffer i voksne mus.
Fiførste beskrevet af Husmann et al i 1998, mens han studerede gentamicin virkning på sensoriske hår celledegenerering i en aviær model blev denne teknik vist sig at være stand til at producere væsentligt mere pålidelige læsioner end systemisk gentamicin anvendelse, og samtidig undgå associerede toksiciteter. 9 Siden da en Antallet af andre forskere, herunder vores laboratorium, har udnyttet denne teknik til stor succes. I 2004 Heydt et al. tilpasset det til en musemodel og beskrevet en forbedret evne til at styre læsionsstørrelse ved at fylde RWN med absorberbare gelatine svamp i varierende koncentrationer af gentamicin. 10 Palmgren et al., i 2010, studerede de ototoksiske virkninger af beta-Bungarotoxin, en potent element i giften taiwanske stribede kasse, ved anvendelse af en vandig form af den til RWN af voksne rotter. 11 Desuden har en række tidligere undersøgelser fra vores laboratorium udnyttet det runde vindues tilgang til at studere ototoksiske virkninger af furosemide, ouabain og heptanol. 5,6,12-15 Resultaterne af disse undersøgelser har vist, hvor vigtigt det cochlear væske og ion-homeostase på normal hørelse, opdagede celle proliferativ evne i spiral ganglion og cochlear laterale væg, og fremmet vores forståelse af aldersrelateret høretab.
Den følgende fremgangsmåde involverer kirurgisk adgang til mellemøret via en postauricular snit og delvis unroofing af den benede tympaniske bulla. Dette muliggør en fremragende eksponering af RWN og membranen som et udvalgt ototoksiske middel kan anvendes direkte. Den flydende middel derefter pools i koplignende hule af RWN (eller langsomt dræner fra en mættet absorberbar gelatinesvamp bærer pakkes i RWN) og diffunderer gennem det runde vindues membran ind i perilymfatisk rum cochlear vestibule. Ingen direkte cochleostomy der i denne tilgang. Fordele ved denne teknik omfatter bevarelse af indre øre mikroarkitektur, undgåelseaf systemisk toksicitet, godtgørelse på et intra-animalsk kontrol øre, hurtig indsættende effekt, selektiv degeneration i visse cochlear celletyper (f.eks., type I spiral ganglion neuroner med ouabain eksponering og cochlear type II fibrocytter induceret af behandlingen af heptanol), og reproducerbare / pålidelige resultater. Denne teknik kan anvendes med få ændringer mellem andre gnaver arter, herunder rotter, marsvin og ørkenrotter. Ulemper omfatter en stejl teknisk indlæringskurve og den relative begrænsning af ototoksiske insult der er begrænset til et enkelt tidspunkt.
Protocol
Alle aspekter af dyrs forskning blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne i den relevante Institutional Animal Care og brug Udvalg. Alle hvirveldyr eksperimentelle procedurer beskrevet her blev godkendt i henhold til retningslinjerne fra Medical University of South Carolinas (MUSC) Institutionel Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Model Selection
- Vedligeholde dyremodel i en støjsvag vivarium med rutinemæssige bevogtning pr institutionelle protokoller indtil den er klar til brug. I dyr forskningsfaciliteter (ARF'er), vedligeholde vibrationer stabilitet, støj dæmpning, daglige belysning, prep plads, overflader, forsegling og kalfatring og ventilation, der opfylder NIH standarder.
Bemærk: National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for ARF'er og vedligeholdelse af en støjsvag vivarium kan revideres på: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ - For alle eksperimenter, bruge det højre øre, da den eksperimentelle øre. Den venstre øre fungerer som en intra-animalsk kontrol og ikke kirurgisk ændret.
- Undersøg model dyr pre-operativt for tegn på midten eller ydre øre infektion. Potentielle tegn kan omfatte dræning af væske eller pus fra øret, betændt pinna væv, og / eller sløvhed af dyret. Det er usædvanligt, men hvis bemærkes, undgå yderligere kirurgi og behandle dyret korrekt.
2. Præoperative Procedurer
- Bedøver dyret 30 minutter før kirurgi og eventuelle perioperative procedurer via intra-peritoneal (IP) injektion af ketamin (100 mg / kg IP) og xylazin (20 mg / kg IP). Supplement anæstesi som nødvendigt, som vurderet ved en positiv tå-pinch refleks, med en lavere dosis af ketamin (25 mg / kg IP) og xylazin (5 mg / kg IP). Bestem dosering i overensstemmelse med institutionelt tilladte protokoller for mus med alder passende justeringer i dosis.
- Check for fuld sedation af modellen. Check for en fase 3 plan anæstesi for hele den beskrevne protokol præget af en regelmæssig vejrtrækning, manglende stabilitetsrefleks (i mus), og mangel på pedalen og palpebral (toe-knivspids) reflekser. Oprethold dyret på dette niveau af anæstesi. Dette er altafgørende for minimering af smerte og intraoperativ bevægelse, blødning, og lækage af interstitielle væsker under operationen.
- Opretholde dyrets kropstemperatur ved 37,5 ° C med en lukket sløjfe varmepude.
- Administrer analgesi via subkutan injektion af buprenorphin. Levere buprenorphin (0,1 mg / kg SQ gang 30 minutter før kirurgi) som analgesi at minimere eventuelle kirurgisk ubehag. Base dosering og alternativer egnede til den valgte model institutionelt godkendte protokoller. Antibiotika anvendelse er ikke nødvendig, hvis god aseptisk teknik er blevet praktiseret. Dyrene får postoperativ analgesi, hvis der er tegn på smerte og lidelse.
- Udfør physiologic tests præoperativt. Udførelse auditive hjernestammen respons (ABR) afprøvning og / eller forvrængning produkt testning optoacoustic emissioner (DPOAE) både præ-operativt og lige før at ofre af dyret tjener som en objektiv måling for effekten af den valgte ototoksiske agent på musens hørelse.
3. Kirurgisk Forberedelse og Positionering
- Sterilisere alle instrumenter præ-operativt pr institutionelle standarder. Forbered kirurgiske instrumenter og felt på en konsistent, steril, og organiseret måde at undgå unødvendige kræfter og bevægelse under proceduren. Typiske instrumenter kræves omfatter skarpe Dissecting saks, flere par metalliske pincet med smykkeforretninger tips, en Otologisk- pick, en Otologisk- curette, og en bipolær elektrokauterisation enhed (figur 1).
- Forberede og sterilisere papir væger fremstillet af labwipes på forhånd ved at skære et lille trekantet stykke af servietten (~ 0,7 cm x 1,25 cm x 1.75 i), og dreje det stramt mellem tommel- og pegefinger på den ene hånd (~ 1,25 in). Oprettelse af en tæt snoet, ekstremt tynde væge er altafgørende for succes i proceduren. Forbered alt 15-20 væger før kirurgi (figur 2).
- Brug et tandlægebor til hurtigt perforere knoglen Trommehulens bulla på en kontrolleret måde. Anvendelse af et bælte drevet dental hånd boremaskine med en 1 eller 2 mm tilspidset tip er at foretrække. En operativ mikroskop er nødvendig for at gennemføre protokollen. (se trin 4.7)
- Pre-trække 0,2 ml af en vandig opløsning indeholdende det valgte ototoksiske middel i en 1 ml tuberculinsprøjte med en 28 G, 1/2 'nål. Typisk 1 dråbe (~ 10 pi) af midlet er tilstrækkelig til helt at fylde musen RWN. En metallisk, stump spids kanyle letter afgivelsen af midlet og samtidig forhindre skade på underliggende strukturer ved en skarp spids skråkant. Uddrive eventuel luft i sprøjten, da bobler uforvarende kan fylde RWN og / eller forhindre korrektanvendelsen af midlet til det runde vindues selv.
- Fjern skind fra den post-øret huden ved hjælp af elektriske grooming neglesaks. Fjern skind i en zone, der strækker sig fra auriculo-cephaliske krølle rostrally til skulderen bælte caudalt. Forlæng hårfjerning fra dorsale, sagittale midterlinjen til den mandibular vinkel sideværts. Korrekt pels fjernelse er altafgørende at opretholde et rent og klart kirurgiske område. Forsigtigt børste udklip fra den tilsigtede operationsstedet.
- Sterilisere huden på forberedt areal pr institutionelle protokoller. Anvend Betadine (povidon / iod) vekslede med ethanol topisk i en cirkulær måde for 2 min. Andre midler kan erstattes pr institutionelle retningslinier.
- Placer dyret på en flad overflade for at opretholde konstant krop positionering under proceduren. Brug en lille varmepude placeret under kroppen på platformen for at kontrollere kropstemperatur under proceduren for at opretholde dyrets kropstemperatur ved 36-38 ° C. Må ikke overheat dyret, da det kan føre til mild til alvorlige skader huden og / eller tidlig dødshjælp.
- Fastgør lederen af dyret via en bid blok / hoved holder apparat. Udnytte en 0,5 cm x 2 cm bideklods bearbejdet af messing med 2-4 huller mm diameter boret igennem det på 5 mm intervaller langs den lange akse. Åbn dyrets mund omkring dette stativ og passer de øvre centrale fortænder ind i et af hullerne afhængigt af dyrets størrelse. Stram forsigtigt en lille klemme over dorsum af dyrets snude til holde det på plads (figur 3).
- Kontroller, at bideklods / hovedholderen stift er forbundet til midten af en U-formet svingarm (figur 3). Sikre en 1 cm bred stang til venstre arm af "U" og bruge stang som en venstre-side hoved hvile (højre side er altid den operative side).
- Når fast nedpakket i hovedholderen, rotere musen til en venstre lateral decubitus position. Placer kroppen carefully på den flade drift overflade for at sikre, at det vil være stabil under hele proceduren og undgå unødig torsionsbelastning på halshvirvlerne.
- Placer et operationsmikroskop stand til 4x, 10x, 20x forstørrelse og over kirurgiske område. Bekræft, at mikroskopet kan fastholde sin position i en håndfri måde som det er ideel til to-hånds kirurgisk protokol diskuteret nedenfor.
- Placer en bipolar-aktiveret cautery enhed med fine tippet guldsmedens hånd brik i en position, der er umiddelbart tilgængelige for bistand i ætsninger af små fartøjer og dissektion af væv. Det kan også være nødvendigt, bør tungere blødning opstå.
4. Kirurgisk Approach
- Under mikroskopisk forstørrelse, bruge skarpe saks eller en skalpel til at skabe en 1-1,5 cm postauricular snit, ca. 6-8 mm caudale til den auriculocephalic krølle. I voksne mus, et snit fra den dorsale midtlinjelateralt til et punkt i nærheden af vinklen på underkæben er tilstrækkelig. Undgå forsigtigt at skære dybt for at bevare underliggende vaskulære strukturer.
- Foretage omhyggelig dissektion gennem det subkutane fedtlag, som kan være af variabel tykkelse. Fedt kan sikkert fjernes, hvis nødvendigt for at forbedret eksponering. Tag forsigtighed, når dissekere i en ventral-mediale retning som den eksterne halsvene krydser dette område, og skader på denne struktur kan medføre store mængder blodtab og oversvømmelse af det kirurgiske område. Styre enhver overdreven blødning med absorberbare gelatinesvampe og / eller bomuld pellets. Brug bipolar kautering for tungere blødning.
- Når fedtet lag er korrekt opdelt, udsætte halsmuskulaturen. Bemærk vigtige strukturer, herunder den store muskel krop af cleidomastoideus centralt inden for det eksponerede kirurgiske område, den eksterne halsvene ventralt og parotideale væv rostrally overliggende vinklen på underkæben. En vigtig milepæl er en lille nerve Branch (af kranienerve XI), der ombrydes omkring den bageste / dorsale kant af cleidomastoideus at udvide rostrally mod det ydre øre (figur 4).
- Forsigtigt trække cleidomastoideus muskel krop i en posterior / dorsal retning (figur 4, 5). Opdele forsigtigt den gennemsigtige fascia omslutter musklen kroppen. På lignende måde, træk forsigtigt parotideale og ydre halsvene i den modsatte (anterior / ventrale) retning (figur 5).
- Med god tilbagetrækning af cleidomastoideus muskel krop, vil den blanke kuppel Trommehulens bulla periosteum kommer til syne (figur 6). På den kaudale aspekt af bulla, indsættelse af en dybere cervikal muskel, den sternomastoideus, vil komme til syne (figur 6). Bevar ansigtsnerven, som bliver synlig på ryg og rostral aspekt af bulla kuppel. Placer en selvstændig fastholde retraktor (Steril titan shaft-- indlejret i den disponible silikonepaste) forud for boringen.
- Med to-hånds teknik, forsigtigt opdele bulla periosteum med bipolar diatermi at eksponere den underliggende knogle. Brug pincet eller en Otologisk- curette, forsigtigt løfte og skubbe periost i en perifer retning til bredt eksponere bulla kuppel.
Bemærk: Trin 4.6 er kritisk for at maksimere kirurgisk visning af mellemøret plads. Udnytte omhyggelig og blid blødt væv behandling for at undgå blødning og / eller lækage af interstitiel væske ind i hulrummet bulla efter boringen. - Ved en korrekt eksponeret bulla dome, bores et 2 mm styrehul gennem bulla ben med en tandkirurgiske boremaskine mellem caudale margin af kuplen og synligt uigennemsigtige linje (der repræsenterer trommehinden), der strækker på tværs af rostrale aspekt af bulla (figur 7). Sørge for at bore gennem knoglen kun at bevare underliggende strukturer, såsom stapedial arterie. Bor et andet pilot hul i nærheden for at lette un-tagdækning af bulla knogle (<strong> Figur 7).
- Ved hjælp af et par af guldsmedens spids pincet, Tag hætten af bulla knogle i en dorsal og kaudal retning (figur 8). Fjern knogle i en stykkevis måde under høj forstørrelse. Du må ikke punktere stapedial arterie, der ligger direkte under bulla cap, da blødning fra denne arterie kan kompromittere proceduren. Minimere mængden af knogle fjernet for at forhindre post overdreven fluid til mellemøret mens det stadig tillader fremragende visualisering og adgang til det runde vindues fordybning (figur 8).
5. runde vindue Anvendelse af ototoksiske Agent
- Foretag subtile roterende justeringer hovedholderen at bringe RWN holdent til syne. Den RWN er typisk placeret på den dorsale og caudale aspekt af mellemøret plads og fremstår som en kop-lignende indrykning af otiske kapsel knogle. I de fleste tilfælde stapedial arterie løber 1-2 mm ventral / rostralt dette. Den RWN kan undertiden være tucKED perifert under en akut vinkling af bulla kuppel. I sådanne tilfælde omhyggelig placering af dyrets hoved er altafgørende.
- Brug af papir væger forberedt præoperativt, fjerne alle synlige væske i mellemøret og RWN indtil tør knogle visualiseres.
Bemærk: Dette er det mest kritiske trin i hele protokollen, som ~ 10 pi (1 dråbe) af ototoksiske middel påføres på RWN let kan fortyndes med denne væske.
- Brug af papir væger forberedt præoperativt, fjerne alle synlige væske i mellemøret og RWN indtil tør knogle visualiseres.
- Under maksimal forstørrelse, skal du bruge en fin kaliber nål på en 1 ml tuberkulin sprøjte til at anvende en dråbe (~ 10 ul) af ototoksiske middel direkte til RWN, fylde det helt. Pas på ikke at forstyrre den stapedial arterie og observere nøje for udskiftning af en lille lys refleksion i bunden af en tør niche med en sløv og diset fluid menisk som en indikator for, at niche fylder korrekt.
- Tillad midlet til at hvile i RWN for ca. 10 min eksponeringstid. Efter dette, helt wick ud agenten og erstatte den med en ny anvendelse af den samme agent. Bestem gentagelser af ansøgning i henhold til agent specifikationer. Total eksponeringstid i denne procedure ligger typisk mellem 30 til 60 minutter.
- Ved afslutningen af proceduren, helt bortsuge agenten en sidste gang og anvende frisk middel til RWN. Lad bulla ikke-reducerede og bruge pincet til at lukke det bløde væv over operationsstedet.
- Seal operationsstedet på niveauet af huden med en 4-0, ikke-absorberbar monofilament sutur. Placer dyret i et opsving bur / station. Overvåg dyrets kliniske tilstand regelmæssigt efter operationen. Bevar dyret i passende miljøforhold, herunder bolig med blødt sengetøj og tilskud af blød mad, for at minimere stress. Bestem fremtidige procedurer og post-operative betingelser, i henhold til de institutionelle IACUC protokoller.
- Brug institutionelle IACUC protokoller til at sterilisere instrumentets før brug på den næste dyr. Tillad for korrekt køling tid mellem instrument brug.
6. Postoperative Procedurer og Cochlear Tissue Høst
- Som beskrevet i trin 2.5, udføre fysiologiske test af hørelse postoperativt ved ønskede punkter og før aflivning. Udfør Postoperative procedurer i henhold til eksperimentelle formål. Sacrifice dyret på en hvilken som helst ønsket postoperativ dag.
- Ved fuld bedøvelse via IP-injektion, som det kræves per institutionelle IACUC protokoller, ofre dyret. Ved hjælp af skarp saks, halshugge dyr bare caudale til nakkeknude. Skarpt åbne kranielle hvælving med en saks langs ryg og ventral midterlinjen og spredes bredt. Forsigtigt øse ud hjernevæv at blotlægge den tidsmæssige knogler.
Bemærk: En række procedurer for undersøgelse af ændringer efter eksponering i cochlea kan forgrene fra dette punkt og vil blive nævnt i diskussionen afsnit. Bestem den undersøgende metode mest relevant til de eksperimentelle formål. Hvis elektronmikroskopi er planlagt efter cochlea er sektioneret, brug hjertekateterisation at pre-fix vævet. Dette ligger uden for rammerne af denne diskussion, og er blevet dækket i dybden andetsteds. 13 - Skær tindingeben ud af kraniet base med saksen og straks placeret i fikseringsopløsning. Fordybe knogler direkte i 4% paraformaldehyd i 1,5 timer ved stuetemperatur. Overvåg fiksering tid, som længere varighed kan begrænse resultaterne af histologisk analyse på senere trin. Afkalkes dissekeret ben til et variabelt tidsrum via nedsænkning i 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
Representative Results
I en nylig undersøgelse fra Stevens et al udnytte den ovennævnte protokol, blev voksne CBA / CaJ mus af begge køn eksponeret via runde vindue diffusion til heptanol. 15 Heptanol er et hul junction un-kobling kendt for at producere målrettet, erstattes skade på celler i cochlear sidevæg. Formålet med undersøgelsen var at producere en pålidelig model for målrettet cochlear skade, der giver mulighed for undersøgelse af post-kirurgisk regenerering af beskadigede elementer. Pre-kirurgiske og post-kirurgiske høretærskler tjente som en funktionel endpoint. Mikroskopi og immunohistokemisk farvning blev anvendt til at undersøge morfologiske ændringer. Væsentlige stigninger i ABR tærskler blev observeret i heptanol-behandlede mus (figur 9). Kontroldyr der fik simuleret kirurgi, med levering af saltvand i stedet for heptanol, viste ikke signifikante tærskel skift på ethvert testet frekvens.
Immunfarvning mod en indad rektifikationkalium kanal (Kir) 4.1 fungerede som en indirekte metode til at visualisere skader / nyttiggørelse af cochlear strukturer. Dette viste meget reproducerbare forskelle mellem behandlings- og kontrolgrupper ører. Samlet farvningsintensitet var markant nedsat i stria vascularis (STV) og blandt fibrocytter af spiral ligament (SLF) 1-3 dage efter heptanol eksponering, der angiver store mængder af målrettet beskadigelse af disse områder. Der var en særlig fald i Kir 4.1 farvningsintensitet på områderne type II og type IV SLFs (Figur 10) og STV (figur 11). Bevis for forstyrret nukleare integritet og kromosomale kondensation / bleb'er typiske for cellulær apoptose blev også set på nukleare counterstains i disse cochleære områder (figur 10). Vakuoliserede zoner af Kir 4.1 farvning løst markant på 7 dage og var fraværende helt på 14 dage. Når Kir 4.1 farvningsintensitet blev kvantificeret i de områder af STV, behandlede ører demonstrerede en initial trug efterfulgt af et markant skift (p <0,05) tilbage mod kontrol intensitet 7 dage efter heptanol eksponering (figur 12).
Figur 1. Instrument oprettet. Afbildning af præ-kirurgisk opsætning af instrumenter. Alt udstyr skal være let tilgængeligt inden for det sterile kirurgiske område. Typisk instrumentering omfatter 2 skarpe dissektion saks, 2-3 lige og / eller buede spids guldsmedens pincet med øre curettes, buet aksel Otologisk- picks (senere erstattet med Rosen picks - ikke vist), og en elektro-cautery enhed med fine buede spids guldsmedens pincet medaljon. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kirurgisk forsyninger. Yderligere leverancer for at opretholde RWN miljø. Steriliserede labwipe udskæringer til papir væge dannelse (til venstre), væger stramt-formet papir lavet af steriliseret lab servietter (i midten), og 4 mm bomuld pellets (højre) anvendes til at tørre overskydende væske og blod oversvømmelser i det runde vindues fordybning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. dyrehoved holder. Billede skildrer hoved holder og bid blokere den. Hullerne i blokken passer og fastgør den øverste centrale fortænder. En klemme forsigtigt strammes over dorsale snude at sikre dyret på plads. Anvendelse af et hoved holder er kritisk for en vellykket kirurgisk outcome. Ideelt set bør dette være i stand til at dreje omkring rostral-caudale akse af dyret for at optimere kirurgiske udsigt over bulla under proceduren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Cleidomastoideus m.. Skematisk diagram, der viser den grundlæggende anatomi gnaver halsmuskulaturen og dets associering med den eksterne halsvene. Den cleidomastoideus muskel er den mest let identificeres muskler under den kirurgiske fremgangsmåde. Frigivelse af omsluttende fascia efterfulgt af posterior / dorsale tilbagetrækning af musklen krop vil lede kirurgisk dissektion mod tympaniske bulla (sort cirkel). Klik her for at se alArger version af denne figur.
Figur 5. Kirurgisk eksponeringsområde. Afbilder eksponering efter dissektion gennem kutant og subkutant fedt lag. Strukturelle vartegn i note omfatter en gren af kranienerve XI overlejrer cleidomastoideus musklen (A), den eksterne halsvene (B), og udsat parotideale væv (C). Den kranienerver XI filial er ofte forbundet med en lille beholder og skal opdeles før du fortsætter. Højre til venstre på billedet svarer til dyrets rostral-caudale akse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Udsættes bulla. Eksponering af Trommehulens bulla efter tilbagetrækning af cleidomastoideus og de omkringliggende strukturer. Bemærkelsesværdige vartegn omfatter cleidomastoideus muskel krop (A) afspejlede bagtil / dorsalt, facial nerve (B), og den blanke kuppel Trommehulens bulla periosteum (C). Bemærk også, at indføring af sternomastoideus muskler på venstre kaudale aspekt af den tympaniske bulla (asterisk). Tilstedeværelsen af facialisnerven på den dorsale og rostrale aspekt af bulla er en kritisk milepæl for ægte identifikation af bulla. Højre til venstre på billedet svarer til dyrets rostral-caudale akse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Udsættes runde vindues fordybning jeg. Billede forestiller tympanic bulla fuldt eksponeret efter dissektion af den overliggende periosteum. Pilothullet er bedst placeret halvvejs mellem caudale kant bulla kuppel og en subtil uigennemsigtig linje visualiseret i rostralt aspekt bulla (der repræsenterer trommehinden). En anden, der støder pilot hul kan fremme lettere un-tagdækning af bulla knogle. Undgåelse af dybe boring bør tages for ikke at skade den underliggende stapedial arterie. Den mørke, metalgenstand i bunden af billedet er retraktoren titanium blødt væv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. udsættes runde vindues fordybning II. Udjævnede tympaniske bulla med eksponering af det runde vindues fordybning (pil) og stapedial arterie (rød struktur1-2 mm lateralt for niche) set under 20x forstørrelse. Den niche ofte lægger i en position gemt under den spidse vinkel dannet af bulla dome med otiske kapsel på caudale aspekt af kuplen. Det er bydende nødvendigt, at en fuldstændig visualisering på nichen opnås før påføring af ototoksiske middel eller vægevirkning. Overdreven fjernelse knogle under hætten tages bør også undgås, da interstitiel væske / blod tendens til at oversvømme hulrummet, når store huller blev oprettet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Repræsentative resultater -. Heptanol høretab og nyttiggørelse Mean auditive hjernestammen respons (ABR) grænseværdier (dB SPL) afbildet som en funktion af tone pipfrekvens. Målinger er grupperet efter forud eksponering (Black-Control) og postoperativ dag (POD) 1, 7 og 14 (rød). Fejlbjælkerne viser SEM. Figur blev re-plottet fra Stevens et al. 2014. 15 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. Repræsentative resultater - Målrettet cochlear skader efter heptanol eksponering del I. Ændringer i Kalium Indre ensretter (Kir) Kanal 4.1 farvning i stria vascularis (STV) af ørerne behandlet med heptanol og kontrollere ører. (A) Normal Kir 4.1 farvning typisk for kontrol ører med stærke strial celle affinitet for Kir 4.1 (grøn). (B) Behandling øre på POD1. Store vacuolized zoner af DECRlempet Kir 4.1 affinitet ses i STV (Pilespidser) sammen med et samlet fald i STV Kir 4.1 farvningsintensitet. Kerner modfarvet med propidium iod (rød) (B). Målestokken = 15 um. Figur blev re-plottet fra Stevens et al, 2014. 15 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11. Repræsentative resultater - Målrettet cochlear skader efter heptanol eksponering del II Ændringer i spiral ledbånd (SL) i heptanol behandlet øre i forhold til at styre øre.. (A) Normal Kir 4.1 farvning (grøn) i SL typisk for kontrol øret med normalt udseende type II spiral ligament fibrocytter (II). (B) Heptanol treated øret med markant fald i Kir 4.1 farvningsintensitet i området af type II spiral ligament fibrocytter, nuklear forstyrrelser og kromosomale kondensationsprodukter / bleb'er i overensstemmelse med apoptose (pile). Kerner modfarvet med propidium iod (rød). Målestokken = 15 um. Figur blev re-plottet fra Stevens et al, 2014. 15 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12. Repræsentative resultater -. Inddrivelse af cochlear farvningsintensitet efter heptanol eksponering gennemsnitlige relative luminans Kir 4.1 farvning plottet som funktion af post-eksponering dag. Relativ luminans er beregnet som Kir 4.1 reflekterende intensitet under konfokal mikroskopi i heptanol godbided ører taget som en procentdel af det samme i kontrol ører. Bemærk POD14-28 data samles som et enkelt punkt på kurven. Udfyldte cirkler repræsenterer middelværdier mens fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. En væsentlig genopretning af relativ luminans blev demonstreret mellem POD 7 og senere datoer (Students t-test p <0,05, stjerne). Figur blev re-plottet fra Stevens et al., 2014. 15 Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen og repræsentative resultater, der er beskrevet ovenfor, blev opnået i en CBA / CaJ musemodel herunder begge køn. Denne indavlet stamme er veletableret som en "god hørelse" standard og "normal aldring" model i at høre forskning. 16-23 Beskrivelse af brugen af denne protokol i andre pattedyr modeller er uden for rammerne af denne tekst. Læseren bør dog bemærkes, at RWN påføringsteknik giver flere fordele til at studere pattedyrs indre øre. Af disse er den mest bemærkelsesværdige er, at man undgår direkte forstyrrelse af den fine anatomisk struktur og biokemiske gradienter, der findes inden for væggene af otiske kapsel. Procedurer såsom cochleostomy og implantation af infusionspumper har tilbøjelighed til direkte krænke indre øre strukturer, der fører til permanente tærskel forskydninger; et faktum, der skal tages i betragtning, når man analyserer resultater. Afbrydelse af cochlear sidevæg strukturer ved invasive methods kan også begrænse brugen af ototoksiske midler såsom furosemid eller heptanol, hvis specifikke zone af effekt er begrænset til denne placering. 15,24 Alternative ikke-invasive metoder såsom trans-tympaniske injektion og parenteral injektion er blevet plaget af upålidelige resultater og / eller systemisk toksicitet for dyremodel. Denne påføringsmetode har vist sig at undgå begge disse mangler, at opnå en vis ensartethed, der nærmer sig de mere invasive metoder diskuteret ovenfor.
Andre fordele ved denne teknik omfatter dens brede anvendelighed til en række dyremodeller og muligheden for at inkorporere en eksisterende laboratoriefaciliteter. Med hensyn til sidstnævnte er der ingen specialiserede reagenser eller kemikalier kræves bort fra de valgte ototoksiske midler, anæstetika og analgetika. Ototoksiske midler anvendes typisk ved en fast koncentration og blandes i et tilstrækkeligt stort volumen af opløsning (5 ml) til at vare lange perioder overvejeing hvert program bruger omkring 10 pi (i mus). Således efter den indledende indkøb af forsyninger og instrumenter, efterforskere er relativt fri for tidskrævende løsning forberedelse eller hyppig udskiftning af materialer. Denne teknik giver også reduktioner i operativ tid, som kan være væsentlig i forhold til procedurer, der involverer implantation af perilymfatisk infusionspumper eller cochleostomies. Efter at have nået et niveau af tekniske færdigheder, vores gennemsnitlige færdiggørelse tid fra indledende snit til lukningen var typisk 20 min til 1,5 timer afhængigt af længden af eksponeringen ønskes for ototoksiske middel. Tre eller fire operationer kan nemt være afsluttet i en enkelt dag, der giver mulighed for øget effektivitet og øget potentiale for at opnå succesfulde resultater. Som beskrevet ovenfor er denne metode kan også nemt anvendes til en række af gnavermodeller herunder mus, rotter, marsvin og hoppemus.
Begrænsninger af denne metode er centreret påmoderat stejl indlæringskurve er nødvendig for at mestre det og faldt forventede resultater indtil tekniske færdigheder er nået. Som det vil blive diskuteret mere detaljeret nedenfor, vil små fejl under kirurgiske metode eller utilstrækkelig visualisering af det kirurgiske område næsten uvægerligt føre til en dårligt resultat. Subtile fund, som en novice kan undlader at anerkende, såsom en sub-millimeter tyk luftboble blokerer adgang af midlet til det runde vindue membran eller interstitielle væske fortynde agenten, tage tid til at værdsætte og udvikle de psykomotoriske færdigheder, der kræves for at rette dem. Men med gentagen kapacitet af proceduren disse hindringer overvindes let og udgør en mindre skræmmende teknisk udfordring for forskere end nogle af de førnævnte invasive metoder. Endelig er denne teknik forbundet med den relative begrænsning, at cochlear skade kun kan induceres på et enkelt tidspunkt under det kirurgiske eksponering. Dette kan overvindes til en vis grad, Ved at fylde RWN med absorberbare gelatine svamp i middel som blev beskrevet af Heydt et al. 10. absorberbar gelatinesvamp vil resorberes over tid, men kan give mulighed for en længere eksponeringstid, end det er opnåeligt ved anvendelse af en vandig opløsning alene.
For at en efterforsker til at realisere de fulde fordele ved denne teknik og undgå faldgruber, er det afgørende at anerkende de to kritiske elementer i denne teknik: 1) konsekvent fastholde visualisering af mellemøret plads og RWN; og 2) evne til at holde operationsfeltet fri for interstitiel væske og / eller blod. At opnå den førstnævnte af disse, kan betydningen af en ordentlig head-indehaveren ikke overvurderes. Sikker fiksering af dyrets hoved sikrer en stabil visning under mikroskop; hvis betydning bliver let indlysende, når subtile instrumentering drastisk ændrer positioneringen af strukturer under forstørrelse. En god hEAD holder, der kan rotere om dyrets rostral-caudale akse letter også vigtige dynamiske ændringer i investigators linje af webstedet. Ofte kan et par millimeter rotation omkring denne akse betyde forskellen mellem visualisering af RWN og visualisering af kun otiske kapsel knogle. Evnen til konstant at ændre opfattelse er også afgørende at sikre interstitiel væske fjernes ordentligt fra dybet af den niche, og også at den ototoksiske middel er fuldt fjernes mellem applikationer som diskuteret i del 5. Det er vores erfaring, blod, kondens eller interstitielle væske der kommer ind i mellemøret plads har evnen til at forstyrre hele forsøget. Dette er ikke overraskende, da den lille mængde af ototoksiske middel påføres det runde vindues (~ 10 pi) kan let fortyndes ved at komme i kontakt med selv små mængder af uvedkommende væske. Af denne grund, omhyggelig kirurgisk dissektion stykkevis hætten tages Trommehulens bulla og omhyggelig preservation af stapedial arterie er ensbetydende med en vellykket eksperimentelle resultater.
Hvis der observeres ovenstående kritiske trin og forventede resultater stadig ikke nået, bør fejlfinding påbegyndes. Det er vores erfaring, er det ofte nyttigt at udføre forsøg variationer af to proceduremæssige elementer. Den første er at ændre den hyppighed, hvormed det ototoksisk middel er genopfyldes i den runde vindue. Afhængigt af det middel, der anvendes, den samlede eksponeringstid er mellem 30 minutter og 1 time, med komplet vægevirkning og efterfølgende udskiftning af midlet hver 10 min. Hvis udsætte for kortere varigheder, kan øge den samlede eksponering tillade agenten mere tid til at diffundere over det runde vindues membran. Yderligere eksponering og efterfyldning kan også bidrage til at undgå uønsket fortynding af ototoksiske middel ved blod, kondensation eller interstitiel som beskrevet ovenfor. Forsigtighed bør opretholdes, når du bruger denne metode, men som det har en tendens til at øge risikoen for utilsigtetly at beskadige stapedial arterie og / eller indfører interstitiel fluid til RWN.
Denne teknik er signifikant i, hvad det giver til undersøgelser af cochlear fysiologi og patofysiologi. Dette minimalt invasiv teknik tillader detaljeret undersøgelse af sarte biokemiske processer og har været ensbetydende med at fremme vores forskning til formål at vurdere cochlear regenerativ potentiale. 12,24 Denne kirurgisk tilgang og eksponering også gengives på tværs af en række andre aflægger, teknikker, og vellykkede resultater ved hjælp af denne metode er blevet rapporteret i studier af cochlear stamcelle implantation. 14 En stor del stadig er ukendt om cochlea, men denne teknik, sammen med den bredere armamentarium rådighed for efterforskerne, vil støtte i at indsnævre denne viden hul.
Disclosures
Ingen konkurrerende økonomiske interesser. Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Heptanol 98% | Sigma-Aldrich | H2805 | PubChem Substance ID 24895536 |
| Ketaset Injectable | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Concentrate 100mg/ml |
| (Ketamine HCl) | 10 ml | Schedule CIII controlled substance | |
| Anased Injectable | Lloyd Laboratories | NADA# 139-236 | Concentrate 20mg/ml |
| Buprenex Injectable | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Concentrate 0.3 mg/ml |
| (Buprenorphine HCl) | 5 ampules per box | Schedule CIII controlled substance | |
| Betadine Skin Prep Solution | Medline | MDS093941 | 1 Quart screw top bottle |
| 0.9% Sterile Saline | Variable | For mixing solutions and injections | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | 32192 | |
| Controlled Acoustics Environment Sound Booth | Industrial Acoustics Company | ||
| Surgical Head Holder | Custom Made – | Please see Figure 3 | |
| Medical University of South Carolina | |||
| Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch | World Precision Instruments | 555801L | Maximum spread 20 mm |
| Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder | |||
| 90N Dental Belt Driven Hand Drill | Emesco | Vintage Item | |
| Scalpel Handle Size 6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
| #15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade | Bard-Parker | SKU: 097-7215 | 50 Blades/Box |
| Via ACE Surgical Supply Code | |||
| Straight Tip Jewelers Forceps | Bernell | MIL17304 | |
| Iris Scissors Curved | Medline | DYND04026 | |
| Iris Scissors Straight | Medline | DYND04025 | |
| Stevens Tenotomy Scissors Straight | Medline | MDG3222111 | |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.00 | Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.01 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | CODE 34155 | White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks. |
| House Ear Curette, 6” shaft, light angle | Medline | MDG0396486 | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 | Medline | IIS34201 | Substitutions may be made |
| Cotton pellets #3 4 mm | Richmond | Manufacturer Code 100108 | |
| ElectroSurgical Unit 100 E M/M | Elmed | List No. 52-5770 | Bipolar and Monopolar Capable |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle | BD | Product Number: 329410 | Optional for delivery of Ototoxic agent |
| 23G, blunt tip, 1” length needle | Kendall | Product Code 8881202397 | For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery |
| Surgical Mask | U-line | S-10478 | |
| Exam Grade Nitrile Surgical Gloves | U-line | S-12549 | |
| Precision Hair Clippers | Wahl | Multiple models may be substituted | |
| 5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13 mm 3/8 circle needle | Ethilon | 1855G | Substitutions may be made. |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisher | 01-812054 | |
| Dry Sterilizer | ROBOZ | Germinator TM 500 |
References
- Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E.
- Dodson, H. C. Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides. Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).
- Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin. The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).
- Lee, K. S., Kimura, R. S. Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).
- Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).
- Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).
- Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers. Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).
- Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells. Hearing research. 125, 109-119 (1998).
- Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse. Hearing research. 162, 65-74 (2004).
- Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear. Hearing research. 265, 70-76 (2010).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).
- Lang, H., et al. Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).
- Stevens, S. M., et al. Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing research. 130, 94-107 (1999).
- Hequembourg, S., Liberman, M. C. Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).
- Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons. The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).
- Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice. Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).
- Tang, X., et al. Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse. Neuroscience. 259, 184-193 (2014).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits. PloS one. 9, e90279 (2014).
- Lang, H., et al. Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).
