Abstract
我々は現在の自己組織化の研究を可能にする胚様体（EB）の文化、対称性の破れ、軸方向伸長および懸濁培養でマウス胚性幹細胞（たmESC）の集合体を用いて細胞の運命の仕様を改善プロトコルを開発しました。たmESCの少数は、それらが実験的シグナルに応答する能力があるその後、非組織培養処理された、U底96ウェルプレートで48時間基礎培地に集約されます。処理後、これらの凝集体は、偏遺伝子発現の兆しを見せ、徐々に外部非対称性の手がかりのない状態で細長い、よく組織構造への細胞の球状の塊から、その形態を変えるために始めます。これらの構造だけでなく、三胚葉のマーカーを表示することができますが、積極的に決定的に細長い構造の一つの領域で発生する骨材からの個々の細胞の方向性脱落によって証明原腸陥入のような動きを、表示します。このprotocオールは、これらの凝集体の再現性の形成、などのWnt /βカテニンの活性化及びBMP阻害および単一の時点またはタイムラプス蛍光顕微鏡によるそれらの分析などの信号との刺激のための詳細な方法を提供します。さらに、当社は固定凝集体内の特異的マーカーの免疫細胞化学分析のための現在の全体のマウントマウス胚染色手順の変更について説明します。凝集体の形態、遺伝子発現及び長さの変化を定量的シグナルが、軸方向の運命を変えることができる方法についての情報を提供し、測定することができます。これは、このシステムは、このような軸方向の開発や組織として初期発生事象の研究の両方に適用され得ることが想定され、より広範に、自己組織化および細胞の意思決定のプロセス。それはまた、脊髄および運動ニューロンのような従来の接着培養から得られないある胚に存在する細胞型の生成に適したニッチを提供することができます。
Introduction
初期の哺乳類の発生における細胞運命決定の研究と理解は胚性幹細胞（ESC）の文化、自己更新し、生物、すなわち 、すべての細胞型に分化する能力を持つ胚盤胞由来クローン集団を利用することができます。、彼らは多能性1,2です。これらの培養物がされていると細胞運命決定の分子基盤を理解するために有用であることが継続しているが、それらは原腸形成中の胚で生成された空間的配置とグローバル行動の一部を再現することはできません。胚では、原腸形成のプロセスは、3つの異なる胚葉に単一上皮層を変換し、明白な前後組織3-5で胚を付与します。 ex vivoでこれらのイベントを再現しようとする試みは、ESCの三次元凝集体の発生に基づいて、胚様体（EB）と呼ばれ、それらにTを施すされていますO分化条 件6,7。これらの凝集体は、いずれかの得られるか、または誘導された低効率で接着培養または全く製造できないことができないいくつかは、多くの異なる細胞型に分化するようになだめすることができる; 例えば 、血液8および始原生殖細胞9。 EBの使用には制限がしかし、空間的な崩壊6,10で、その結果、発生中の胚の主要な特性であること胚葉分布や軸方向の組織、彼らは形態形成の動作を表示することができないということです。ある報告では、WntとEBの治療は、いくつかの集合体における遺伝子発現の弱い分極につながるが、明確な形態形成は7を観察されません。より最近の報告では、長期間にわたって培養されたEBは、その胚の対応を模倣するように網膜、皮質および内耳感覚細胞として前部構造を開発するが、軸方向のorganizatのコンテキストなし開発しますイオン11-13。
Marikawa らの報告14は 、ハンギングドロップ法により形成されたマウスP19胚性癌（EC）細胞の集合体で作業しながら、両生類でexogastrulaeで観察された伸びを思わせる中胚葉起源の細長い構造の出現を報告しましたウニ胚とケラー植15-18。これはマウス胚性幹細胞（たmESC）で観察されていなかったとして、我々はたmESC 19の集合体を使用して、P19 EC細胞で観察された現象を再現しようとしたと我々は彼らの対称性の破れと軸方向の伸びにつながる培養条件を報告します。 P19細胞を用いた作業の重要な違いは、ここで説明する集約プロトコルが代わりに懸滴の、永楽ら 20によって記載されたものと同様の96ウェルプレートで行われることです。この変更は、集約回復の観点との両方で効率の向上をもたらしました内および実験間の再現性。重要なことは、個々のウェルに凝集体を維持することは、凝集体（懸滴から共通プール集合体）との間の融合が生じないことを保証します。また、プロトコルの重要な特徴は以下の集約、GSK3阻害剤CHI99021（カイ）、Wnt /βカテニンシグナル伝達の強力な活性化への24時間の暴露です。
ここで説明する方法は、推論がインビボ19,21 の軸開発に関して行わできるようにすること、文化の中で自己組織化のプロセス、軸組織および生殖層の仕様を理解するための基礎を提供します。これらの理由のための方法は、胚で勉強することが困難な場合があるプロセスの詳細なメカニズムの分析を可能にする可能性を有します。さらに、潜在的なアプリケーションが原因のような構造化された細胞のニッチの欠如に接着培養で容易に得ることができない組織や器官の世代であり、脊髄は21とモータニューロンを前駆体です。三次元集約文化が空間的に組織的に胚系統の誘導のための新しいアプローチにつながる、従来の手段によって達成可能ではないかもしれない物理的な構造およびシグナリング環境を提供しています。
Protocol
1.培養条件の集約に先立ち
- 加湿37℃のインキュベータ、5％CO 2 21-25でゼラチンコーティングした25cm 2の組織培養処理フラスコに（製剤のための具体的な材料・機器の表を参照）ESLIF媒体でたmESCを維持します。
- このプロトコルで使用する前に解凍を投稿少なくとも2継代の細胞を増殖させます。下の通路にある細胞は、実験の反復を通じて再現可能な特性を生成することを一般的に、より成功していない（ すなわち 、文化には15以上の継代）、異なるES細胞株の間がわずかな変化が予想される（試験した細胞株については、表2を参照してください ）。
- 40〜60％の集密度に細胞を増殖させます。集計にオーバーコンフルエント細胞を使用しないでください。
骨材の2世代
- 前の暖かいPBS（+ の Ca 2+、Mg 2+を+）、ESLIF、N2B27 26,27
- 組織培養フラスコから吸引し培地（ステップ1.3）。二回、5ミリリットルのPBSで穏やかにフラスコをすすぎます。 PBSを吸引除去し、細胞を解離させるために1予め温めておいたトリプシン-EDTA（0.25％）mlの2を追加します。
- <5分間または細胞が完全にフラスコの表面から脱着するまでインキュベーターにフラスコを置きます。 1ミリリットルピペットで上下にピペット正確なカウントで均一な凝集体サイズの形成のための単一細胞懸濁液を生成します。
- 5〜10ミリリットルESLIFでトリプシンを中和します。 50 mlの遠心チューブに細胞を回収し、転送を最大にするために、成長表面を洗い流し。遠心管から1ml量を削除し、血球計数器で細胞をカウントします。
- （全体の96ウェルプレートは、5ミリリットル懸濁液中に5×10 4個の細胞を必要とする）10細胞に/μLを与えるために必要な懸濁液の容量を決定します。大deviatとして、正確に細胞を数えます述べた細胞数のイオンが悪影響刺激に対する凝集体の応答に影響を与えることができます。
- 5分間〜170×gで新鮮な50mlの遠心分離管とスピンに予め温めておいたPBS 5 mlに5×10 4細胞を追加します。
- 慎重にPBSを吸引し、5ミリリットルを追加し、PBSを静かに予め温めておきました。チューブの底にペレットを乱さありません。 5分間〜170×gで遠心分離します。
- 慎重に二度目のPBSを吸引除去します。 PBSのキャリーオーバーとしてペレットを乱すことなく、できるだけ多くのPBSを削除悪影響集計に影響を与えることができます。 （mlをサスペンション5×10 4 mlを加え4セル/ 5、例えば ）必要なボリュームにN2B27のさらなる添加に続いて、均質な細胞懸濁液を生成するために、1ミリリットルで、まずP1000ピペットで暖かいN2B27をペレットを再懸濁。
- 無菌の容器に細胞懸濁液を移し、非組織培養は、治療の各ウェルの底部に40μlの滴をピペットで、「U '底96ワットマルチチャンネルピペットを使用して、エルプレート。それに対応する蓋付き96ウェルプレートを覆い、反転卓上顕微鏡（ 図1B）を有する細胞の存在を確認します。
注：これらのプレートは、接着細胞の可能性を制限するために使用されることが必須です。ないコートにゼラチン、フィブロネクチンまたは細胞接着を促進する任意の他のコーティングと、96ウェルプレートの底を行います。 - 集計のために、CO 2を 37℃の加湿インキュベーター中で48時間、細胞をインキュベートし、5％。
3.刺激を適用し、培地を交換
- 48時間のインキュベーション期間に続いて、成功した凝集（ 図1E）を確認するために、96ウェルプレートの各ウェル内たmESCの外観を観察します。注意：凝集体は本質的に球状で直径が約150〜200ミクロンに表示されます。問題は（ 表1）発生した場合、トラブルシューティングのセクションを参照してください。
- 0;（N2B27 19に3μMChi99021（カイ）; DMSO中10mMで調製株）を150μlの新鮮な二次媒体を追加し、各ウェルマルチチャンネルピ ペットを使用します。ウェルの底に付着し始めている可能性のある骨材を除去するのに十分な力でピペット。 37℃、5％CO 2（ 図1A）の加湿インキュベーター中で24時間二次媒体中で凝集物を培養します。
注：再現性の細長い偏凝集体は、この第二の媒体を使用して生成されます。他の二次媒体の組成物も必要と例は、図3に示す実験条件に応じて使用することができます。 - その後の培地交換のために、静かに、各ウェルの側から二次媒体の150μlのを除去するために、角度（約30°）で開催されたマルチチャンネルピペットを使用しています。その後、十分な力で各ウェルにピペット150μlの新鮮なN2B27スタートを持っている可能性のある骨材を除去しますedはウェルの底に付着します。
- 時間経過するまで24時間毎に繰り返しポイント3. 3が完了した（集計培養実験の典型的な長さは120時間です）。
注意：凝集体が自由に各96ウェルプレート内との間の再現性と一貫性を確保するために、以下の培地の変更を移動していることを確認します。中には、集計期間後、毎日変更する必要があります。
共焦点顕微鏡による免疫染色と分析のための骨材の4準備
- 固定および一次抗体インキュベーション
注意：AK Hadjantonakis 28で説明されたプロトコルは、MESCの免疫染色集約に合わせて変更されました。私たちの研究とそれらの希釈で使用される典型的な抗体は、以前に発表された作品19,21,24,25,29 および表3を参照してください。- そっと側Oから150μlの培地を除去するために、角度（約30°）で開催されたマルチチャンネルピペットを使用してください96ウェルプレートの各ウェルF。各ウェルに150μlのPBSをピペットで二回洗浄します。凝集体が落ち着くことができるように、各洗浄の間に数分を残します。
- 、200μlのを分与対応するピペットチップを取り付け、滅菌ハサミで先端の端から約3mmを遮断するP1000ピペットを設定します。先端に96ウェルプレートの各ウェル内の短い方法をPBSの一部を描画し、集計を攪拌するためにそれを追放します。
- ウェル小（直径30mm）ガラスショウジョウバエの解剖に集約し、ピペットを含む内のボリューム全体を描画するために、同じチップを使用してください。よく同じガラス解剖に同一の免疫染色体制を受ける96ウェルプレートからすべての集計を転送します。
注：集計を転送する際に凝集体のキャリーオーバーを防止するために、異なる実験条件から新しいカットピペットチップを使用してください。 - aggregatが含まれているガラスウェルを配置解剖顕微鏡上にES。ガラスパスツールピペットでウェルの一方の側から中心部と吸引PBSに凝集体を強制することは、十分にガラスを渦巻。凝集体は吸引されないように、顕微鏡を使用してください。乾燥からそれらを防ぐために凝集体を覆うように、ガラスウェル内少量のPBSを残します。
- 1ミリリットル新たに調製し、ホルムアルデヒド（4％）をPBSに溶解し、低速に設定オービタルシェーカーで4℃で2時間インキュベートを追加します。注意：パラホルムアルデヒドは、アレルギー性の発癌性および毒性であることが知られています。取り扱いながら、適切な保護具を着用します。
- 項4. 1. 4で説明したように固定後、同様にホルムアルデヒド溶液を吸引し、低速に設定オービタルシェーカー上で、各洗浄のために、1 mlのPBSで3回10分間の凝集体を洗浄します。
- 項4. 1. 4で説明したようにPBSを吸引し、さらに3を実行し、10％ウシ胎児血清および0.2％トリを含むPBSで10分間洗浄トンX-100（PBSFT）。低速に設定オービタルシェーカー上で10分の洗浄を行います。
注：特に牛乳を使用した場合のプロトコル中に失われることになる凝集体の数を減少させる、透明な洗浄緩衝液中でウシ胎児血清（FBS）の結果を使用します。それは、次の固定、免疫組織化学的手順は、以下に詳述するもの以外の様々な方法で行うことができ、研究者によって決定され、最適化されるべきであることに留意することが重要です。 - 低速に設定オービタルロッカー上PBSFTで4℃で1時間凝集体をブロックします。プロトコルはこの時点で一時停止し、凝集体は、4℃で水平旋回ロッカー上で一定に撹拌しながら、O / Nをブロックすることができます。
- 前述したようにPBSFTを吸引（セクション4. 1. 4を参照）、低速に設定オービタルシェーカーで4℃でPBSFT O / N中で希釈し、必要な一次抗体を500μlとの凝集体をインキュベートします。蒸発を防ぐためにパラフィンフィルムで覆います。
- 二次抗体インキュベーション
- 一次抗体溶液を吸引し、以下のようにして（4℃）を1ml PBSFT洗浄：二回5分間。三回15分間;そして、1時間4〜7倍。 4℃で低速に設定オービタルロッカーの各洗浄ステップを実行します。注意：チルが使用するメディアの前洗浄。これはフラグメントに凝集体を引き起こす可能性があるとして、氷上での洗浄を行わないでください。
- 最終洗浄媒体を吸引除去し、水平旋回ロッカーで、暗所で4℃で500μlのPBSFTのO / Nで、必要な二次抗体との凝集体をインキュベートします。必要であれば、このようなヘキスト核染色を追加します。
- 共焦点縮小コピーによってマウントとイメージング
- 第4節1. 4で説明したように、4℃PBSFTで凝集体を洗ってください。最終洗浄後、1 mlのPBSは、以下のように0.2％FBSおよびTriton X-100（PBT）を含有する凝集物をすすぎ：二回5分間。 15分間の三回。洗浄液を実行します室温でオービタルロッカーに光から保護。
- グリセロールの1溶液：PBT（1ミリリットル）7と第30分間のインキュベーションに続いて：の3溶液1で暗所に30分間前述したように培地を吸引除去（セクション4. 1. 4）とインキュベートグリセロール：PBT（1 ml）を。
注：ローテーターを用いて4℃でグリセロールおよびPBTの溶液を混合。 - 最終的なグリセロールを吸引：PBT溶液及び媒体 24 を装着する 1ミリリットルと交換してください。 （一時停止し、パラフィンフィルムでウェルを密閉し、4℃で染色井戸を保存する場合）プロトコルは、取り付ける前に、この時点で一時停止することができます。
- カットP20チップ（ 図2）と17μlの液滴でそれらをピペットで顕微鏡スライド上の集計をマウントします。スペーサーを生成し、スライドの各端に取り付けられるように戻って、それ自体に4回を両面テープを折ります。 （ 図2）、これらのスペーサ時にトップカバースリップ（22ミリメートル×60 mm）を配置します。
注：それはカットチップがあることが不可欠です試料を損傷しないように、この段階で使用されます。スペーサは、凝集体を破砕カバースリップを防ぎます。 - 凝集体が装着されると、プロトコルを使用して共焦点顕微鏡を用いた画像のサンプルは、以前に説明19,21,24,25。一度顕微鏡上に置かれ、凝集体が取り付け媒体内に解決できるようにするために数分間のステージに邪魔されずにスライドを残します。
Representative Results
すぐにメッキした後、および集約後の細胞の外観
すぐにプレーティングした後、いずれかの標準的な倒立組織培養顕微鏡（ 図1B）で、96ウェルプレートの各ウェル内に単一細胞の存在を観察することができます。メッキの8時間以内に、これらの細胞は重力によってウェルの底に降下し始めているし、個別のクラスタ（ 図1C）に合体し始めています。 24時間後、合体細胞は一次凝集を完了しているし、個々の細胞が互いに（ 図1D）から不明瞭であり明確に定義された、まだぼろぼろの凝集体に圧縮しています。二日目（48時間）の終わりまでに、凝集体が「クリーン」になります、よく（ 図1E）内のすべてのセルを取り上げました。ウェルの底部は、この段階で集合から放出されているいくつかのセルを有していてもよいです。提供凝集体はこの時点で、N2B27に集約されていることを、彼らは、直径約150〜200ミクロン、自由にウェル内の移動（ すなわち 、ウェルの底に付着していない）、球状である必要があります。他のメディアでの集約（ すなわち 、特定の因子とESLIFまたはN2B27）が初期の凝集形態とその後の刺激に対する応答の両方変更する可能性を有する（ターナーら、準備中）。
代表的形態変化
48と72時間の間にカイを含む二次媒体（ 図1A、5A）の24時間パルスの添加は胚葉19,21の特異的なマーカーの偏発現を示す明確に定義された細長い凝集体を生成します。すぐにカイパルス（72時間）の後、凝集体は細胞を当てると、この日の終わりに向かって、これらの信号への反応（ 図3A）を表示するために開始するために開始されます。これらの応答凝集体はN2B27の最初の48時間の集約期間（ 図3B）は、次の受けた治療に依存しているどちらの遺伝子発現および形態の変化によって明らかにされています。唯一のエンドポイント解析が必要な場合は、画像に最適な時間凝集体は約96から120時間です。この時点で、凝集体は、明確な形態と遺伝子発現パターン（ 図3A）を開発してきたし、P200ピペットからの培地の排出が付着している可能性があり、そのいずれかを除去するのに十分であるので、そのサイズと質量は、まだ十分に低くなっています。ウェルに集合体の付着を防止するために失敗すると、悪影響の凝集体形成（ 図5Biv）に影響します。凝集体の形態と遺伝子発現パターンは、治療に応じて変更することができます。単一治療または因子の組み合わせのいずれかでの持続的又はパルス政権のための代表的な結果をBMP4、ドルソモルフィンH1のために示されている（BMP受容体阻害剤）、ActivinA、SB43（アクチビン/ Nodalの阻害剤）、bFGFのかPD03（MEK阻害剤）（ 図3B）。
集計イメージングと定量的画像解析
凝集体は、（主にタイムラプスイメージングのための19）のいずれか広視野顕微鏡でイメージングに適している、または19,21（ 図2）共焦点イメージングのために固定して免疫染色しました。現在のプロトコルとイメージング説明は上記の定量的な情報は、これらの凝集体から得られることを可能にします。以下、共焦点または広視野画像キャプチャ、長さ（球面または細長い; 図4A、B）凝集体の直径または脊柱に沿って対応する遺伝子の発現を測定することができます。これらの分析はまた、一つの異なる条件下での凝集体の成長、サイズ、および伸び率の情報を得ることができるタイムラプス画像、（ 図4に直接適用されています
図1.標準的な時間経過と初期の形態。（A）凝集実験のための典型的な時間経過。細胞を96ウェルプレート（P1、P2）でマウスES細胞（10細胞/μL）の懸濁液を含むN2B27中で48時間、集約されます。（B）すぐに（T =〜5分）をメッキした後、個々の細胞がすることができます懸濁液中に見られ、8H（C）で塊を形成し始めている。（D）24時間後の細胞は約100μmの直径である各ウェルの単一の集約を形成している。（E）48時間の集計後、集計直径150-200ミクロンの範囲です。 Bが変更される前に、この時点で、凝集培地（N2B27）が除去され、二次培地は、実験（パートAにおけるP1）の残りの部分または24時間のいずれかに添加されN2B27（A部におけるP2）にACK。スケールバーは100μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.顕微鏡スライド上にマウント集合体。凝集体が固定された後、免疫染色およびメディアをマウントに配置されたが、各集計は17μlの滴として顕微鏡スライド上にピペットされる（A、B、B '）。十分なスペースは、そのマージを防止するために、集計滴間に残されています。スペーサは、両面テープを用いて作られ、顕微鏡スライド（A、A '、B）の各隅部に配置されます。これは、カバーガラスが配置され、これらの上にある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
集約されたES細胞の形態に対する異なる処理の効果。図。N2B27で2日後、ES細胞は、凝集体を形成しています。特定の要因の1日パルス（A）として、または連続的にのいずれかで（B）の添加は、遺伝子発現、伸長可能性、またはそれらの全体形状の極性に対する凝集体の表現型を変化させることができます。この図の例では、ブラ:: GFP 30（A）または SOX1のいずれかから形成された骨材:: GFP 27（B）は、マウス ES細胞120時間後に画像化し、指示に従って処理されます。ホーチミン：CHIR 99021 31。 SB43：SB 431542 32; DM：DorsomorphinH1 33,34; PD03：PD0325901 番目の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図です。
図4.集約。ブラから形成された典型的な集合体の定量分析 :: GFPたmESC 25,30は、ホーチミンの24時間のパルスの後、120時間後に画像化しました。マージされた明視野像とGFPチャネルは、点Aから集合体の蛍光と長さを測定することができ、それに沿ってB（A）、（B）への集約の「背骨」をマーキングセグメント化されたラインで示されています。長さ（C）と同じ実験内の24の凝集体から「丸み」（D）が示されています 。このような丸み（D）、円形、周囲および面積などの形状記述子は、画像解析ソフトウェアフィジー35から画像解析クックブックプラグインを使用して測定することができます。各時点での水平線で示した意味。エラーバーは標準偏差を示します。 （A）中のスケールバーは200μmで示しています。レポーター細胞株との間の微妙な違いがあるように、カイのパルスの後、凝集体の平均最大長さと最小の平均円形度が変化することが予想されます。異なる細胞株の間に、我々は平均最大長は400〜800ミクロンと0.4と0.6との間の平均最小真円度〜の範囲内とすることができることがわかります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
凝集体形成の失敗の図5.例。再現性の集合体（A）を生成する能力は、（BI）、新鮮でよく混合二次媒体、（BII、BIII）などの重要な要因の初期のnをカウントの精度に依存します細胞のアンバーと（BIV）凝集体は、すなわち接着性コロニーを形成しない保証する。ウェルの表面に、「クラッシュ」。上述の条件（B）のそれぞれについて、凝集体形成における誤差の典型的な例が示されています。示されるように、スケールバー;詳細については、トラブルシューティングの表 （表1）を参照してください 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
トラブルシューティングの表1ガイド。集約プロトコルに関連の典型的なエラーは、その解決方法についての提案を与えられています。
AGGの形成のために試験した細胞株の表2表regates。細胞株との間の微妙な違いが予想されるが、凝集体とを形成するために特徴づけられていると観察された19,22,27,30,36-40細胞株の数は、上記のすべての行が条件で同様の動態を示します伸びと形態の。遺伝子発現の観点から、発現パターンは、発現された遺伝子に特異的であるが、各細胞株内で発現パターンは、継代の数に対する一般的一貫性があります。一貫性のために、私たちは文化の中で15継代を超えていない細胞からの凝集体を生成します。
これらの研究で使用される代表的な抗体の表3のリスト。抗体および集約免疫染色のために使用される希釈係数を選択します。
Discussion
この原稿に記載された技術は、効率的かつ再現Marikawa らハンギングドロップ培養の両方を組み合わせたマウス胚性幹細胞（たmESC）そのディスプレイに編成対称破りと伸び19の凝集体を生成します。14、EB形成。これらの凝集体は、視神経カップ11と大脳皮質13としてES細胞から前方器官の生成のための既存の方法を補完する、軸方向の伸びを開発するために行くと、原腸形成中と同様の表示処理3胚葉のアイデンティティと細胞を含みますこのような急速な細胞運動19,21として。
それは外部のパターニング組織が 存在しない場合に発生し、接合体非対称性が19を頭出しするので、それは、対称破りのイベントの性質を推測することは興味深いです。初歩的な軸の自発的な形成は、既存のheterogenから発生する可能性が非対称の開発のための基礎を形成する細胞の出発培養物中eities。実際、ESLIF条件で培養した細胞の集団は、1つの集約によって異なる可能性があるの相対的な割合を自己複製と分化する細胞の混合物を表示します。また、私たちの研究室での準備作業は、細胞の完全に多能性集団から凝集体が（DAターナー＆準備中A.マルティネスアリアス、）組織化パターン形成における不均一性の役割を示唆し、パターニングにおける遅延開発や欠陥を示すことを示唆しています。これは、反応拡散機構離れ骨材の表面からの阻害剤の拡散と、パターンを生成することができることを考えるとも価値があります。 Warmflash ら 41は 、このようなメカニズムが三次元でパターニングのための可能な候補作り、接着培養で放射状非対称性を開発するための責任であることを示唆しています。
イニシア中にL 48時間の集計期間は、細胞は、二次媒体19,21,24からのシグナルに応答する能力である、着床後の胚盤葉上層、内と同様の状態に達します。一般的に、ここで説明するプロトコルは、伸長のための十分な信号を提供する（例えばWntシグナル/βカテニンアゴニストなど）の要因が含まれている二次媒体のパルスで細胞を提供します。凝集細胞がオンするためのマトリゲル滴に移した前アル前ランカスターら培養方法。（ヒトESC 13を使用）、永楽ら。（たmESC 11を有する）は、低接着性の96ウェルプレート中で凝集の短い期間を使用し文化を行きます。凝集およびマトリゲル挿入の間の時間は、研究の間で異なったが、両方の場合において、多数の細胞を凝集体形成（約3,000-4,500細胞）のために使用しました。対照的に、プロトコル19ははるかに少ない細胞（約400細胞を使用してここに記載さ）集合当たりの伸長、対称性破壊及び19で観察された偏光の過程に不可欠であることが決定されています。また、これらの細長い構造は人工のマトリックス中に埋め込 むことなく、はるかに短い時間周期で生成することができます：ランカスターらによって定義された脳領域の生成を比較する（> 20〜30日）永楽から13と、光学カップ。ら（〜11日）、11偏細長い構造の生 成に必要な5日間です。
しかし、ここで説明する培養方法と制限の1つは、その大きさは井戸の底に沈むと非にでも接着性を強制するために、重力の下でそれらが有能なレンダリングまで、彼らは唯一のメッキポスト約5〜6日間培養することができるということですコーティングされたプラスチックウェア。 、先に述べたもののような人工のマトリックスを用いたさらなる実験は、私たちはの期間を長くすることを可能にします観察と実験、ワークオン行くように集合体を拘束する効果を決定することです。この技術のさらなる限界は、凝集物を除去することなく、メディアを変更するために、培地の少量をウェルの底に残さなければならないことです。化学遺伝学のための結果は、アプローチは、この希釈し、前のメディアからの残留効果を検討する必要がある：3μMチーパルスの日に、2.37μM溶液を実際に配信し、その後のメディアの変更は0.499のキャリーオーバーが生じていますμM（72〜96時間）と時間の点の間の0.105μM（96から120時間）。現在の仕事は、希釈のために修正されていない、それは日常の中の変更が残留効果を最小限にすることを想定しています。
内および実験間の再現性の両方を確保するためのプロトコルにおける重要なステップの数があります。まず、たmESCの出発培養物は十分に維持されていない共同オーバーする必要がありますnfluent、および媒体は常に良い品質、すなわちである必要があります。、新鮮でよく混合（ 図5A、B）。悪い培養条件は不利に集約（ 図5Bi）に影響を与えます 。 〜400セル/ 40μlの細胞懸濁液を得るための細胞の正確なカウントより大きな凝集体は、自己組織化に失敗し、各ウェル内の二重凝集体を形成する可能性が高いように、必要不可欠である（ 図5Bii）より小さな凝集体は正しいに到達することができないのに対し、彼らは刺激（ 図5Biii）に対応することができます密度。重要な最適化ステップは、細胞懸濁液からの汚染物質の血清を除去する第二のPBS洗浄（2.6ステップ）を含めることでした。これは、集計頻度が向上し、約24時間までに集合体の開発を加速させました。次に、確実に媒体の変更がウェルの表面に付着する可能性がある任意の凝集物を除去するのに十分な力が印加されます。そうRESUを行うに失敗骨材「クラッシュ」でLTS（ 図5Biv）。さらに、以前に言及した（以下）としては、凝集体は、懸濁培養中に維持され、任意の表面に付着することが防止されることを保証することが不可欠です。凝集物が付着したら、遺伝子発現及びその伸びの可能性のパターンが破壊されます。
この技術は、比較的簡単で、かつ十分に良好な組織培養技術を有する個体の任務の範囲内にあるように、凝集に関連する問題の多くは、比較的迅速に、これらの重要なステップに従っている場合に解決することができます。トラブルシューティングの完全なテーブル（表1）が利用可能です。マスターと、この技術は、軸開発、対称性破壊および細胞決定イベントを研究するために使用することができます。具体的には、これらの凝集体は、脊髄およびモトとしてこれまで培養物中で利用できなかった細胞のプールを生成する可能性を有しますr個のニューロン。
倫理注：これは、ヒトESやiPS細胞培養物へのこのプロトコルの翻訳はヒト胚の研究、原始線条の、すなわち世代の14日の制限の法的根拠に近い実験をもたらすことができることにより、慎重に注意すべきです、ヒト受精胚研究法と2008（英国）42で説明するように。同法に関係なく、作成した方法のすべてのライブ人間の胚をカバーしているので、ステージのような原始的ストリークを超えた人間gastruloidsの文化は、ライセンス供与研究の範囲を越えています。
Acknowledgments
この作品は、AMA、PB-Jとエラスムス、ステフティングのDRにEPSRCの学生の身分にウェルカム・トラストからプロジェクト無償の貢献でAMAにERC高度な研究者賞（DAT、TB）によって運営されています。ヘンドリックミュラーのVaderlandschフォンとFundatieバン・デ・VrijvrouweバンRenswoude TEの-Gravenhage SCvdBします。我々は彼らの実験室のプロトコルを共有するためのJ・ブリスコー、S・ムニョス・デスカルツォ、C.シュレーター、およびT.ロドリゲス、議論や建設的な批判のために、ホアキン・デNavascués封入プロトコルおよびAK HadjantonakisとC Budjan両方に感謝したいと思いますホールマウント胚の染色に関連します。この記事の以前のバージョンは、以前bioRxivプレプリントサーバ29上で利用できるようになりました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25 cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50 ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO | |
| Dissection Well (30 mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. | |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
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