Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Oprensning af musehjerne Fartøjer

Published: November 10, 2015 doi: 10.3791/53208
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 1,2,3
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

Abstract

I hjernen er de fleste af det vaskulære system består af en selektiv barriere, blod-hjerne-barrieren (BBB), der regulerer udvekslingen af ​​molekyler og immunceller mellem hjernen og blodet. Desuden den enorme neuronal metabolisk behov kræver et øjeblik til øjeblik regulering af blodgennemstrømning. Især abnormaliteter af disse regler er ætiologiske kendetegnende for de fleste hjerne patologier; herunder glioblastom, slagtilfælde, ødem, epilepsi, degenerative sygdomme (ex: Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom), hjernetumorer, samt inflammatoriske tilstande, såsom multipel sklerose, meningitis og sepsis-induceret hjernen dysfunktioner. Således at forstå de signaler begivenheder modulerer cerebrovaskulær fysiologi er en stor udfordring. Meget indsigt i de cellulære og molekylære egenskaber af de forskellige celletyper, der udgør cerebrovaskulær systemet kan opnås fra primær kultur eller cellesortering fra frisk dissocierede hjernevæv. Menegenskaber såsom celle polaritet, morfologi og intercellulære relationer vedligeholdes ikke i sådanne præparater. Den protokol, vi beskriver her, er bestemt til at rense hjernen fartøj fragmenter, samtidig med at den strukturelle integritet. Vi viser, at isolerede fartøjer består af endotelceller er forseglet af tight junctions der er omgivet af en kontinuerlig basal lamina. Pericyter, glatte muskelceller samt de perivaskulære astrocyt endfeet membraner forbliver fastgjort til endothellaget. Endelig beskriver vi, hvordan du udfører Immunofarvning eksperimenter på oprensede hjernen fartøjer.

Introduction

Korrekt funktion af centralnervesystemet (CNS) kræver et stærkt reguleret ekstracellulære miljø, og dens metaboliske krav er store i forhold til andre organer 1. CNS er også yderst følsomme over for en bred vifte af kemikalier, normalt uskadelige for perifere organer, men til det, neurotoksisk. For at sikre korrekt funktion, det meste af CNS 'vaskulatur danner en endothelial barriere; blod-hjerne-barrieren (BBB), som styrer strømmen af molekyler og ioner samt passage af immunceller mellem blodet og hjernen, og dermed bevare korrekt homeostase 2, men også en begrænsning optagelse af terapeutiske lægemidler, hvilket hæmmer behandlinger af neurologiske lidelser 3. På celleniveau, er BBB hovedsageligt oppe af omfattende tætte forbindelser mellem endotelceller, polariseret udtryk for efflux transportvirksomheder og en meget lav transcytose på 4. Egenskaber og funktioner i BBB er for det meste fremkaldt af neighboring celler 4. Især pericytter spiller en vigtig rolle i induktion og vedligeholdelse af BBB 5,6. Bliver kontraktile celler, pericytter også regulere blodgennemstrømning 7 som gør de glatte muskelceller omgivende store skibe. Endelig astrocytter, de store gliaceller i hjernen, sende store processer navngivne endfeet omkring de fleste af hjernen vaskulaturen 8 og modulere BBB integritet og immune hviletilstand 9, overførsel af metabolitter neuroner 10 og inducere tætte kobling mellem neuronal aktivitet og blodgennemstrømning 11,12.

Evnen til at studere de molekylære og cellulære egenskaber af cerebrovaskulære system er afgørende for at karakterisere bedre dens bidrag til hjernen fysiologi og fysiopatologi. For at løse dette spørgsmål, er der udviklet strategier til at isolere hjernens cerebrovaskulær system, som gør det muligt for udarbejdelsen af ​​intakte hjerne fartøj fragmenter. Cerebral fartøj purification blev oprindeligt beskrevet ved hjælp af bovine hjerner 13 og forbedret og tilpasset til andre arter, især gnavere 14. I denne sidste undersøgelse blev brugen af ​​filtre af varierende størrelse indført for at adskille hjernen fartøjer på fraktioner beriget med fartøjer med forskellige diametre. Interessant nok i sådanne præparater, endotelceller holdt deres metaboliske egenskaber 15, transportør funktionalitet 16 og polarisering 17. Her beskriver vi i detaljer denne protokol, og yderligere at demonstrere, at isolerede beholdes meste af deres in situ strukturer. Endotelceller forblive forbundet med tight junctions og omgivet af en kontinuerlig basal lamina. Pericyter og glatte muskelceller forbliver fastgjort til endothellaget, samt perivaskulære astrocyt membraner. Imidlertid er astrocytter, mikrogliaceller, neuroner og oligodendrocytter elimineret. Endelig beskriver vi en fremgangsmåde til at udføre immunfarvning på isolerede hjerne fartøjer. Indtil nu er de fleste af de molekylære og cellulære undersøgelser vedrørende cerebrovaskulær systemet er blevet udført på oprensede hjerne fartøj celler dissocieret ved celle-sortering hjælp celle specifikke reporter musestammer eller Immunofarvning-baserede procedurer 18,19. Selv om disse teknikker giver mulighed for isolering af næsten rene cerebrovaskulære cellepopulationer, isolerede celler mister deres helt in situ morfologi og interaktioner, der på sin side, i høj grad påvirker deres molekylære og cellulære egenskaber. Protokollen beskrevet her, giver mulighed for isolering af hele cerebrovaskulære fragmenter uden behov for specifikke antistoffer eller transgene mus pletter, giver et godt alternativ som den overordnede struktur af isolerede cerebrale kar er bevaret, således mindske konsekvenser for deres molekylære egenskaber. Isolerede fartøjer kan derefter anvendes til at studere genaktivitet, proteinsyntese og regulering på BBB som beskrevet for nylig 20,21 22,23 den nuværende protokol er billigt, let at udføre og hurtigt kan tilpasses på alle laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Løsninger og materialer

  1. Forbered isolation fartøj løsninger: B1, tilsættes 1,5 ml HEPES 1 M til 150 ml HBSS; B2, tilsættes 3,6 g dextran til 20 ml B1; B3, tilsættes 1 g BSA til 100 ml B1.
  2. Ændre filterholderen ved at skære bunden ud for den øverste skruning del.
  3. Forbered Immunofarvning løsninger: Fiksering løsning, 4% paraformaldehyd i PBS pH 7,4; Permeabilisering / blokerende opløsning, fortyndes gedeserum til 5% og Triton X100 til 0,25% i PBS pH 7,4.
    Bemærk: Fiksering afhænger af primære antistoffer anvendes.

2. Dissektion

Bemærk: Sterile betingelser er ikke påkrævet, medmindre fartøjer anvendes til cellekultur formål.

  1. Forbered en 150 ml bægerglas med 20 ml B1. Hold på is og dække med parafilm at undgå luftforurening.
  2. Dybt bedøver musen under en hætte med en lille køkkenrulle dyppet i 1 ml ren Isofluran, der er tilføjet into buret. Anæstesi er bekræftet af en mangel på reaktion på en tå knivspids. Dræbe musen ved cervikal dislokation.
    BEMÆRK: Disse trin er udført i overensstemmelse med nationale og institutionelle regler.
  3. Valgfrit: Udfør intrakardial perfusion med 20 ml PBS 1x at fjerne blodet 24.
  4. Afsnit huden med en skalpel fra halsen til næsen og trække den væk. Fjern alle kontaminerende hår med PBS 1x.
  5. For at åbne kraniet, først indsætte saks fortil til olfaktoriske pære, og åbne saks til at sprænges kraniet i to dele.
  6. Fjern forsigtigt hjernen ved hjælp af en hjerne spatel. Dissekere ud plexus chorioideus fra laterale ventrikler, som de ville forurene fartøjet blodpræparatet 38.
    BEMÆRK: Valgfrit: Den endelige forberedelse vil indeholde parenkymale og meninges fartøjer. Hvis ikke er ønsket, kan meninges skrælles følge fremgangsmåden beskrevet af 38.
  7. Transfer hjernen ind i bægerglas indeholdende B1 løsning på is. Op til 8 hjerner kan behandles sammen.

3. Brain Tissue Homogenisering

  1. Brug to skalpeller, manuelt, og energisk slog hjernen i B1 løsningen efterfølgende opnå små stykker af ca. 2 mm.
  2. Homogeniser præparat med en automatiseret Dounce homogenisator, udfører 20 slag ved 400 omdrejninger i minuttet. Sikre, at glasrøret holdes i is, og at den øvre del af douncer er i opløsning, når bevæger sig op og ned, for således at forhindre dannelsen af ​​luftlommer. Hvis flere prøver er forberedt, vaske douncer med ioniseret vand mellem hver homogenisering.

4. Fartøjets Oprensning

  1. Overfør homogenatet i en 50 ml plastrør og gå videre til centrifugering ved 2.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. En stor hvid grænseflade (hovedsagelig myelin) vil dannes på toppen af ​​beholderen pellet (rød, hvis der ikke perfusion blev udført).
  2. Kassér supernatanten. Fartøjet pellet og den hvide brugerflade bliver siddende sammen. Der tilsættes 20 ml iskold B2 løsning og ryst glasset manuelt og kraftigt i 1 min.
  3. Videre til anden centrifugering ved 4.400 g i 15 minutter ved 4 ° C. Myelin vil nu danne en tæt hvidt lag på overfladen af ​​supernatanten.
  4. Fjern forsigtigt myelin lag fra rørvæggene ved at holde røret og langsomt roterende den for at tillade supernatanten at passere langs væggene. Kassér myelin med supernatanten. Pelleten indeholdende beholderne forbliver fastgjort ved bunden af ​​røret.
  5. Dup den indvendige væg af røret med et absorberende papir viklet omkring en 5 ml plastik pipette og fjerne alle resterende væsker, undgå at berøre skibet pillen. Hold røret på hovedet på et absorberende papir for at dræne eventuel resterende væske.
  6. Suspender pellet i 1 ml iskold B3 opløsning ved pipettering op og ned med lav bindende tips, keeping røret på is, tilsæt derefter yderligere 5 ml B3 løsning. Sørg for, at skibe er spredt så meget som muligt, og ikke danner aggregater.

5. Filtrering

  1. Forbered et bægerglas på is med 30 ml iskold B3 løsning. Dæk med parafilm at undgå luftforurening.
  2. Placer en 20 um mesh-filter på en modificeret filterholder på toppen af ​​en becker kolbe og tempereres ved at anvende 10 ml iskold B3 løsning.
  3. Hæld forberedelse fartøj på filteret og skyl skibene med 40 ml iskold B3 løsning.
  4. Gendan filteret ved hjælp af rene pincet og straks fordybe det i bægeret, der indeholder B3 løsning. Frigør skibene fra filteret ved at ryste det forsigtigt.
  5. Hæld bægerglasset indhold i et 50 ml plastrør og centrifugeres ved 2.000 g i 5 minutter ved 4 ° C.
  6. Bemærk: Alternativt kan hjernen skibenes suspension fra trin 4.6 filtreres på en 100 um-mesh-filter.I dette tilfælde er større fartøjer fortrinsvis tilbageholdes på filteret, mens gennemløbet indeholder mikrokar (især kapillærer), som derefter filtreret på en 20 um mesh-filter som ovenfor.
  7. Resuspender pellet af mikrokar i 1 ml iskold opløsning B3 og overføre den ved pipettering det i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Der centrifugeres ved 2.000 g i 5 minutter ved 4 ° C.

6. Fiksering, Permeabilisering og Blokering

  1. Overfør fartøjer afpipetteres 0,2 ml PCR-rør indeholdende PBS ved hjælp af en 1,0 ml lav bindende spids. Pas på ikke at røre de fartøjer, som de kan holde sig til ydersiden af ​​spidsen. Udfør alle følgende trin under en kikkert mikroskop.
  2. For hvert af de følgende medium forandringer, lad rørene på is indtil skibene har nået bunden, og pipette ud de fleste af de væsker ved hjælp af lange og ting gel-loading pipettespidser.
  3. Fjerne det meste af PBS, og der tilsættes 200 pi fikseringsopløsning.Suspendere skibe forsigtig omrystning og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
  4. Pipetteres ud fikseringsopløsningen og erstatte det med 200 pi 1x PBS (første vask), inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur og gentage dette trin 3 gange. Hver gang, skal du kontrollere, at fartøjer korrekt er sunket til bunds i rørene og pipette ud 1x PBS, sikrer skibene ikke rørt.
  5. Efter den sidste vask, erstatte 1x PBS efter permeabilisering / blokeringsopløsning og inkuber 1 time ved stuetemperatur, resuspendering af skibe med forsigtig omrystning fra tid til anden.

7. Immunfarvning

  1. Udskift permeabilisering / blokerende opløsning med den blanding af primære antistoffer (se referencer på antistofferne her og fortyndinger anvendes i Materialer skabelonen tabel) fortyndet i permeabilisering / blokerende opløsning og inkuberes ved 4 ° CO / N.
  2. Efter 3 vaske i PBS ved RT, inkuberes skibene med den blanding af sekundære antistoffer fortyndet i PBS i 2 timerved stuetemperatur.
  3. Bemærk: Vi anbefaler på det kraftigste at udføre nukleare farvning med Hoechst (1: 2.000) eller DAPI (1: 2.000) for at skelne skibe fra mulige forurenende hår eller støv under mikroskop.
  4. Efter 3 vaske i PBS, resuspenderes fartøjerne i 50 pi PBS.

8. Montering og Observation

  1. Forbered en spids med en silikoniseret glas kapillar: skære en P200 pipettespids ved hjælp af en skalpel og juster kapillarrøret indeni. Den omtrentlige mængde af kapillarrøret er 40 pi.
  2. Overfør fartøjerne et objektglas ved hjælp af silikoniseret glaskapillar og fjern forsigtigt væsken med et stykke absorberende papir.
  3. Påfør en enkelt dråbe montering medium på skibene, og hold et dækglas på 45º gør det muligt for slip for at spredes langs kanten af ​​slip. Lad gå ud dækglasset og lad medium til at sprede langsomt. Lad det tørre O / N ved RT med beskyttelse mod lys. Fartøjer kan iagttages under et fluorescerent konfokalt mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi en protokol der giver mulighed for den mekaniske isolation af hjernen fartøjer 14. Figur 1 opsummerer de vigtigste trin i denne teknik. Arkitekturen i hjernen er kompliceret og omfatter flere celletyper, dvs. endotelceller er forseglet af tight junctions og omgivet af pericyter, glatte muskelceller, og astrocyt fodprocesser 9. Således Efter isolering af hjernen fartøjer, vi havde til formål at karakterisere strukturen af ​​oprensede fartøjer ved immunofarvning som beskrevet i anden del af vores protokol. Agrin, en bestanddel af endotel basale lamina blev kontinuerligt og homogent mærket ved endoteloverfladen (figur 2A). Zona occludens-1 (ZO-1), en af komponenterne i endoteliale tætte forbindelser blev immunfarvet med ingen tilsyneladende diskontinuitet, hvilket antyder, at endotheliale tætte forbindelser blev bevaret (figur 2B). Den pericyt endotel dækning, etiketed af NG2, optrådte næsten uafbrudt som tidligere beskrevet 25 (figur 2C). Endelig glatmuskelactin mærkning afslørede tilstedeværelsen af en tæt glat muskel cellelag ved overfladerne af store oprensede skibe (Figur 2D). Disse resultater viste, at den samlede in situ hjernen fartøj struktur blev bevaret i de isolerede fragmenter af skibe.

Astrocytter har vist sig at sende store processer eller 'endfeet' til overfladen af beholderne, beklædningen næsten udelukkende cerebrovaskulær systemet 8. Deres stramme interaktion med skibe og deres rolle i at opretholde og regulere forskellige cerebrovaskulære funktioner, der er udpeget dem som en afgørende del af neurovaskulær enhed 9. Vi analyserede yderligere astrocyt vaskulære dækning af isolerede hjernen fartøjer. Immunomærkning af astrocytisk mellemliggende filament GFAP, foreliggende normalt i hele astrocyt (figur 3A), war kun delvist til stede på oprensede fartøjer viser nogle korte fibre ved endoteloverfladen (figur 3B-C). I modsætning hertil var Connexin 43, et gap junction protein højt beriget i perivaskulære astrogliale membraner 26, stærkt opdaget ved overfladen af rensede store skibe (Figur 3D) og kapillærer (figur 3e). Tilsvarende immunomærkning af Aquaporin-4 (Aqp4), et medlem af vandet kanal familien i høj grad til udtryk på niveau med astrocyt membraner står beholderne 27, 26, der skitserer væggene i isolerede fartøjer (Figur 3F-G). Selv astrocytter ikke blev co-oprenset med skibe, forblev deres perivaskulære endfeet membraner fastgjort under proceduren for mekanisk hjernen fartøj isolation.

Endelig har vi undersøgt den mulige forurening af vores forberedelser af andre neurale celletyper. Immunomærkning af neuronale intermediære filamenter (NFM) (Hornung et al, 1999) afslørede tilstedeværelsen af få tilbageværende fibre knyttet til skibene, hvilket indikerer en mulig co-oprensning af et par neuronale terminaler (Figur 4A-B). Mikroglia, mærket med Iba1 (figur 4C-D) og oligodendrocytter, mærket med Olig2 (Figur 4E-F) blev ikke påvist i isolerede beholdere. Således neuroner, mikroglia og oligodendrocytter ikke var co-oprenset med hjernen fartøjer.

Tilsammen indikerer disse resultater, at den beskrevne protokol tillader oprensning af strukturelt konserverede hjernen fartøj fragmenter, hvorpå perivaskulære astrocytiske membraner forbliver fastgjort.

Figur 1
Figur 1. Resumé Scheme af Brain Vessel Rensning protokol. Er de vigtigste skridt præsenteres. Denne skitse viser de tre mulige fraktioner fartøj, der kan opnås, afhængigt af fi ltre anvendt (20 eller 100 um-mesh). S1: mikrokar og store skibe, S2: store fartøjer og S3:. Mikrokar Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Isolerede beholdes de fleste af deres In Situ Struktur. Konfokale billede fremskrivninger af immunofarvede isoleret musehjerne fartøjer. (A) Basal lamina immunolabelled for Agrin (rød). (B) endotelceller tætte forbindelser immunolabelled for zonula occludens (ZO-1 ) (rød). (C) pericytter immunolabelled for NG2 (rød). (D) Glatmuskelceller immunolabelled for glatmuskelactin (SMA) (rød). Kerner farves med Hoechst (blå).pg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. astrocyt Endfeet Membraner forblive på Rensede Fartøjer. Konfokale billede fremskrivninger. (A) Billede af en hjerne sektion viser en kortikal fartøj immunofarvet til endotel PECAM (hvid), astrocytisk GFAP (rød) og Connexin 43 (Cx43) (grøn ). (B, C) ​​GFAP immunomærkning (grøn) ved overfladen af en isoleret kapillær mærket ved Isolectin b4 (hvid) (B) eller et stort fartøj mærket til glatmuskelactin (SMA) (rød) (C). (C) er en Re-print med tilladelse fra den 20. (D, E) Cx43 immunomærkning (grøn) på overfladen af en isoleret kapillær mærket af Isolectin b4 (hvid) (D) eller et stort fartøj mærket til glatmuskelactin (SMA) (rød) (F, G) Aquaporin 4 (Aqp4) immunomærkning (grøn) ved overfladen af en isoleret kapillær mærket ved Isolectin b4 (hvid) (F) eller af et stort skib mærket til glatmuskelactin (SMA) (rød) (G). Kerner farves med Hoechst (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:.. Neuroner, Mikroglia og oligodendrocytter er ikke co-renset med Brain Fartøjer Konfokale billede fremskrivninger (A, B) neurofilament (NFM) immunfarvning på en 20 um tyk hippocampalt skive (rød) (A) og renset hjernen fartøjer ( B). (C, B) mikrogliaceller Iba1 immunfarvning på en 20 um tyk kortikale skive (red) (C) og renset hjernen fartøjer (D). (E, F) oligodendrocyt Olig2 immunfarvning på en 20 um tyk kortikale skive (rød) (E) og renset hjernen fartøjer (F). kerner farves med Hoechst (hvid ), endotel ved Isolectine b4 (IB4) (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Blod-hjerne-barrieren regulerer passagen af ​​fysiologiske stoffer ind og ud af CNS og beskytter den mod potentielt skadelige stoffer er til stede i blodet. Det er involveret i adskillige CNS patologier, herunder neurodegenerative sygdomme 2 og hjernetumorer 28. Den ekstremt lave permeabilitet i BBB hæmmer også passagen af terapeutiske midler rettet mod neurale celler og udvikling af metoder til hensigt at reversibelt åbne BBB uden skadelige konsekvenser for hjernen er en meget aktiv inden for forskning 3. Der er gjort mange bestræbelser på at udvikle værdifulde modeller og teknikker tillader cellulære, molekylære og farmakologiske undersøgelser af BBB og især, protokoller til isolering fartøjer fra gnavere hjernen. Første forsøg simpelthen indsamlet mikrokar fra mekanisk dissocierede hjernevæv ved hjælp variable pore størrelse masker at kassere kontaminerende hjerne parenkymceller 13, 29, 30, 31. Densitetsgradientcentrifugering blev senere indført i tilknytning til filtrering af hjernen skibe på nylon masker eller glasperler søjler 32, 33, 15. I disse procedurer, glasperle versus nylonnet filtrering syntes at forbedre udbyttet og høj-versus centrifugering ved lav hastighed, mikrokar renhed, selvom højhastighedscentrifugering også inducerer forskydningsspænding, som påvirker genekspression 15, 32. Et yderligere trin med enzymatisk fordøjelse blev også indført i nogle protokoller efter dissociation trin 34 med henblik på at løsgøre adhærente neuroner og astrocytter at øge mikrokar renhed 35. Imidlertid kunne en overdreven pre-fordøjelse også forstyrre mikrokapillære integritet 36, 37. Mere for nylig, har vist sig immuno-laser capture microdissection (immuno-LCM) for at muliggøre hentning af skibe eller endog af distinkte cellepopulationer i vessels at undersøge ændringer i BBB-genekspression, selv om mængden af materiale opnået ved denne teknik er meget begrænset 23.

Her præsenterer vi en procedure for en mekanisk isolation af hjernen fartøjer oprindeligt udarbejdet af Yousif et al 14. Det giver mulighed for at opnå rene hjernen fartøjer, og at adskille dem i henhold til deres diameter. Denne protokol foregiver ikke at tillade rensning af hele hjernen vaskulære rum, og vi ikke sammenligne dens effektivitet med de tidligere offentliggjorte protokoller. Men fraværet af gradient, specifikke søjler og højhastighedstog centrifugeringstrin gør den samlede procedure meget let og billig. Vigtigt er det, anbefaler vi kraftigt at fjerne chorioideus plexus som beskrevet af 38 før homogenisering af hjernen, som vi oplevede det som en mulig kilde til forurening. Andre vigtige anbefalinger er: 1) brug af "lav binding" plastic materIAL (især pipettespidser), da fartøjer overholder naturligvis til ubehandlede plast. Udelade dette punkt ville resultere i tab af de fleste fartøjer; 2) den omhyggelige ligevægt af nylonfiltre før filtrering (trin 5.2); 3) resuspension af pelleten i så meget puffer som muligt inden filtrering for at forbedre renheden af ​​prøven; 3) Hvis det er nødvendigt, kan blodceller og proteiner fanget i oprensede skibe vaskes ud af intrakardial perfusion med PBS før hjernen dissektion; 4) Udbyttet af fartøjer oprenset kunne forbedres ved at gentage adskillelse fra myelin i dextran to eller tre gange (trin 4.2) 39,40. For immunfarvning, anbefaler vi: 1) til at udføre en nuklear mærkning for at skelne fartøjer i at forurene hår og støv for hvilke antistoffer har stor ikke-specifik affinitet; 2) for at undgå opsamling af fartøjer ved centrifugering før hver udskiftning af mediet, da det kan resultere i dannelsen af ​​en uløselig kugle af materiale.

Rensning af intakte hjerne fartøjer præsentere store fordele at studere de molekylære karakteristika af BBB. Skønt specifikke eller beriget endotel og pericyt gener og veje er blevet identificeret af transkriptom og proteomiske undersøgelser af de enkelte celletyper 18,19, er det velkendt, at dissociation og celle sortering teknikker fører til tab af cellepolaritet og morfologi samt sammenkobling mellem celletyper, som i høj grad påvirker deres molekylære profiler. I denne sammenhæng holde hele vaskulære intakt som beskrevet her, med undtagelse af astrocytter, kunne udgøre en stor fordel. Desuden forhold til cellesortering, oprensning af hjernen fartøjer ikke kræver anvendelse af specifikke transgene reporter musestammer eller langvarige Immunofarvning-baserede procedurer. En anden fordel for brugen af ​​hjernen fartøjer er muligheden for at tilpasse rensning protokol til andre arter, som allerede er vist for murine14, Bovine13 samt hos mennesker 41,42. Endelig vil en videreudvikling af den foreliggende teknik være in vitro kultur af hjernen fartøjer fragmenter. Co-kultur af oprensede fartøjer med primære astrocytter neuroner og mikrogliaceller kan bidrage til at samle neurovaskulær enhed i en præcis måde end komplekse 3-dimensionelle flercellede kultur systemer, hvor cellerne er først isoleres og oprenses, før de samles igen 43. rensning af intakte hjerne fartøjer kan være en stor hjælp for udviklingen af enhver form for in vitro assays for at studere BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af LABEX MemoLife og af ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la Sclerose da plaques)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Tags

Neuroscience Cerebrovaskulær systemet blod-hjerne-barrieren Vessel rensning endotelceller astrocyt endfeet pericytter Glatmuskelceller
Oprensning af musehjerne Fartøjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boulay, A. C., Saubaméa, B.,… More

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter