Introduction
의학 연구는 인간 세포주 및 동물 모델 모두 연구 막대한 이득이다. 세포주 나은 시스템의 구성 요소의 제어뿐만 아니라, 적절한 유기체의 세포의 사용을 허용한다. 세포주는 응답 (1)에 영향을 미칠 수있는 다른 세포, 기질 구성 요소 및 기관의 영향을 요점을 되풀이하지 않을 수 있기 때문에, 더 대표하면서, 건강과 질병에 대한 책임을 질 수 있습니다 메커니즘을 획기적으로 단순화 된 스냅 샷을 제공, 인간 세포에 대한 작업. 반면에, 동물 모델은 인간의 질병 및 유전 적 이질성 재생 전적으로 정확하지 않지만, 대부분의 모델 동물 2,3-에서 전체 시스템의 입력을 허용함으로써 추가 통찰력을 제공.
단점은 제쳐 놓고, 두 방법은 자신의 장점을 가지고 상호 보완 적이다. 그러나, 주요 목표는 전신, 멀티 기관 시스템에서 인간의 세포와 기관, 연구 남아있다. 따라서, 중개 연구는 탁을 가지고더 나은 메커니즘을 기저 질환을 파악하기 위해, 인간의 기관 및 환자에서 추출한 조직의 연구를 촉진 장족의 발전 갖추고 있습니다. 중개 연구함으로써, 몸 전체에서 적절한 세포에서 치료 및 질환의 연구 결과와 동물 세포 일 (4) 사이 모두의 장점을 제공하는 이점을 제공한다.
중개 연구는 결함없이도 없습니다. 인간의 환자에서 수확 표본, 호스트로부터 제거시 즉시 허혈하고 그렇지 않으면 보호 될 수있는 다른 외부 요인을 실시한다. 이 스트레스 유발 분자 유전 학적 변화가 발생하고, 이후의 연구에서 편견의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 많은 노력이 가장 하류 연구 5 장기 및 세포의 무결성을 유지하기 위해 엄격한 방법으로 조직을 추출하고 처리에 투입되었다. 방법 (을)를 선택했을 때 중요한 것은, 미래의 응용 프로그램은 밀접하게 고려되어야한다F 특정 방법은 세포 성분에 유해 할 수 있으므로, 인간의 샘플을 처리하고 다른 사람을 살려주는 동안 신호 전달 경로.
인체 조직을 포함하는 모든 연구, 규제 문제를 해결해야합니다. 터스 키기과 벨몬트 보고서 이후, 생물 의학 연구는 고유의 위험은 종종 피할 수없는 윤리적 딜레마 (6)의 결과와 관련되었다는 사실의 성장 수용이 있었다. 국가 표준의 필요성을 인식하고, 연방 정부는 벨몬트 보고서의 원칙을 유지 (명, 선행, 정의에 대한 존중)하는 수단으로 임상 시험 심사 보드 (IRBs를) 만들었습니다.
모든 기관의 IRB는 연구 참가자를 보호 할 책임이 있습니다 의사, 연구자 및 지역 사회 구성원의위원회이다. 그것은 자발적 동의는 생물 의학 연구의 모든 연구 참가자를 얻을 수 있어야하고,이 동의는 동의 FO에 설명하는 것이 RM. 동의서 프로세스 정보 결정은 연구에 등록 또는 가입 상태를 유지할지 여부에 제조 될 수 있도록 참가자에게 적절한 정보를 제공하는 것을 목적으로한다. 이와 관련, 동의서 문서는 좋은 가독성이 있어야 쉽게 표적 집단에 의해 (6 일 ~ 8 학년 읽기 수준) 이해 될 수있다 언어로 작성되어야한다. 강압 또는 부당한 영향의 가능성을 최소화 할 수 있어야하고, 피사체가 참여를 고려할 충분한 시간이 주어져야한다. 참가자는 처벌하지 않고 연구의 과정에서 모든 단계에서 동의를 철회 할 수있는 권리를 행사할 수 있어야합니다. 자발적인 동의서는 연구 주체의 참여를위한 필수 전제 조건이며 또한 7 법적으로 유효하다.
인간의 보호를위한 규정에 따라 과목 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), 연구 참가자는 연구의 목적을 통보해야하며, 연구에 참여 절차 참여에 대한 대안, 사회에 대한 가능성이 개인에게 연구의 모든 예측 가능한 위험과 불편 (뿐만 아니라 신체적 상해뿐만 아니라 수, 심리적, 사회적, 경제적 피해, 불편 함, 또는 불편 포함), 혜택, 피사체가 참여 할 것으로 예상되는 시간의 길이, 사람은 참여가 자발적임을 나타내는 문, 질문에 대한 또는 연구 관련 부상이나 응급 상황에 대한 답을 문의하고 참여하는 것을 거부는 정기적으로 임상 치료에 타협으로 어떤 결과 또는 혜택을 상실하지 않습니다 참가자가 다른 권리가 있음을 기밀성과에서 철수하는 오른쪽에있는 피사체의 권리에 관한 마지막으로 문을 그 / 그녀의 진단의 결과로 수신하고어떤 결과없이 언제든지 연구. 연구의 과정에서 동의를 철회 참가자의 조직 표본 뱅크해서는 안 즉시 소진해야합니다. 동의서의 하나 또는 그 이상의 요소의 면제는 실질적으로 필요한 요소 또는 필수 요소가 적용되지 않습니다 연구에 대한 변경없이 할 수없는 몇 가지 연구 프로젝트에 대한 IRB에서 얻을 수있다. 큰 관심은 데이터의 기밀성을 보장하기 위해주의해야합니다. 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률 (HIPAA)을 사용하거나 참가자의 서면 동의없이 "보호 된 건강 정보"(PHI)를 공개 방지 연방법입니다. PHI 포함하지만 의료 정보 전송되거나 유지 어떠한 형태 또는 매체와 9 개인을 식별하는 데 사용될 수있는 필드들에 한정되지 않는다.
이 작품을 통해 우리는 tissu 과정에서 지켜야하는 프로토콜을 간략하게 설명하는 것을 목표로전자 처리 - 조달을 포함하고, 저장하고 조직 추출시에받는 응력으로 인해 발생할 수 편향을 최소화하기 위하여 이러한 엄격한 가이드 라인을 다음의 중요성을 강조한다. 독자가 무엇을 분석 (들)에 가장 적합한 자신의 요구에 자격을 갖춘 판단을 할 수 있도록 우리는 또한 다운 스트림 분석 또는 표본에 대해 수행 할 수있는 분석 (그림 1)에 대한 간략한 개요를 제공하기 위해 노력하고 있습니다.
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Protocol
윤리 문 :이 프로토콜은 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학에 의해 승인됩니다.
1. 표본 조달
- 잉여 종양 및 관련 정상 조직 10-12에서 연구 조직 샘플을 수집합니다. 젖은 얼음에 보관 검체는자가 분해를 방지 할 수 있습니다.
- 병리학 적 진단을 용이하게하기 위해 모든 조직, 의료 기기 및 필요한 검사에 대한 병리학 부서 수술 중 제거 이물질을 보냅니다.
- 적용 할 수있는 연구 조직 은행의 정책 및 절차에 따라 연구에 할당 된 조직을 처리합니다.
참고 : Biospecimen 컬렉션 병리학의 조정을 포함, 병리학 '조수, histotechnologists 및 조직 조달 전문가.
2. 병리학 품질 보증 (QA)
- 완료하고 초기 품질 보증 조치로 환자 기록을 확인하고 진단 PA를 검토 병리학에 문의tient 레코드 (병리학 리포트, 조직 슬라이드 등) 및 조직 샘플. 등이 biorepository 모범 사례 10-12에 따른다 등 종양의 비율, 괴사, 조직 종양 인터페이스, 같은 관심의 형태 학적 특성에 대한 판사의 조직 샘플.
- 초기 검토 후, biospecimen의 숙박의 전체 길이 중 biorepository 데이터와 연구 샘플의주기적인 검토를 수행.
- 샘플 및 기타 병리학 적 조사 결과로부터 링크와 주석 및 biorepository 독점 소프트웨어 시스템을 통해 연구원이 데이터를 제공한다.
주 : QA 프로세스 biorepository 동작 임상 기술적 측면 모두의 무결성을 보장한다. - 확인하고 임상 사용을 위해 샘플을 특징 짓는 유전 및 분자 테스트를 수행합니다.
- 수집 및 실험실 실험 샘플을 사용하고 연구자의 의견을 기반으로 데이터를 분석 할 수 있습니다. 선로바코드 기술을 사용하여 샘플. 이 전자 추적 시스템은 biorespository 모범 사례 10-12에서 주장한다.
3. 표본 / 조직 처리
- 항상 그것의 자연 환경으로부터 조직 샘플의 추출에 의해 유도 된 변화를 제한하기 위해, 가능한 한 빨리 신선한 조직 젖은 얼음 표본, 및 프로세스를 저장한다. 종양 정상적인 프로세스 정합 및 종양 조직 샘플을 별도의 교차 오염을 방지하기 위해.
주 : 연구 프로토콜에 근거는 biospecimen 처리 매체의 하나 이상의 유형에 시험편의 컬렉션을 포함 할 수있다. - 프로세스를 시작하기 전에, 멸균 페트리 배양 접시, 메스뿐만 아니라, 조직 처리 용 바늘 또는 집게를 준비한다. 튜브가 준비 표지 및 샘플 처리 (그림 2)의 시간을 제한하기 위해 배치되어 있는지 확인합니다.
- 이러한 환자 이름, 번호, 치료, 날짜 등 모든 관련 조직 정보,수술 및 연구에 적합한 수있는 바와 같이, 다른 관련 정보는, 기관 조직 데이터베이스에 용이하게 접근해야한다. 제한된 환자 정보는 종이 또는 스프레드 시트 형태로 실험실에서 개최한다.
참고 :. 만 연구 즉의 성격과 관련 biospecimen 정보를 수집, 질병 별 정보 등 기본적인 생물 의학 연구, 임상 연구, 중개 연구는 biorepository 직원은 현재 문학이 필요하다고 인정하는 데이터를 관리하는 조직을 수집해야 적절한 진단과 의미있는 연구를 보장합니다. 하지만, 여기에는 종양 등급과 암 스테이징 정보에 한정되지 않는다. - 각 유형의 분석뿐만 아니라, 절개의 위치에 대해 요구되는 조직 절편의 크기를 결정하기 위해, 미리 원하는 모든 후속 실험을 계획한다. 불가능 비록 이상적으로, 모든 분석은 조직 heterogenei을 고려하기 위해 전체 조직 절편을 대표한다타이 및 다운 스트림 분석의 한계 바이어스. 그림 2에 도시 된 바와 같이 사전에 필요한 모든 항목을 배치합니다.
- 표면에 평평하게 열려있는 페트리 배양 접시에서 조직 표본을 놓습니다.
참고 : 만 확인 된 샘플을 처리하고 확인 된 건강 데이터를 검토 할 수 biorepository 직원에게 권한을 부여 할 수 있습니다. 연구자는 IRB에 의해 규제로 서명 된 정보를 동의에 의해 허용하고 만 환자 식별자에 액세스해야합니다. 모든 시편은 적절하게 표시해야하며, 최소한의 고유 한 조직 식별 번호 및 조직 유형에 포함해야한다. HIPAA 규정에 따라, 라벨의 모든 건강 정보를 포함하지 마십시오. - 그 구조 및 치수의 더 나은 이해를 얻기 위해, 모든 각도에서 샘플을 검사한다. 바늘 접시의 바닥에 샘플을 핀과 최대 규모의 가장 대표적인 축을 따라 조직을 양분로 진행합니다.
- 조직의 작은 조각을 잘라 멸균 1.5 ml의 MICR에 배치RNA 안정화 용액 1ml를을 포함 ocentrifuge 튜브. 이 샘플은 프로세스의 나머지 얼음에두고 필요할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
참고 : RNA로 작업 할 때 장갑을 항상 착용해야하고, RNAse가없는 필터 팁 저하와 RNA 오염의 기회를 제한하는 데 사용되어야한다. - 페트리 배양 접시의 뚜껑을 열고 미리 라벨링 생검 카세트를 배치합니다. 3-5mm보다 더 두꺼운 조직의 조각을 잘라 카세트로 전송. 72 시간의 최소 10 %에서 카세트 중성 포르말린 (NBF)를 놓습니다. 파라핀 매립하기 전에 장기간 저장을 위해 70 % 에탄올에 카세트를 옮긴다.
참고 : 카세트 라벨은 연필 또는 다른 라벨을 지워집니다 처리 중 자일 렌의 사용을 권장 마커로 수행되어야한다. - 조직의 조각을 잘라 및 조직 금형에 넣습니다. 최적 절단 온도 (OCT) 화합물에 조직 절편을 커버하고, 즉시 동결냉동 절편을 위해 -20 ° C에서. 이러한 조직 절편은 저온 절편 위해 준비 될 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 하나 잘라 또는 조직의 많은 조각 및 MACS 완충액을 함유하는 50 ㎖ 튜브 (1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 0.5 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)) 세포 계측법 분석 후속 유동로 전송할 . 유동 세포 계측법에 필요한 경우 세포가 종양 탈퇴, 세포의 고정과 투과성으로시 손실 될 수 있으므로, 큰 샘플은 바람직 할 수있다. 일반적으로,이 섹션은 단부에서 취할 수 있고, 일단 다른 모든 부분이 처리되어있다. 남은 대표적 종양 샘플을 유동 세포 계측법에 사용될 수있다. 선택적으로,이 관은 4 ° CO 저장 / N 또는 세포 현탁액 (단계 4 참조 - 유세포 염색)로 유세포 염색 직후 분해에 사용될 수있다.
- 0.5 mm X 0.5 mm의 최대 크기보다 조각 크지로 조직의 나머지 부분을 잘라 극저온로 전송액체 질소에 즉시 냉동을위한 유리 병. 미래 분석 및 공동 목적을 위해 이러한 스냅 냉동 샘플을 사용할 수있다.
참고 : 직접 접촉은 심각한 부상을 입을 수있는 액체 질소로 작업 할 때 여분의주의를 기울여야합니다. 눈은 측면 방패 또는 얼굴 가리개와 안전 안경을 보호해야합니다. 극저온 장갑도 튀는 직접 접촉에 의한 액체 질소 화상으로부터 보호하기 위해 착용한다. 장갑은 잘 맞지하지만 그들로 빨리해야 액체 질소 시작을 제거 할 수있을만큼 느슨하게해야한다.
4. 유세포 염색
- 조직의 균질화
- DMEM (40 ㎖)의 DNase I (50 U / ml) 및 콜라게나 제 I (2 ㎎ / ㎖)와 소화 매체를 준비한다. 페트리 접시의 뚜껑에 MACS 버퍼에 신선한 또는 O / N 저장된 종양을 배치하고 소화 매체 잠수함.
주 :. 다른 소화 방법은, 각각의 장점이 존재 (즉, 세포 표면 단백질 EXPression의, 생존). 당신이 원하는 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 방법이 있는지 확인하십시오. - 종양이 붙여 넣기 같은 질감을 가질 때까지 외부에서 바늘 접시의 바닥 및 절단에 핀 종양, 메스 중심합니다. 누수를 방지하기 위해 플라스틱 백에 50 ㎖ 튜브, 및 시일 장소 종양 믹스 옮긴다. 인큐베이터에 튜브를 전송하고, 225 RPM, 37 ℃, 1 시간에 회전.
- 70μm 셀 스트레이너를 통해 종양 세포 현탁액을 필터. 250 XG, 4 ° C, 5 분 원심 분리기 세포 현탁액. 1 ML의 외과 버퍼 (500 ml의 PBS 1 ml의 0.5 M 재고 EDTA, 10 ML의 FCS 또는 FBS)에 재현 탁 세포 펠렛.
- 혈구를 사용하여 세포를 계수하고 1 × 107 세포 / ml의 농도로 다시 중단. 전송 염색에 대한 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 웰 당 100 μL (10 6 세포).
- DMEM (40 ㎖)의 DNase I (50 U / ml) 및 콜라게나 제 I (2 ㎎ / ㎖)와 소화 매체를 준비한다. 페트리 접시의 뚜껑에 MACS 버퍼에 신선한 또는 O / N 저장된 종양을 배치하고 소화 매체 잠수함.
- 생존 및 항체 염색법
- 각 생존 얼룩 솔루션의 200 μL를 잘 추가하고 섞는다. Incu어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 대한 BATE. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운.
- FACS 완충액 200 μL의 표면 항원에 대한 (업체 당) 추천 / 적정 농도로 항체 혼합물을 추가합니다. 어둠 속에서, 4 ° C를 30 분에서 세포를 품어. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운.
- , 외과 버퍼의 200 μL로 세척 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. FACS 완충액 200 μL의 세포를 재현 탁하고 수집 및 분석에 대한 흐름 cytometer로 진행합니다.
참고 : 세포 내 유동 세포 계측법 염색을 수행하는 경우, 단계 4.2.2과 4.2.3 사이의 고정과 투과성으로 단계 및 세포 내 염색을 수행합니다. 사이토 카인 염색법을 수행하는 경우, 셀은 권장 미리 활성화 선행되어야 염색, 모 넨신 및 세포 내 단백질 수송 및 분비 억제제로 활성화 중에 표기수용성 요소의 유지를 보장합니다. 고정 된 세포는 유세포에 어두운 이전에 획득을 4 ° C에서 단기 (일주일)에 저장 될 수있다.
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Representative Results
아래에 표시된 결과는 처리 흑색 종 종양에 대한 광범위한 면역 표현형 유동 세포 계측법 게이팅 전략을 도시한다. 염색의 날, 조직 샘플은 225 RPM의 회전하에 37 ℃에서, 소화 I 콜라게나 제 및 60 분간의 DNase I 인큐베이션 균질화 하였다. 소화 후, 세포 현탁액은 파편을 제거하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 통해 여과하고, 세포를 면역 세포 계측법 표현형에 대한 항체의 형광 표지 된 흐름으로 염색 하였다. MACS 버퍼에 4 ° C에서 조직 저장 O / N에서 여러 마커 게이팅 전략과 염색 (그림 3) 아래에 표시됨. 도시 된 바와 같이, 4 ° C에서 MACS 버퍼에 설명 저장 O / N로 처리 표본 극히 제한 사망률을 보여줍니다. 또한,이 도면은 전술 한 바와 같이 그 처리 조직 흑색 종 종양 면역 세포 서브 세트의 다색 광범위한 표현형 허용 보여준다.
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그림 사람의 혈액과 조직 샘플에서 수행 될 수있다 1. 분석. 다음과 같은 처리를 수행 할 수있다 분석의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
적절한 조직 처리 및 저장. 조직 처리를위한 설정의 실시 예 2에 필요한 항목도. 조직 니들 메스 페트리 배양 접시 (A)로 해부 될 수있다. 티슈의 대표적인 부분은 다음 RT에서 삼일 고정 용 NBF 컨테이너 (C)로 전송한다 생검 카세트 (B)로 전송한다. 조직의 다른 부분은 이전의 OCT B 용액 cryomold (D)에 배치되고 커버해야-20 ℃에서 냉동 eing입니다. 조직의 큰 조각을 염색 유세포 위해 50 ㎖ 튜브 (E)에 전송되어야하고, MACS 버퍼 O / N에서 4 ℃에서 저장 될 수있다. 조직의 작은 조각 RNA 안정화 용액 (F)를 1.5 ㎖의 튜브에 옮기고, RNA를 추출 할 때까지 4 ℃에서 보관한다. 마지막으로 남은 조직이 조각으로 잘라 및 액체 질소 및 장기 저장에 스냅인 동결에 대한 cryotubes (G)로 전송한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다양한 면역 표현형 그림 3. 유세포 게이팅 전략. 4 °에서 세포 계측법 흑색 종 종양 저장 O에 흐름 / N에 의해 광범위한 면역 표현형 게이팅 전략의 예;. C는 맥 버퍼 (13)에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
궁극적으로, 처리의 방법은 원하는 가설에 의해 결정 (그림 1)을 수행 할 기술적 분석을 예상해야합니다. 다음 섹션에서는 조직 섹션에서 수행 할 수있는 잠재적 인 분석을 설명하는 개요 역할을한다. 그것은 결코 완전한 개요를 의미하지만, 기술을 설명하고 자신의 강점과 약점을 나열하여 가이드 샘플 처리 방법 및 다운 스트림 분석의 선택에 도움을주기위한 것입니다으로하지 않습니다.
착색 유동 세포 계측법은 갓 해부 조직 절편을 수행 될 수 있고, 또는 그의 단편을 4 ℃에서 MACS 완충액 O / N을 기억. 계측법 고도로 특이 표현형과 조직 샘플에서 추출 된 세포 집단의 분석을 용이하게하고, 하나의 셀에서 최대 17 세포 표면 마커 및 세포 내 단백질, 사이토 카인 및 단백질의 염색을 가능 흐른다. 더욱이, 특정 세포 계측기는 localizat를 결정하기 위해, 단일 세포 배율을 허용세포 내에서 단백질의 이온보다는 전적으로 양성 및 신호 강도. 마지막으로, 질량은 세포 계측법 단점은 세포가 용해하기 때문에 배양하지 않을 수 있습니다, 분류, 또는 전체 (14)으로 분석해야한다는 것을 함께, 동일한 샘플에서 35 개 이상의 단백질의 정량이 가능합니다. 이 기술은 단일 세포 수준에서 많은 마커 단백질의 분석뿐만 아니라 상세한 특성화 할 수있다. 그러나, 유동 세포 계측법 조직 균질화 및 조직 구조의 손실을 필요로하며, 세포의 표현형의 변화를 최소화하기 위해 새로운 조직에 대해 수행되어야한다. 일부 세포 하위 집합이 허혈에 더 취약 할 수 있으므로 중요한 것은, 셀 내용에 영향을 미칠 수있는 유동 세포 계측법위한 조직의 저장을 지연. Phosphoproteins도 제대로 처리 반응 속도가 15 차선있는 세포 계측법 경우 흐름에 의해 검출 될 수있다.
포르말린 - 고정 및 조직 절편의 파라핀 포함 (FFPE)의 경우 최고의 선택이 될 수 있습니다이 수행 될 수있다 분석법 유형에서 높은 융통성을 허용하기 때문에 미래에 관한 불확실성이 분석한다. 전통적으로, FFPE 섹션은 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 형광 (IF) 염색 5 μm의 섹션으로 마이크로톰에 구분됩니다. 그러나 FFPE 조직을 잘 보존되고, 따라서 다양한 목적을 위해 사용될 수있다. 사실, FFPE 블록에서 두꺼운 부분을 절단하고 DNA RNA 추출 시판 키트뿐만 아니라, 역상 단백질 어레이 (RPPA) 분석 16-18 모두 허용한다. 따라서, FFPE로 처리 조직 샘플은 유연성의 이점뿐만 아니라, 면역 염색 용 직물 구조를 유지하고, 따라서 조직 구조와 세포 집단의 묘사 -like 생체 내에서보다 정확한을 제공하는 이점을 제공 할 수있다. 조직 절편은 장기간 보존 할 수 있도록 허용 FFPE. 이 기술은, 그러나, 몇몇 단점을 가지고있다. FFPE에 사용되는 얇은 섹션 할순차 삭감과 조직 절편에서 조직의 이질성을 고려하지함으로써 RNA와 DNA의 품질을 손상 한번 주위 공기에 노출 산화하기 시작한다. 마지막으로 인해 가교로, FFPE 섹션에 IHC 여러 단백질의 공동 염색 최적화가 필요합니다.
IHC 또는 IF 통해 현미경을 원하는 경우의 OCT 화합물의 사용이 바람직하다. 10월 저장된 섹션 IHC 그리고 만약을 위해 슬라이드에 놓고 사용하기 전에 cryotome로 절단해야합니다. 10월는 항원 성을 유지하고 현미경을위한 최적의 기술 제작 배경을 최소화합니다. 10월 또한 NBF에 몇 일을 필요로 FFPE에 비해 즉각적인 동결 및 절단 할 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구하고, 10월는 일반적으로 덜 안정 만 IHC와 IF가 옥트 포함 된 조직 섹션에서 수행 할 수 있기 때문에 FFPE보다 유연하다.
RNA 분석에 관해서, 시료가 더 RNA 전자 있도록, 시간이 지남에 따라 경화 RNA 안정화 용액에서 4 ℃에서 보관다른 사람의 사이에서 시판 추출 키트 및 트리 졸 통해 xtraction. RNA 추출 허가 하류 전사 유전자, RNA 서열 분석의 발현을 정량화하는 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 및 마이크로 어레이에 의해 변조 된 유전자의 광범위한 스펙트럼 분석, 또는 nanoString 분석 등의 분석. 따라서, 조직으로부터 RNA의 분리는 유전자 발현과 치료 및 질환에 의해 영향 경로에 광범위한 정보를 제공하여 매우 높은 수율로 할 수있다. 중요하게, 그러나, RNA 발현이 급격히 조직 구조 및 샘플 크기에 따라 달라질 수 있으므로 특별히주의 편향을 방지하기 위해 샘플링 위치에 의한 분석을 수행한다. 또한, RNA의 성질은 발현 수준에서의 동적 변화 때문에, 여분의 유전자 치료는 또한 관심의 경로 (19, 20)을 연구하기 위해 적절한 따른다 동력학을 확인해야한다 발생할 수 있다는 것을 시사한다; 처리는 RNA 안정화의에서 추출 다음과 같은 제한되어야한다안정성을 보장하기 위해 olution. 따라서, 보완 DNA의 저장 증가 안정성 (cDNA를) RNA를 선호한다 (경우 다운 스트림 분석에 맞춰) 21. RNA는 종종 다운 스트림 분석에서 증폭 할 수 있기 때문에 마지막으로, 오염 된 세포의 분 분획을 얻은 결과에 큰 편견의 원인이 될 수 있습니다.
DNA 분석은 이전에 스냅 냉동 조직 샘플에서 수행, 또는 FFPE 조직 섹션에 할 수있다. 이러한 방법은 이후의 전체 엑솜 또는 전체 게놈 시퀀싱, 여러 질병 상황에서 환자의 반응과 예후에 링크 된 돌연변이와 유전자 다형성의 식별을 통해 엄청난 약속을 보여 두 가지 기술을 할 수 있습니다. DNA 추출은 상기 항원과 치료 및 질병에 대한 면역 반응 (20, 21)에 관한 지식을 획득하기 위하여, T 세포 및 B 세포 수용체 (TCR 및 BCR) 샘플에 존재하는 서열의 확인을 허용 할 수있다. RNA와 비교하여, DNA는하지만 매우 안정적인 회 추출이 계정 전사 유전자의 번역 조절뿐만 아니라 번역 후 변형 및 규제 (22)에 걸립니까.
단백질은 웨스턴 블롯을 수행하기 위해 조직 절편 또는 FFPE 시료에서 스냅 동결로부터 직접 추출 될 수는 단백질의 상호 작용 및 네트워크를 식별하기위한 공동 - 면역 침전뿐만 아니라 RPPA, 수백의 상대적 정량화를 허용 고수익 기법을 분석 단일 샘플 23 단백질. 그러나,이 기술은 특정 항체의 요구를 통해 공지 된 단백질의 식별을 허용한다. 중요한 것은, 상기 번역 후 변형을 분석, 단백질 인산화로, 15 불안정성으로 인한 조직의 신속한 처리를 요구한다.
샘플의 스냅 동결은 간단하고 제한된 자원을 필요로한다. 하류 분석은 아직 정의되지 않은 경우 또한 제외 샘플들의 장기간 저장을 허용신선한 샘플에서 수행해야합니다 유동 세포 계측법 경우. 스냅 냉동 샘플을 쉽게 협업 목적으로 공유 할 수 있습니다.
궁극적으로, 조직의 한 조각으로부터 추출 될 수있는 데이터의 양이 무한하다. 분석은 주어진 연구에서 수행되어야하는 보편적 인 정답은 없습니다. 각 연구자 따라서이 극적으로 연구의 디자인과를 얻을 수있다 대답 영향을 미칠 수 있으므로 그 / 그녀가 환자를 모집하고 조직을 처리하기 전에 계정에 모든 가설, 원하는 실험뿐만 아니라 사용 가능한 자원을 소요해야합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 존 G. 마리 스텔라 케네디 기념 재단 (보조금 # 0727033)과 흑색 종 연구 얼라이언스의 자선 기부금에 의해 지원되었다. 저자는 박사 이그나시오 Wistuba 박사 빅터 Prieto의 MD 앤더슨 암 센터의 부서뿐만 아니라, 조직 분포 및 수집을 조정 및 중개 연구를 용이하게하기 위해 텍사스 MD 앤더슨 암 센터 기관 조직 은행 (ITB)의 대학 감사드립니다 병리학 및 흑색 종 달 총 프로그램. 마지막으로, 저자는 흑색 종에 의해 영향을받는 모든 환자와 가족을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
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