Abstract
뇌, 혈관 시스템의 대부분은 선택적 장벽 이루어져, 뇌 및 혈액 사이의 분자 및 면역 세포의 교환을 조절 혈액 - 뇌 장벽 (BBB). 더욱이, 거대한 신경 대사 요구 혈류 매 순간 규제를 필요로한다. 특히,이 규정의 이상은 대부분 뇌 병변의 병인 특징이다; 뇌 종양,뿐만 아니라 다발성 경화증, 수막염 및 패혈증 - 유도 된 뇌 기능 장애와 같은 염증성 질환 : 아교 모세포종, 뇌졸중, 부종, 간질, 퇴행성 질환 (파킨슨 병, 알츠하이머 병 EX)를 포함. 따라서, 뇌 혈관 생리학 변조 시그널링 이벤트 이해 주요 과제이다. 뇌 혈관 시스템을 구성하는 다양한 세포 유형의 세포 및 분자 특성에 많은 통찰력 갓 해리 뇌 조직에서 정렬 차 또는 배양 세포로부터 얻어 질 수있다. 그러나,휴대 극성, 형태 및 세포 간 관계와 같은 속성은 준비에서 유지되지 않습니다. 우리는 여기에서 설명하는 프로토콜은 구조적 일체 성을 유지하면서, 뇌 혈관 단편을 정제하기 위해 설계된다. 우리는 고립 된 선박이 연속 기저 얇은 판에 둘러싸여 꽉 접합에 의해 밀봉 내피 세포로 구성되어 있음을 보여준다. 주위 세포는 평활근 세포뿐만 아니라 혈관 주위 성상 endfeet 막은 내피 층에 부착 된 상태로 유지. 마지막으로, 우리는 정제 뇌 혈관에 면역 염색 실험을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)의 적절한 기능이 고도로 조절 세포 외 환경을 요구하고, 그 요구는 다른 대사 기관 (1)에 비해 높아지고있다. CNS는 일반적으로 말초 기관에 무해하지만,에, 신경 독성 화학 물질의 넓은 범위에 매우 민감하다. 정확한 기능을 보장하기 위해, CNS '혈관의 대부분의 내피 장벽을 형성하고; 분자 및 이온의 흐름뿐만 아니라 혈액 및 뇌 사이의 면역 세포의 통과를 제어하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)은, 이렇게 저해 치료함으로써 적절한 항상성 (2)를 유지하지만, 또한 치료제의 침입을 제한 의 신경 학적 장애 3. 세포 수준에서, BBB는 주로 혈관 내피 세포, 유출 수송의 편광 표현과 매우 낮은 트랜스 사이토 속도 4 사이의 광범위한 꽉 접합에 의해 유지된다. 속성 및 BBB의 기능은 대부분 NE에 의해 유도되는ighboring 세포 4. 특히, 혈관 주위 세포는 BBB 5,6- 유도 및 유지에 중요한 역할을한다. 대형 선박을 둘러싼 평활근을 수축으로 세포이기 때문에, 혈관 주위 세포는 혈액의 흐름을 조절 7. 마지막으로, 성상 세포, 뇌의 주요 아교 세포, endfeet 주변라는 이름의 큰 프로세스를 보내 뇌 혈관 (8)의 대부분 BBB 무결성 및 면역 정지 (9), 신경 (10)에 대사 산물의 이동을 조절하고 신경 세포의 활동 사이의 밀접한 결합을 유도하고 혈류 11,12.
뇌 혈관 시스템의 분자 및 세포 특성을 연구 할 수있는 능력은 뇌 생리학과 physiopathology에 기여를 더 나은 특성을하는 것이 중요하다. 이 문제를 해결하기 위해, 뇌 혈관 뇌의 시스템을 분리 전략은 그대로 뇌 혈관 단편의 제조를 허용하는 개발되었다. 뇌 혈관 Purification 처음 특히 설치류 (14)에, 다른 종에 소 뇌 (13)를 사용하여 설명하고 개선 적응했다. 마지막 연구에서, 가변 크기의 필터의 사용은 다른 직경의 혈관이 풍부한 분획으로 뇌 혈관을 구분하기 위해 도입되었다. 흥미롭게도, 이러한 준비에, 내피 세포는 신진 대사 특성 (15), 수송 기능 (16)과 편광 (17)를 유지했다. 여기서는 자세하게 설명 프로토콜을 추가로 절연 혈관 시츄 그들의 구조의 대부분을 보유 함을 입증. 내피 세포가 단단히 접합으로 연결하고 연속 기저판에 의해 둘러싸여 유지. 주연 세포와 평활근 세포는 내피 층뿐만 아니라 혈관 주위 성상 세포 막에 부착 된 상태로 유지. 그러나, 성상 세포, 미세 아교 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 제거된다. 마지막으로, 우리는 고립 된 뇌 혈관에 면역 염색 수행하는 절차를 설명합니다. 지금까지 뇌 혈관 시스템에 관한 분자 세포 연구의 대부분은 해리에 의해 정제하여 뇌 혈관 세포에서 수행 된 세포 - 세포 분류 특정 리포터 마우스 균주 또는 면역 - 기반 방법을 사용하여 18, 19. 이러한 기술은 거의 순수한 뇌 세포 인구의 격리를 위해 수 있지만, 분리 된 세포는 완전히 다시 크게 분자 및 세포 특성에 영향을 미치는 그들의 현장에서 형태와 상호 작용을 잃게됩니다. 이 프로토콜은 특정 항체 또는 유전자 변형 마우스 얼룩의 필요없이 전체 뇌 조각의 분리를 허용, 여기에 설명 된 분자 특성에 영향을 줄이는 따라서, 보존되어 고립 된 뇌 혈관의 전체 구조와 같은 좋은 대안을 제공합니다. 최근에 기술 된 바와 같이 (20, 21)를 절연 용기는 BBB에서 유전자 활성, 단백질 합성 및 조절을 연구에 사용될 수있는 22, 23에 비해 본 프로토콜은 저렴 수행하기 쉽고 모든 실험실에 빠르게 적응할 수있다.
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Protocol
1. 솔루션 및 재료
- 분리 용기 용액을 제조 : B1, 150 ㎖의 HBSS에 1M HEPES 1.5를 가하여; B2는 20 B1의 ml의 덱스 트란의 3.6 g을 추가; B3는, B1의 100 ml의 BSA의 1g을 추가합니다.
- 상단 나사 조임 부분 떨어져 바닥을 절단하여 필터 홀더를 수정합니다.
- 면역 용액 제조 : 고정액, PBS pH 7.4의 4 % 파라 포름 알데히드를; 투과성으로는 / 차단 솔루션, 5 % 염소 혈청을 희석 PBS pH 7.4의 0.25 %에 트리톤 X100.
참고 : 고정 사용 일차 항체의 종류에 따라 다릅니다.
2. 해부
주 : 혈관 세포 배양 용으로 사용하지 않는 멸균 조건이 요구되지 않는다.
- B1 20 ㎖와 150 mL의 비커를 준비합니다. 얼음에 보관하고 공기 오염을 방지하기 위해 파라 필름 커버.
- 깊이 INT를 추가 순수한 아이소 플루 란의 1 ㎖에 적신 작은 종이 타월로 후드 아래에 마우스를 마취케이지를 오. 마취는 발가락 핀치에 반응의 부족에 의해 확인됩니다. 자궁 전위에 의해 마우스를 죽여.
참고 :이 단계는 국가 및 기관의 규정에 따라 수행됩니다. - 옵션 : 혈액 콘텐츠 (24)을 제거하기 위해 PBS 1X의 20 ml의 심장 내 관류를 수행합니다.
- 제 코에 목 메스 피부 멀리 당깁니다. PBS 1X 모든 오염 머리카락을 제거합니다.
- 두개골을 열려면, 먼저 후각 망울에 전방 가위를 삽입하고 두 부분으로 두개골 파열 가위를 엽니 다.
- 조심스럽게 뇌 주걱을 사용하여 뇌를 제거합니다. 이들이 혈관 제조 예 38을 오염 하듯 측뇌실에서 맥락총를 해부.
참고 : 선택 사항 : 최종 준비 실질과 뇌막 혈관을 포함 할 것이다. 소망하지 않는 경우, 수막 (38)에 의해 기술 된 절차에 따라, 박리 될 수있다. - TR얼음 B1 용액 함유 비이커에 뇌 ansfer. 최대 8 뇌를 함께 처리 할 수있다.
3. 뇌 조직의 균질화
- 두 메스를 사용하여 수동으로하고 적극적이어서 약 2mm의 작은 조각을 획득 B1 용액에 뇌를 이길.
- 400 rpm에서 20 스트로크를 수행이 자동화 다운스 균질 제제 균질화. 유리관 얼음과 공기 주머니의 형성을 방지하도록, 상하로 이동시 douncer의 상부 용액되어 유지되는 것을 보장한다. 여러 샘플을 준비하는 경우, 각각의 균질화 사이의 이온화 된 물 douncer을 씻는다.
4. 선박 정화
- 4 ℃에서 10 분간 2,000 g에서 원심 분리하고 50 ml의 플라스틱 튜브로 옮기고 균질 진행. 더 관류가 수행되지 않은 경우 큰 흰색 인터페이스 (주로 미엘린)는 용기 펠릿 (적색의 상부에 형성 할 것이다).
- 상층 액을 버린다. 선박 펠릿과 흰색 인터페이스가 함께 부착 상태로 유지됩니다. 얼음처럼 차가운 B2 용액 20 ㎖를 추가하고 1 분 동안 수동으로하고 적극적으로 튜브를 흔들.
- 4 ℃에서 15 분간 4,400g에서 두 번째 원심 분리를 진행합니다. 미엘린 해주기 상등액의 표면에 조밀 한 백색 층을 형성 할 것이다.
- 조심스럽게 튜브를 들고 천천히가 뜨는는 벽을 따라 통과 할 수 있도록 회전에 의해 튜브 벽의 수초 층을 분리합니다. 뜨는와 수초를 폐기하십시오. 혈관을 함유하는 펠릿을 상기 튜브의 하단에 부착 된 상태로 유지.
- 5 ml의 플라스틱 피펫을 감싸 흡수 종이 튜브의 내부 벽을 가릴 모든 잔여 액을 제거, 혈관 펠렛을 만지지 마십시오. 남아있는 액체를 배출 흡수 종이에 튜브 거꾸로하십시오.
- 낮은 바인딩 팁, keepi 최대 피펫 팅에 의해 아래로 얼음처럼 차가운 B3 용액 1 ㎖에 펠렛을 일시 중단얼음에 튜브를 겨, 다음 (B3) 솔루션의 또 다른 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 선박은 가능한 한 분산 및 집계를 형성하지 않도록해야합니다.
5. 여과
- 얼음처럼 차가운 B3 용액 30 ml의 얼음에 비커를 준비합니다. 공기 오염을 방지 할 파라 필름으로 커버.
- 베커 플라스크의 상단에 변성 필터 홀더에 20 ㎛의 메쉬 필터를 배치하고 빙냉 B3 용액 10 ㎖를 가하여 평형화.
- 필터상의 용기 준비 붓고 빙냉 B3 용액 40 ㎖로 혈관을 헹군다.
- 깨끗한 집게를 사용하여 필터를 복구하고 즉시 B3 용액 함유 비이커에 젖어. 가볍게 흔들어 필터에서 혈관을 분리합니다.
- 4 ℃에서 5 분간 2,000 g에서 50 ㎖ 플라스틱 원심 분리 튜브에 비이커 콘텐츠를 붓는다.
- 주 : 또는, 단계 4.6에서 뇌 혈관 '현탁액 100 ㎛ 메쉬의 필터로 여과 할 수있다.관류 후 상기와 같이 20 ㎛의 메쉬 필터로 여과되고 미세 혈관 (주로 모세관)를 포함하는 동안,이 경우에는, 큰 혈관 우선적 필터상에서 유지된다.
- 빙냉 B3 용액 1 ㎖에 미세 혈관의 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브로 피펫 팅하여 옮긴다. 4 ℃에서 5 분간 2,000g에서 원심 분리기.
6. 고정, 투과성으로하고 차단
- 1.0 ml의 낮은 바인딩 팁을 사용하여 PBS를 포함하는 0.2 ml의 PCR 튜브에 피펫으로 전송 선박. 그들이 팁의 바깥 부분에 부착 될 수 있으므로 혈관을 건드리지 않도록주의하십시오. 쌍안 현미경으로 다음의 모든 단계를 수행합니다.
- 다음 매체 변화의 각각에 대해, 선박 바닥에 도달 할 때까지 얼음에 튜브를두고 긴 것은 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 액체의 대부분을 피펫.
- PBS의 대부분을 제거하고 정착액 솔루션 200 μl를 추가합니다.부드럽게 흔들어 혈관을 일시 중단하고 실온에서 20 분 동안 품어.
- 정착액 솔루션을 피펫 및 1X PBS (제 1 세척) 200 μL로 교체, 실온에서 5 분간 배양하고이 단계를 3 회 반복한다. 때마다, 혈관이 제대로 혈관을 터치하지 않는 보장, 1X PBS 밖으로 튜브와 피펫의 바닥에 침몰했는지 확인합니다.
- 마지막 세척 후, 수시로 부드럽게 흔들어 혈관을 재현 탁, 투과성으로 / 차단 솔루션에 의해 1X PBS를 교체하고 실온에서 1 시간을 품어.
7. 면역 염색
- 투과성으로 / 차단 솔루션에 희석 일차 항체 (재료 템플릿 테이블에 여기 희석에 사용되는 항체의 참고 문헌 참조)의 혼합과 투과성으로 / 차단 솔루션을 교체하고 4 ° CO / N에 품어.
- 실온에서 PBS에서 3 회 세척 한 후, 2 시간 동안 PBS에 희석 이차 항체의 혼합과 용기를 품어실온에서.
- 참고 : 현미경으로 머리카락이나 먼지 오염 수에서 혈관을 구별하기 위해 (2,000 1) 또는 DAPI : 저희는 훽스트 (2,000 1)과 핵 염색을 수행하는 것이 좋습니다.
- PBS에서 3 회 세척 한 후, PBS 50 μL에 재현 탁 선박.
8. 설치 및 관측
- 실리콘이 유리 모세관과 팁을 준비 : 메스를 사용하여 P200 피펫 팁을 절감하고 내부의 모세관을 조정합니다. 모세관의 부피는 대략 40 μL이다.
- 실리콘이 유리 모세관을 사용하여 유리 슬라이드에 혈관을 전송하고주의 깊게 흡수 종이로 액체를 제거합니다.
- 선박에 장착 매체의 한 방울을 적용하고 드롭 슬립의 가장자리를 따라 확산 할 수 있도록 45도에서 커버 슬립을 개최합니다. 커버 슬립을 가자와 매체가 서서히 확산 할 수 있습니다. 그것은 건조 O / N 실온에서 빛으로부터 보호하자. 선박은 fluoresc으로 관찰 할 수있다엔트 공 초점 현미경.
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Representative Results
여기서는. 뇌 혈관 (14)의 기계적 분리를 허용하는 프로토콜을 기술 한이 기술의 주요 단계를 요약 한 도표. 뇌 혈관의 구조는 복잡하고 여러 유형의 세포를 포함한다 즉, 내피 세포 단단히 접합하여 밀봉하고, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 성상 세포 및 발 공정 (9)에 의해 둘러싸여. 따라서, 뇌 혈관의 단리는 다음, 우리는 프로토콜의 두번째 부분에 기재된 바와 같이 면역 염색에 의해 정제하여 혈관의 구조를 특성화하기 위해 목표. 아 그린, 내피 기초 얇은 판의 구성 요소는 지속적으로 균일 내피 표면 (그림 2A)로 분류 하였다. 조나가 occludens-1 (ZO-1), 내피 꽉 접합 구성 요소 중 하나는 접합부가 꽉 내피 (도 2B)를 보존되었음을 시사 명백한 불연속로 면역 염색 하였다. 혈관 주위 세포 내피 범위, 라벨이전에 25 (그림 2C)에 설명 된대로 NG2에 의해 에드, 거의 연속 나타났다. 마지막으로, 평활근 액틴 라벨링 큰 정제 용기 (도 2d)의 표면에 조밀 한 평활근 세포 층의 존재를 밝혔다. 이러한 결과는 인 시츄 뇌 혈관 구조 전체가 절연 단편 용기에 보존 된 것으로 나타났다.
성상 세포는 거의 전적으로 뇌 시스템 (8)을 피복, 용기의 표면에 큰 프로세스 또는 'endfeet를 보낼 것으로 나타났다. 선박과의 긴밀한 상호 작용 및 유지 관리하고 다양한 뇌 기능을 조절하는 역할은, 신경 혈관 유닛 (9)의 중요한 일부로 지정. 우리는 더 고립 뇌 혈관의 성상 세포의 혈관 범위를 분석 하였다. 일반적으로 전체 성상 세포에서 GFAP, 본 성상 세포 중간 필라멘트의 Immunolabelling (그림 3A), WA부분적으로 만 존재하는 내피 세포의 표면 (그림 3B-C)에서 약간의 짧은 섬유를 보여주는 정제 선박에이야. 대조적으로, 코 넥신 43, 매우 혈관 주위 astroglial 막 (26)에 농축 된 간극 결합 단백질은 고도로 정제 된 대형 선박 (도 3D)와 모세관 (도 3e)의 표면에서 검출되었다. 마찬가지로, 아쿠아 포린 -4- (Aqp4)의 immunolabelling는 수로 가족의 구성원은 크게 절연 용기 (도 3f-G)의 벽을 개략적으로, 용기 (27), (26)에 대향 성상 세포 세포막 수준에서 발현. 성상 세포는 혈관과 협력 정제되지 않았다하더라도, 그들의 혈관 주위 endfeet 막은 뇌 혈관 분리의 기계적 부착 절차 중에 남아 있었다.
마지막으로, 우리는 다른 신경 세포 유형으로 우리 제제의 오염 가능성을 조사 하였다. 신경 중간 필라멘트의 Immunolabelling (NFM) (Hornun, 1999) G 등은 몇 가지의 연결 단자의 가능한 공동 정화 (그림 4A-B)를 나타내는 선박에 부착 된 몇 가지 남아있는 섬유의 존재를 밝혔다. Olig2 (그림 4E-F)에 의해 표시 Iba1 (그림 4C-D) 및 희소 돌기 아교 세포에 의해 표시된 미세 아교 세포는 고립 된 용기에서 검출되지 않았다. 따라서, 신경 세포, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 뇌 혈관과 협력 정제되지 않았다.
함께, 이들 결과는 설명 프로토콜 혈관 주위 성상 세포 멤브레인이 부착 된 상태로 유지시 구조적으로 보존 된 뇌 혈관 단편의 정제를 허용 것을 나타낸다.
뇌 혈관 정화 프로토콜의 그림 1. 개요 방식. 주요 단계가되게됩니다. 이 스케치는 인터넷에 따라 얻을 수있는 세 가지 용기 분수를 나타냅니다 사용 lters (20 또는 100 μm의 메쉬). (S1) : 미세 혈관 및 대 혈관, S2 : 대형 선박과 S3 :. 미세 혈관 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 고립 된 선박은 제자리 구조에서 그들의 대부분을 유지. 면역 염색 고립 된 마우스 뇌 혈관의 공 초점 이미지 돌기. (A) 아 그린 (빨간색)에 대한 immunolabelled 기저 얇은 판. (B) 내피 세포 꽉 접합은 Zonula Occludens (ZO-1 immunolabelled ) (빨간). (C) 혈관 주위 세포는 NG2 (빨간색). (D) 평활근 액틴 (SMA)에 대한 immunolabelled 평활근 세포 (적색)에 대한 immunolabelled. 핵은 훽스트 (파란색)로 염색한다.페이지 "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 성상 세포 Endfeet 막이 정제 된 용기에 부착 된 상태로 유지됩니다. 공 초점 이미지 돌기. (A) 내피 PECAM (흰색)에 대한 면역 염색 대뇌 피질의 용기를 보여주는 뇌 섹션, 성상 세포 GFAP (적색)과 넥신 43 (의 Cx43) (녹색의 이미지 ). 동종 렉틴의 B4 (흰색으로 표시 고립 된 모세관의 표면 (B, C) GFAP의 immunolabelling (녹색)) (B) 또는 평활근 액틴 (SMA) (적색) (C) 표지 큰 용기. (C)는 동종 렉틴의 B4 (흰색) (D)로 표시 고립 된 모세관의 표면에서 20 (D, E)의 Cx43의 immunolabelling (녹색)의 권한을 가진 재 인쇄입니다 또는 부드러운 근육 액틴 (SMA) 표지 큰 용기 (빨간색)의
그림 4 :.. 뉴런, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포가 뇌 혈관과 정제 공동되지 않음 공 초점 이미지 돌기 (A, B) 신경 미세 섬유 (NFM) 20 μm의 두께 해마 슬라이스 (적색) (A) 및 정제 뇌 혈관에 면역 염색 ( B). (C, B) 20 μm의 두께 대뇌 피질의 슬라이스에 미세 아교 Iba1의 면역 염색 (RED) (C) 및 정제 뇌 혈관 (D). (E, F) 20 μm의 두께 대뇌 피질의 슬라이스 (빨간색 희소 돌기 아교 세포 Olig2의 면역 염색) (E) 및 정제 뇌 혈관 (F). 핵은 훽스트 (Hoechst)에 의해 염색 (흰색 ), Isolectine의 B4 (IB4) (녹색)에 의해 내피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
혈액 - 뇌 장벽의 CNS 내 및 생체 물질의 흐름을 조절 및 혈액에 존재하는 유해 물질에 대해 자신을 보호. 그것은 신경 퇴행성 질환 2, 뇌종양 (28)를 포함하여 여러 중추 신경계 병변에 참여하고있다. BBB의 매우 낮은 투과율 역시 신경 세포 및 뇌 연구 (3)의 매우 활성 인 필드에 대해 유해한 영향을 가역적으로 BBB를 열하려는 방법의 개발을 목표로 치료제의 통과를 방해한다. 많은 노력이 설치류의 뇌에서 용기를 단리위한 유용한 모델 및 BBB의 세포 및 분자 약리학 적 조사를 허용하는 기술, 특히, 프로토콜을 개발하기위한 노력이 이루어지고있다. 첫 번째 시도는 단순히 뇌 실질 세포 (13) 오염 폐기 변수 기공 크기의 메쉬를 사용하여 기계적으로 해리 뇌 조직에서 미세 혈관을 수집, 29, 30, 31. 밀도 구배 원심 분리에 대해서는 열 32, 33, 15 나일론 메쉬 또는 유리 구슬 뇌 혈관 여과 연결된 도입 하였다. 이러한 절차에서, 나일론 메쉬 여과 대 유리 비드 고속 원심 또한 유전자 발현 (15), (32)에 영향을 전단 응력을 유도되지만, 수율을 개선하고, 저속 원심 분리, 미세 혈관 순도 대 릅니 나타났다. 소화 효소의 추가 단계는 미세 혈관 순도 35을 높이기 위해 부착 신경 세포와 성상 세포를 분리의 목적으로 해리 단계 (34) 다음과 같은 일부 프로토콜에 도입되었다. 그러나, 과도한 예비 소화 또한 마이크로 모세관 무결성 36, 37을 방해 할 수있다. 최근 면역 레이저 캡처 미세 절제 (면역 LCM)은 혈관 또는 vesse에서 뚜렷한 세포 집단의 검색을 가능하게하는 것으로 나타났다이 방법에 의해 얻어진 물질의 양이 매우 제한적 23이지만 LS, BBB 유전자 발현의 변화를 조사한다.
여기서는 처음 Yousif이 동부 (14)에 의해 알 정교 뇌 혈관의 기계적 분리를 위해 절차를 제시한다. 그것은 순수한 가능성 뇌 혈관을 획득하고, 그 직경에 따라 이들을 구분을 제공한다. 이 프로토콜은 전체 뇌 혈관 구획의 정화를 허용하는 척하지 않고, 우리는 이전에 게시 된 프로토콜의 효능을 비교하지 않았다. 그러나, 구배, 특정 열 및 고속 원심 분리 단계의 부재가 전체 과정은 매우 간단하고 저렴하게 만든다. 뇌의 균질화하기 전에 (38)에 의해 설명 된 바와 같이 우리는 오염의 가능성 소스로 경험으로 중요한 것은, 우리는 강하게, 맥락막 얼기를 제거하는 것이 좋습니다. 다른 중요한 권장 사항은 다음과 같습니다 : 1) "낮은 바인딩"플라스틱 이잖아요의 사용IAL은 선박 치료 플라스틱에 자연적으로 (특히 피펫 팁에)을 준수하기 때문이다. 대부분의 혈관의 손실이 초래 점을 생략; 2) 여과 이전에 나일론 필터 (단계 5.2)의주의 평형; 3)을 여과하기 전에 가능한 한 많은 버퍼에 펠렛을 재현 탁 시료의 순도를 향상시키기 위해; 3) 필요한 경우, 혈액 세포 및 정제 선박에 갇혀 단백질은 뇌 해부하기 전에 PBS로 심장 내 관류에 의해 세척 될 수있다; 4) 정제 용기의 수율은 덱스 트란에 두세번 (단계 4.2) (39, 40)를 수초에서 분리를 반복함으로써 개선 될 수있다. 면역 염색을 위해, 우리는 강력하게 추천한다 : 1) 항체가 큰 비 - 특이 적 친 화성을 가지고있는 머리카락과 먼지 오염으로부터 혈관을 구분하기 위해 핵 레이블링을 수행하는 단계; 2) 소재의 풀 수없는 공의 형성을 초래할 수 있으므로 각 매체 변경 전에 원심 분리하여 혈관을 수집 방지 할 수 있습니다.
그대로 뇌 혈관의 정제 BBB의 분자 특성을 연구하기 위해 큰 장점을 제시한다. 특정 또는 농후 내피와 주연 세포 유전자 경로가 개별 세포 유형 18,19에 transcriptomic 및 프로테오믹스 연구에 의해 확인되었지만, 잘 해리 세포 분류 기술 간의 상호 연결뿐만 아니라 셀 극성 및 형태의 손실로 이어질 것으로 알려져 강하게 분자 프로파일에 영향을 세포 유형. 아스트로 제외한 여기 기술 된 바와 같이 그대로 전체의 혈관 구획을 유지 이러한 맥락에서, 큰 이점을 나타낼 수있다. 또한, 셀 소팅에 비해 뇌 혈관 정화 특정 트랜스 제닉 리포터 마우스 균주 또는 긴 면역 기반 절차의 사용을 요구하지 않는다. 뇌 혈관 사용하는 또 다른 장점은 이미 murine14 도시 된 바와 같이, 다른 종의 정제 프로토콜을 적응 가능성인간 41, 42에서뿐만 아니라 bovine13. 마지막으로, 본 기술의 발전은 뇌 혈관 단편을 시험 관내 배양 될 것이다. 일차 성상 뉴런 및 소교 세포와 정제 된 혈관의 공 배양 세포를 먼저 손상 뇌 혈관 (43) 따라서 정제를 재 조립되기 전에 단리 및 정제 복잡한 3 차원 다세포 배양 시스템보다 정확한 방식으로 신경 혈관 유닛을 조립하는 데 도움이 될 BBB를 연구하는 체외 분석의 모든 종류의 발전을 위해 큰 도움이 될 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 LABEX MemoLife에 의해 ARSEP에 의해 지원되었다 (Fondation 라 공들인 쉬르 라 sclérose EN 플라크 라모 보좌관을 부어)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Pardridge, W. M.
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
- Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Iadecola, C., Nedergaard, M.
- Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
- Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
- Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
- Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
- Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
- Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
- Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
- Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
- Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
- Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
- Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M.
- Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S.
- Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
- Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
- Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
- Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
- Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
- Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
- Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
