Protocol
1. Rensing av GST-merket GTPase
- Kultur en E. coli-stamme slik som BL21 transformert med pGEX-Rac1 O / N ved 37 ° C risting ved 220 rpm, i 500 ml autoinduksjonen medier (25 mM Na2 HPO 4, 25 mM KH 2PO 4, 50 mM NH4CI, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5% glyserol, 0,05% glukose, 0,2% laktose, 5 g trypton, 2,5 g gjærekstrakt, 100 ug / ml ampicillin).
- Høste bakteriene ved sentrifugering i 10 min ved 10 000 xg, 4 ° C.
- Resuspender bakteriell pellet i 20 ml proteinekstraksjon reagens, 1x protease inhibitor og inkuberes i 20 min ved RT med inversjon.
- Klargjøre lysatet ved sentrifugering ved 40 000 xg i 30 min.
- Tilsett 2 ml glutation magnetiske kuler, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS: 10 mM Na HPO 2 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Inkuber i 2 timer, blandes ved inversjon ved 4 ° C.
- Vask protein belastede kuler fire ganger med 10 ml PBS ved hjelp av en magnetisk partikkelsorterer for å utfelle perlene på hvert trinn.
- Resuspender protein-lastet perler i 2 ml PBS og oppbevar ved -80 ° C i 100 ul porsjoner inntil nødvendig.
2. Expression of GTPase bindende proteiner
- Dagen før forsøket, transfektere plasmider som koder for grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged versjoner av hvert GTPase-bindende protein til et separat 75-cm2 kolbe av HEK293T som følger. For validering av nucleotide lasting, transfeksjon GFP-merket TrioD1 inn en tredje 75-cm 2 kolbe HEK293T.
- Fortynn polyethylamine til 1 mg / ml i 100 ul steril 150 mM NaCl.
- Legg 27 mL fortynnet polyethylamine til 223 mL reduserte serum medier.
- Legg 12 ug plasmid DNA til 250 mL reduserte serum medier.
- Inkuber hvert rør i 2 min ved RT. Kombiner polyethylamine og DNA blander i et enkelt rør og vortex i 2 min.
- Inkuber i 15-20 minutter ved RT.
- Sett på vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles Media, 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, ingen antibiotika) på 90% konfluent HEK293T med 5 ml friskt vekstmedium.
- Tilsett kombin polyethylamine / DNA-blandingen til kolben og inkuberes O / N ved 37 ° C, 5% CO2.
3. Rensing av GTPase-bindende proteiner
- Skyll kolber av transfekterte celler i PBS og avløp kolbe i 5 min, aspirere fri væske.
- Skrap av celler i 500 ul lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x protease-inhibitor) i mikrofugerør.
- Lyse-celler ved blanding ved inversjon ved 4 ° C i 30 min.
- Under lyse, vaske to massevis av 40 mikroliter GFP-Trap perler tre ganger med frisk lysisbuffer, sedimenter perler på 2700 xg i 2 min mellom hver vask.
- Avklare lysatene etter sentrifugering ved 21 000 xg i 10 min.
- Overføring klaret lysat av hver av de konkurrerende proteiner for å skille vasket GFP-felle kulene og tillater GFP-fusjonsproteiner til å binde i 2 timer, blandes ved inversjon ved 4 ° C. Hold lysat fra GFP-TrioD1 celler på is.
- Vask lastet GFP-Trap perler to ganger i 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 og to ganger i 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 , sedimenter perler på 2700 xg for 2 minutter mellom hver vask.
- Eluere GFP-fusjonsproteiner ved å tilsette 40 pl 0,2 M glycin (pH 2,5) og pipettering opp og ned i 30 sek. Umiddelbart sediment perler ved 21 000 xg i 60 s og overføre væske til et nytt mikrosentrifugerør inneholdende 4 ul 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Gjør dette raskt for å begrense skader på renset protein.
- Analyser 1 mL av hver rensede protein ved Western blot og sonde med et anti-GFP-antistoff for å etablere relative utbyttet ved hjelp av en kvantitativ blotting system i henhold til produsentens protokoll. Alternativt kan bestemme proteinkonsentrasjonen av bicinchoninic syre (BCA) assay, men dette fører til feil hvis proteinene ikke reagerer med analysen på en identisk måte, eller det forurensende proteiner.
- Utjevne molar proteinkonsentrasjon ved tilsetning av 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
4. Nucleotide lasting av GTPase
- Tine en delmengde av GST-Rac1 magnetiske kuler, utarbeidet i trinn 1.
- Ta 90 ul av GST-Rac1 perler og vasker tre ganger med 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, ved anvendelse av en magnetisk partikkelsorterer for å utfelle perlene på hvert trinn.
- Aspirer buffer fra kulene og tilsett 100 pl 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
- I henhold til hvorvidt GDP, GTP eller ingen nukleotid lasting er nødvendig for konkurranseeksperiment, tilsett 12 pl 100 mM GDP, 12 pl 10 mM guanosine 5 '- [γ-tio] trifosfat (GTPyS) eller ingen nukleotid til 60 ul GST-Rac1 perler.
- For de nukleotid-lasting kontroller, dele de resterende perler i tre 10-ul porsjoner og tilsett 2 mL 100 mM BNP, 2 ul 10 mM GTPyS eller ingen nucleotide til hvert rør.
- Inkuber bead mikser i 30 minutter ved 30 ° C under omrøring.
- Stabil nukleotid-bundet Rac1 ved tilsetning av 1 M MgCl2: 3 ul til den eksperimentelle blandingen (trinn 4,4), 0,5 pl til hver av styre mikser (trinn 4.5).
5. Konkurranse bindende.
- Sett opp 6 mikrofugerør, som hver inneholder:
200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 pl eksperimentelle nucleotide belastede Rac1 perler (fra trinn 4.7)
5 ul Rac1-bindende protein A (konstant bindende protein) - Til hvert rør, tilsett 0, 1, 2,5, 5, 10 eller 20 ul Rac1-bindende protein B (variabel bindingsprotein). Disse volumene anta enpproximately like lager konsentrasjoner av de konstante og variable bindende proteiner og kanskje må justeres.
- Justere volum av bindende proteiner A og B hvis det er store forskjeller i bindingsaffinitetene av de to proteinene og dette bør bestemmes empirisk gjennom eksperimentelle gjentas. Utgjør det totale volum av bindingsblandingen til 235 ul ved tilsetting av 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Sett opp en mikrofugerør som inneholder:
200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 pl eksperimentelle nucleotide belastede Rac1 perler (fra trinn 4.7)
10 pl Rac1-bindende protein A (konstant bindende protein) - Sett opp BNP, GTPyS og ingen nucleotide kontrollrørene:
200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 ul kontroll Rac1 perler lagt i trinn 4.5 med BNP, GTPyS eller ingen nucleotide og stabilisert i trinn 4.7.
180 mL HEK293T GFP-TrioD1 lysat, fremstilt som i trinn 3.6
4 pl 1 M MgCl2 - Inkuber blandingen i 2 timer, blandes ved inversjon ved 4 ° C.
- Vask kulene tre ganger med 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Elute bindes proteiner i 20 ul reduserende prøvebuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glyserol, 0,02 mg / ml bromfenolblått, 5% β-merkaptoetanol).
6. Analyse av konkurranse
- Løse 10 ul av det bundne protein (trinn 5.6) ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og Western blot.
- Inkuber membranen ved 4 ° CO / N i anti-GFP-antistoff fortynnet 1/1000 i blokkeringsbuffer ble fortynnet til 1 x i PBS, 0,1% Tween-20 for å detektere både av de merkede GTPase-bindende proteiner.
- Vask membranen tre ganger i 10 minutter med PBS, 0,1% Tween-20.
- Inkuber membranen i 30 minutter ved RT i DyLight 800-konjugert anti-kanin-sekgående antistoff, fortynnet 1 / 10,000 i blokkeringsbuffer ble fortynnet til 1 x i PBS, 0,1% Tween-20.
- Vask membranen tre ganger i 10 minutter med PBS, 0,1% Tween-20.
- Skanne membranen ved hjelp av en infrarød imaging system, ved hjelp av programvare for å måle bandet intensiteten i henhold til produsentens protokoll.
- Plott båndet intensiteten av hvert protein mot volumet av det variable konkurrent (Protein B).
- Dividere volumet av variable konkurrent på det punkt hvor linjene krysser hverandre ved konstant volum av konkurrent (Protein A, 5 mL) for å bestemme den konkurrenten forholdet ved hvilken likevekt er oppnådd.
- For validering av nukleotid-lasting status, probe membraner for p21-aktivert kinase 1 (PAK1) (en effektor) og GFP-TrioD1 (en GEF), som beskrevet i trinn 6.1-6.6.
Representative Results
Denne protokollen er utformet for å beregne de relative affiniteter av bindingspartnere for Rac1, uten behov for å kjenne den nøyaktige konsentrasjonen av konkurrentene (figur 1). Bestemmelse av proteinkonsentrasjon introduserer feil, og da med tanke på konkurranse mellom molekylene i en signalveien ikke er nødvendig. Imidlertid er det viktig å vite at de to konkurrentene har den samme molare konsentrasjon i lagerløsninger for å tillate enkle forhold som skal beregnes ved å tilsette forskjellige volumer til analysen. 40 ul av GFP-Trap perler har en bindingskapasitet på ~ 300 pmol så en konfluent 75 cm2 kolber av høyt uttrykkende celler vil mette perlene, med det resultat at preparatene i de to forskjellige bindingsproteiner vil ligne før justering (figur 2A). Dersom en av proteinene uttrykker dårlig, kan dette problemet overvinnes ved å rense dette protein fra mer enn en kolbe av celler.
8 (figur 2B). GEFs bindes fortrinnsvis til nukleotid-fri GTPase for å stabilisere overgangstilstanden. Som GEFs er av lav overflod, vanligvis inaktive og ofte blot dårlig, er det bedre å overuttrykke en GEF eller GEF fragment til test nucleotide fritt GTPase. Vi bruker ofte den første Dbl homologi av Trio, uttrykt som en GFP fusjon (GFP-TrioD1 9) (figur 2B), men noen GEF ville fungere. Proteiner som binder seg til BNP-lastet GTPase er sjeldnere. Vi har nylig rapportert RCC2 som ett slikt protein 7, eller BNP-lasting kan valideres bare som binding til verken GEF eller effektor.
Utgangen fra eksperimentet er en Western blot som viser de to GFP-merket bindingspartnere bundet til GTPase. Ved å bruke en enkelt antistoff for å påvise begge proteiner, kan konsentrasjonene ved hvilke tilsvarende mengder av begge konkurrenter binder bestemmes og derfor de relative affiniteter utledes. I dette eksempel konkurranse mellom propell domenet til Rac1 handel protein, er coronin-1C (Rac1-bindende protein A), og den Rac1-sekvestrerende protein, RCC2 (Rac1-bindende protein B), viste (figur 3A). Ved å bruke en konstant volum coronin-1C propell (5 mL), og legger til økende volumer av RCC2, kan vi se av GFP blot at likevekt er nådd på 1,25-2,5 ul RCC2 (stjerne), viser at RCC2 har en sterkere affinitet for Rac1 enn coronin-1C. Ved å måle intensiteten av båndene ved bruk av kvantitativ Western-blotting, og plotte gjennomsnittlige verdier for hver competitor, kan likevektspunktet beregnes nøyaktig ved å identifisere de volumer ved hvilken kurvene skjærer hverandre (figur 3B).
En av de mulige hindringer for en vellykket konkurranseanalyse er hvis bindingspartnere binde seg til hverandre, så vel som binding til Rac1. I figur 3A + B demonstrerer vi konkurranse mellom RCC2 og propellen domene av coronin-1C, snarere enn full-lengde coronin-1C. Grunnen til å bruke den avkortede coronin er at coronin-1C binder også RCC2 gjennom haledomene. Når full-lengde coronin-1C titreres mot RCC2, er binding av begge proteiner detekteres, på grunn av ternære kompleksdannelse, i stedet for konkurranse (figur 3C). Ved konkurranse er oppstått, vil binding av en protein øke mens de andre avtar, og total bundet GFP-fusjon vil forbli konstant. I de tilfeller hvor et ternært kompleks dannes det er nødvendig å kutte en av de GTPase-bindende protein, slik at competitors ikke lenger samhandle.
Figur 1. arbeidsflyt. Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten for å bestemme affinitet GTPase bindende proteiner ved hjelp av konkurranseanalyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Validering av rensede proteiner. (A) Renset GFP-merket Rac1 bindende proteiner analysert ved Western blot, sondering med anti-GFP å bestemme den relative utbyttet av de to proteinene. Denne type utligning under forsøket tillater at konsentrasjonen av de to proteinene som skal justeres slik at de passer i bindingen eksperimentet. (B) GDP, GTPyS og ingen nucleotide lastet GST-Rac1 ble inkubert med lysat fra HEK293T uttrykker GFP-TrioD1 og bundet proteiner oppdages ved å plotte for endogen PAK1 eller overexpressed GFP-TrioD1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Western blot-analyse av relative proteinbinding. Eksempel utganger fra konkurranse-bindingsanalyser. (A) GDP-lastet Rac1 ble blandet med 5 pl GFP-coronin-1C propell domene og økende volumer av GFP-RCC2 ble titrert i. Ved Western blotting-bundne proteiner for GFP, blir problemer med differensial deteksjon av de to proteinene unngås og GFP signal rapporterer det molare forhold mellom de to fusjonsproteiner. Stjernene viser konkurranseforhold på either side av likevektspunktet. (B) Bånds intensiteter av bundne GFP fusjonsproteiner fra tre uavhengige eksperimenter ble målt ved hjelp av kvantitativ Western blotting, ved hjelp av fluoroforen-konjugerte sekundære antistoffer og gjennomsnittene plottet for å beregne mengden av RCC2 nødvendig for å nå likevekt. (C ) Eksempel utgang fra et eksperiment hvor Rac1-bindende proteiner binder seg til hverandre og danner et ternært kompleks, snarere enn konkurrerende. BNP-lastet Rac1 ble blandet med 5 pl GFP-RCC2 og økende volumer av GFP-coronin-1C helaftens ble titrert i. Økningen i bundet GFP-coronin-1C uten tap av bundet GFP-RCC2 indikerer trefoldig kompleks formasjon. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
