Protocol
1. Purificazione di GTPase GST-tagged
- Cultura una E. coli come BL21 trasformato con pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm, in 500 ml di media autoinduzione (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 Na mM 2 SO 4, 2 MgSO mm 4, 2 mM CaCl 2, 0,5% glicerolo, 0,05% di glucosio, lattosio 0,2%, 5 g Triptone, 2,5 g estratto di lievito, 100 mg / ml ampicillina).
- Batteri Harvest per centrifugazione per 10 minuti a 10.000 xg, 4 ° C.
- Risospendere pellet batterico in 20 ml di reagente di estrazione di proteine, inibitore della proteasi 1x e incubare per 20 min a temperatura ambiente con inversione.
- Chiarire il lisato mediante centrifugazione a 40.000 xg per 30 min.
- Aggiungere 2 ml di glutatione biglie magnetiche, lavati con PBS (PBS: Na 10 mm 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Incubare per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C.
- Lavare perline proteina-caricato quattro volte con 10 ml di PBS, utilizzando un sorter particella magnetica per precipitare le perle ad ogni passo.
- Perline in 2 ml di PBS e conservare risospendere proteina-caricato a -80 ° C in aliquote di 100 microlitri fino a quando necessario.
2. Espressione di proteine GTPasi binding
- Il giorno prima dell'esperimento, plasmidi transfettare che codificano la proteina fluorescente verde (GFP) -tagged versioni di ogni proteina-GTPasi legame in un pallone da 75 cm 2 separata di HEK293T come segue. Per la convalida di nucleotide carico, transfect GFP-tagged TrioD1 in un terzo di 75 cm 2 fiasco di HEK293T.
- Diluire polyethylamine a 1 mg / ml in 100 ml di NaCl 150 mM sterile.
- Aggiungere 27 ml polyethylamine diluito a 223 ml ridotti multimediali siero.
- Aggiungere 12 mg plasmide DNA per 250 microlitri ridotti multimediali siero.
- Incubare ogni provetta per 2 minuti a temperatura ambiente. Unire la polyethylamine e DNA mescola in una singola provetta e agitare per 2 min.
- Incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
- Sostituire i mezzi di crescita (Dulbecco Modified Eagle media, il 10% di siero bovino fetale, 2 mM di L-glutammina, antibiotici), sul 90% confluenti HEK293T con 5 ml di terreni di coltura fresco.
- Aggiungere la miscela polyethylamine / DNA combinato al pallone e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2.
3. Purificazione di proteine GTPasi binding
- Sciacquare fiaschi di cellule trasfettate in PBS e scarico pallone per 5 minuti, aspirando liquido libero.
- Raschiare le cellule in 500 microlitri di buffer di lisi (50 mM Tris-HCl (pH7.8), 1% Nonidet P-40, 1x inibitore della proteasi) in provetta per microcentrifuga.
- Lisare le cellule miscelazione per inversione a 4 ° C per 30 min.
- Durante lisi, lavare due lotti di 40 microlitri GFP-Trappola perle tre volte con tampone di lisi fresco, perline sedimenta a 2.700 xg per 2 minuti tra un lavaggio.
- Chiarire lisati di centrifugazione a 21.000 xg per 10 min.
- Trasferimento chiarito lisato di ciascuna delle proteine concorrenti per separare lavate perline GFP-trappola e che consentono di proteine GFP-fusione di legarsi per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C. Tenere lisato da cellule GFP-TrioD1 sul ghiaccio.
- Lavare caricate perline GFP-trap due volte in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 e due volte in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 , sedimenta perline a 2.700 xg per 2 minuti tra lavaggi.
- Eluire proteine GFP-fusione con l'aggiunta di 40 microlitri 0,2 M glicina (pH 2,5) e pipettando su e giù per 30 sec. Immediatamente perline sedimenti a 21.000 xg per 60 s e trasferimento di liquidi in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 4 ml 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Fate questo in fretta per limitare i danni alla proteina purificata.
- Analizzare 1 ml di ogni proteina purificata mediante Western blot e sonda con un anticorpo anti-GFP stabilire resa relativa utilizzando un blott quantitativaSistema ing secondo il protocollo del produttore. In alternativa, la determinazione delle concentrazioni di proteine di acido bicinconinico (BCA) assay ma questo introduce errori se le proteine non reagiscono con il dosaggio in modo identico o ci sono proteine contaminanti.
- Uguagliare concentrazione proteica molare con l'aggiunta di 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2.
4. Nucleotide caricamento di GTPase
- Scongelare un'aliquota di GST-Rac1 biglie magnetiche, previste al punto 1.
- Prendere 90 ml di GST-Rac1 perline e lavare tre volte con 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, EDTA 4 mM, utilizzando una selezionatrice particella magnetica per precipitare le perle ad ogni passo.
- Aspirare tampone da perline e aggiungere 100 ml di 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, EDTA 4 mm.
- A seconda che il PIL, GTP o no nucleotide carico è necessario per l'esperimento della concorrenza, aggiungere 12 ml PIL 100 mm, 12 microlitri gu 10 mManosine 5 '- [γ-tio] trifosfato (GTPγS) o nessuna nucleotide a 60 microlitri GST-Rac1 perline.
- Per i controlli nucleotide-caricamento, dividere i restanti perle in tre aliquote di 10 microlitri e aggiungere 2 ml PIL 100 mm, 2 pl 10 GTPγS mM o no nucleotide ad ogni provetta.
- Incubare miscele tallone per 30 minuti a 30 ° C con agitazione.
- Stabilizzare nucleotide-bound Rac1 per aggiunta di 1 M MgCl 2: 3 microlitri al mix sperimentale (passo 4.4), 0,5 microlitri a ciascuna delle miscele di controllo (passo 4.5).
5. Concorrenza vincolante.
- Impostare 6 tubi microcentrifuga, ciascuna contenente:
200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2
10 microlitri sperimentali perline Rac1 nucleotide-caricati (dal punto 4.7)
5 microlitri proteina Rac1-binding A (proteina di legame costante) - Per ogni tubo, aggiungere 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 l-Rac1 binding protein B (proteina di legame variabile). Questi volumi assumono unpproximately uguali concentrazioni di magazzino delle proteine di legame costante e variabile e può essere necessario un aggiustamento.
- Regolare volumi di proteine leganti A e B se ci sono grandi differenze tra le affinità di legame delle due proteine e questo dovrebbe essere determinati empiricamente attraverso le ripetizioni sperimentali. Portare il volume totale della miscela di legame di 235 ml per aggiunta di 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2.
- Impostare una provetta da microcentrifuga contenente:
200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2
10 microlitri sperimentali perline Rac1 nucleotide-caricati (dal punto 4.7)
10 microlitri proteina Rac1-binding A (proteina di legame costante) - Impostare il PIL, GTPγS e senza tubi di controllo nucleotide:
200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2
10 microlitri perline Rac1 controllo caricati al passo 4.5 con il PIL, GTPγS o no nucleotidi e stabilizzato al punto 4.7.
180 microlitri HEK293T GFP-TrioD1 lisato, preparata come al punto 3.6
4 microlitri 1 M MgCl 2 - Incubare la miscela per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C.
- Lavare le perline tre volte con 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2.
- Eluire proteine legate in 20 microlitri riducenti tampone (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glicerolo, 0,02 mg / ml di blu di bromofenolo, 5% β-mercaptoetanolo).
6. Analisi della concorrenza
- Risolvere 10 ml di proteina legata (passo 5,6) mediante elettroforesi dodecil solfato di sodio gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) e Western Blot.
- Incubare la membrana a 4 ° CO / N in anticorpo anti-GFP diluito 1/1000 in tampone bloccante diluito a 1x in PBS, 0,1% di Tween-20 per rilevare entrambe le proteine GTPasi legame con tag.
- Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti con PBS, 0,1% Tween-20.
- Incubare la membrana per 30 minuti a RT in DyLight 800 sec-coniugato anti-coniglioanticorpo daria, diluito 1 / 10.000 in tampone bloccante diluito a 1x in PBS, 0,1% di Tween-20.
- Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti con PBS, 0,1% Tween-20.
- Scansione la membrana utilizzando un sistema di imaging a raggi infrarossi, utilizzando il software per misurare l'intensità di banda secondo il protocollo del produttore.
- Tracciare la intensità della banda di ciascuna proteina contro il volume del concorrente variabili (Protein B).
- Dividere il volume di concorrente variabile nel punto in cui le linee si intersecano dal volume di concorrente costante (Proteina A, 5 ml) per determinare il rapporto concorrente che è raggiunto l'equilibrio.
- Per la convalida dello stato di nucleotide-caricamento, membrane sonda per p21-chinasi attivata 1 (PAK1) (un'unità di effetti) e GFP-TrioD1 (un GEF), come descritto nei passaggi 6.1-6.6.
Representative Results
Questo protocollo è progettato per calcolare le relative affinità di legame per i partner Rac1, senza la necessità di conoscere la precisa concentrazione dei concorrenti (Figura 1). Determinazione della concentrazione proteica introduce errori e quando si considera la concorrenza tra le molecole in un percorso di segnalazione non è necessaria. Tuttavia, è importante sapere che i due concorrenti hanno la stessa concentrazione molare nelle soluzioni madre a consentire rapporti semplici da calcolare quando si aggiungono volumi diversi per il saggio. 40 ml di perline GFP-trap hanno una capacità di legame di ~ 300 pmol così un confluente 75 centimetri 2 fiaschi di altamente cellule che esprimono saturerà le perline, con il risultato che i preparativi delle due diverse proteine di legame saranno simili prima della regolazione (figura 2A). Se una delle proteine esprime male, questo problema può essere superato purificando quella proteina da più di un pallone di cellule.
8 (Figura 2B). GEFs legano preferenzialmente al nucleotide-liberi GTPasi per stabilizzare lo stato di transizione. Come GEFs sono di bassa abbondanza, solitamente inattivo e spesso asciugare bene male, è meglio iperespressione di un GEF o GEF frammento di prova GTPasica senza nucleotide. Usiamo spesso la prima omologia Dbl di Trio, espresso come una fusione GFP (GFP-TrioD1 9) (Figura 2B), ma qualsiasi GEF avrebbe funzionato. Le proteine che si legano al GTPasi PIL-caricati sono più rari. Recentemente abbiamo riportato RCC2 come una di queste proteine 7, o PIL di carico può essere convalidato semplicemente come binding né alla GEF né effettrici.
L'uscita dal esperimento sarà una macchia occidentale raffigurante i due partner di legame GFP-tagged legati alla GTPasi. Utilizzando un singolo anticorpo per rilevare entrambe le proteine, le concentrazioni alle quali simili quantità di entrambi i concorrenti legano può essere determinato e quindi le relative affinità presupposta. In questa competizione esempio, tra il dominio propulsore della proteina Rac1-tratta, Coronin-1C (Rac1-binding protein A), e la proteina Rac1-sequestro, RCC2 (Rac1-binding protein B), è dimostrato (Figura 3A). Utilizzando un volume costante di Coronin-1C elica (5 ml), e l'aggiunta di crescenti volumi di RCC2, possiamo vedere dalla GFP macchia che l'equilibrio è raggiunto a 1,25-2,5 ml di RCC2 (asterisco), dimostrando che ha una forte RCC2 affinità per Rac1 di Coronin-1C. Misurando l'intensità delle bande utilizzando Western blotting quantitativa, e riportando i valori medi per ogni competitoR, il punto di equilibrio può essere calcolata con precisione identificando i volumi in cui le curve si intersecano (Figura 3B).
Uno dei possibili ostacoli ad un dosaggio competere con successo è se il partner di legame si legano l'uno all'altro così come legame Rac1. Nella Figura 3A + B dimostriamo concorrenza tra RCC2 e il dominio propulsore di Coronin-1C, piuttosto che full-length Coronin-1C. La ragione per usare la Coronin troncato è che Coronin-1C si lega anche RCC2 attraverso il dominio di coda. Quando full-length Coronin-1C è titolato con RCC2, legame di entrambe le proteine viene rilevato, a causa della formazione del complesso ternario, piuttosto che la concorrenza (Figura 3C). Se la concorrenza è in corso, legame di una proteina aumenta mentre l'altra diminuisce, e totale legato GFP-fusione rimarrà costante. Nei casi in cui un complesso ternario forma è necessario troncare una delle proteine GTPasi vincolanti, talché la competmodifiche ai contenuti interagire non più.
Figura 1. Flusso di lavoro. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per determinare l'affinità delle proteine GTPasi legame con saggi di concorrenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La convalida di proteine purificate. (A) purificato GFP-tagged proteine analizzate mediante Western blot vincolante, sondando con anti-GFP per determinare la resa relativa delle due proteine Rac1. Questo tipo di equalizzazione durante l'esperimento permette la concentrazione delle due proteine di essere regolata in modo che corrispondano nell'esperimento vincolante. (B) GDP, GTPγS e non nucleotide-caricato GST-Rac1 è stata incubata con lisato da HEK293T esprimono GFP-TrioD1 e proteine rilevate tracciando per PAK1 endogena o sovraespresso GFP-TrioD1 legate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Western blot di proteine relativo vincolante. Uscite esempio da saggi di concorrenza vincolante. (A) GDP-caricato Rac1 è stato mescolato con 5 microlitri GFP-Coronin-1C dominio elica e volumi crescenti di GFP-RCC2 stati titolato in. Per Western blotting proteine legate per GFP, problemi con rilevamento differenziale delle due proteine vengono evitati e il segnale GFP riporta il rapporto molare tra i due proteine di fusione. Gli asterischi indicano i rapporti di concorrenza in eithelato r il punto di equilibrio. (B) Banda intensità rilegati proteine GFP fusione di tre esperimenti indipendenti sono stati misurati mediante Western blotting quantitativa, utilizzando fluoroforo-coniugato anticorpi secondari e le medie complottato per calcolare la quantità di RCC2 necessaria per raggiungere l'equilibrio. (C ) Esempio di output da un esperimento in cui proteine Rac1 vincolanti legano fra loro e formano un complesso ternario, invece di competere. PIL-caricato Rac1 è stato mescolato con 5 microlitri GFP-RCC2 e volumi crescenti di GFP-Coronin-1C full-length sono stati titolati in. L'aumento del limite GFP-Coronin-1C senza perdita di limite GFP-RCC2 indica ternario formazione complessa. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
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