Whisker-signalisert eyeblink klassisk betinging i hodet fiksert Mus

Introduction

Eyeblink condition er en form for Pavlovian condition og et modellsystem for å undersøke nevrale mekanismer for assosiativ læring og hukommelse. Det har blitt undersøkt i forskjellige arter, inkludert mennesker, kaniner, katter, rotter og mus. Paradigmet innebærer presentasjon av to sammenkoblede stimuli: en nøytral betinget stimulus (CS, for eksempel, en tone, et lysglimt, eller whisker stimulering), og en fremtredende ubetinget stimulus (US, for eksempel, en luft puff for øyet, eller periorbitalt sjokk). Den amerikanske utløser en ubetinget, refleksiv eyeblink respons (dvs. UR). Til slutt, etter flere presentasjoner av paret CS-amerikansk, lærer faget å knytte CS med USA. Dette læring manifesterer seg i form av en betinget respons (CR), en eyeblink utløst av CS alene som går forut for presentasjonen av USA.

Eyeblink condition i spor skjemaet inneholder en stimulus fritt intervall på noen hundred millisekunder som skiller CS og USA (Figur 1). Trace condition er en form for deklarativ læring siden det krever bevissthet om stimulanse situasjoner ^1. Den tidsmessige gapet krever dyret å holde en neural "spor" av CS i forhjernen regioner som hippocampus for at USA og CS å bli assosiert ^1-6. Sammen med forhjernen regionene, er spor kondisjone også avhengig av cerebellum ^7.

Eyeblink condition er derfor en nyttig paradigme for etterforskningen av de mange fasetter av minne, inkludert oppkjøp, konsolidering, og gjenfinning. Under eyeblink condition, er en kontrollgruppe av dyr presenteres med uparede stimuli i tilfeldig rekkefølge for å teste for pseudoconditioning eller sensitive svar på CS som kan være forårsaket av amerikanske presentasjon alene heller enn en lærd CS-amerikanske foreningen.

En vanlig brukt Apparatertus for etterforskningen av eyeblink condition i gnagere er et kammer der gnagere får lov til å bevege seg fritt under opplæringsprosessen ^8-10. Med denne type apparat er en tjore vanligvis festet til et hodestykke som er festet til den gnager skallen. Fortøyningen gjør det mulig for levering av USA (og noen ganger CS) og for overføring av dyrets respons på disse stimuli (dvs. eyeblink respons) ^10. Fortøyningen i seg selv kan bli modifisert basert på typen av stimuli levert og hvordan den eyeblink responsen registreres.

Grunnen til å bruke "fritt bevegelige" tethered mus for eyeblink condition er at mus kjemper mot tilbakeholdenhet. Selv om andre arter kan være mer mottagelig for tilbakeholdenhet, er den store fordelen med å bruke mus i eyeblink condition eksperimenter som de fleste tilgjengelige genmodifiserte mutantstammer er musestammer. I tillegg til sliter, komplett restraint av mus resulterer i akutt nød. Et hode-fast mus forberedelse som minimerer stresset ville øke den fysiologiske informasjon som kan oppnås i løpet eyeblink condition. For eksempel vil dette systemet tillater avbildning av kortikale nevroner med to-foton mikroskopi ^11.

Hodefaste preparater har blitt brukt i tidligere eksperimenter for optisk avbildning av hjernebarken gjennom flyttbare hjerneimplantater, in vivo elektrofysiologiske opptak av gnager hjernen med tetrode arrays, to-foton kalsium bildebehandling, og også som en plattform for eyeblink condition i mus ^{11 -16.}

I hodet faste system, er pålitelig stimulering og opptak sikres uten fullstendig beherskelse av mus (figur 2). En hodestykket som den som ble brukt i den fritt bevegelige systemet er festet til musens skallen. Under trening, er hodedelen festet til et koplingsstykke som er festet til stolpene i løpeten sylindrisk tredemølle for å stabilisere den gnager hode (figur 2A). Den sylindriske tredemølle gjør at musen til å hvile komfortabelt, men hvis musen ønsker det, kan også det å løpe eller gå. Med bruk av dette systemet, kan mus trenes med en whisker vibrasjon som CS og en mild periorbital elektrisk støt som USA (figur 1). Den amerikanske leveres gjennom ledninger opereres inn under huden lateralt for øyet. CS er levert via en kam som er festet til en to-lags rektangulær bøying aktuator (figur 2B). Kammen og bøye aktuator blir så festet til en magnetisk base som beveges til riktig stilling under trening og er justert for optimal levering for hvert enkelt dyr. Kammen er posisjonert til å skreve de valgte værhår. Under levering av CS, sendes det et signal til den aktuator som bøye forskyver kammen og fører til vibrasjon av hårkrystallene ^17.

16,18,19. Grunnen til at whisker stimulering er valgt for CS i denne eksperimentelle paradigmet er avhengigheten av murine dyr på deres vibrissae for somatosensory informasjon om inndata under utforskning. Whisker stimulering har vist seg å være en pålitelig og effektiv CS ^20. Videre gis det veletablerte og organisert kortikale substrat for vibrissae system (dvs. fat cortex), whisker stimulering som CS gir et elegant verktøy for å kartlegge kortikale endringer og plastisitet knyttet til læring eyeblink condition ^20,21. Et hode-fast system gir mulighet for nøyaktig stimulering av utvalgte værhår å sammenligne svarene mellom stimulerte nevroner og nevroner som mottar innspill fra ikke-stimulert værhår. Til slutt, mange stammer av mus utviser aldersrelatert hørselstap som relativt unge voksne 16). Whisker stimulering er ikke påvirket av noen av disse komplikasjoner.

Presenteres her er unike og viktige endringer ved andre hode-fast forberedelsene til eyeblink conditioning, herunder metoder for CS og USA levering, og oppkjøpet av eyeblink respons. Påliteligheten av dette apparatet, og opplæringen paradigmet i eyeblink condition er demonstrert ved å lære kurver fra klimaanlegg mus og en relativt flat læringskurve fra pseudoconditioned kontrolldyrene (figur 7a).

Protocol

Alle prosedyrer som involverer mus ble utført i henhold til protokoller godkjent av Northwestern University Institutional Animal Care og bruk komité basert på retningslinjer fra National Institute of Health.

1. Sylinder (figur 2A)

1. Konstruere sylinderen som beskrevet av Chettih et al. Og Heiney et al., Fra en lang skumsylinder ^14-15. Skjær en 10 cm lengde av sylinderen og bore et hull gjennom midten for å passe til akselen, en metallstav 12,7 mm (0,5.) I diameter. Monter sylinderen med sin aksel på en metall optisk brødfjel som beskrevet av Heiney et al., Eller annen støtte (f.eks pleksiglass) ^15.
2. Opprettstående to vertikale metallstenger av 12,7 mm i diameter på hver side av sylinderen.
3. Fest to rettvinklede mounts på metallstenger.
4. Fest to stenger (5 cm lang, 12,7 mm i diameter) gjennom rettvinklede mounts. bevel the ender av disse stenger og utjevne deres ender over midten av sylinderen (figur 2G).
5. Bor og tapp hull gjennom flatet endene av stengene til å passe to 4-40 maskinskruer som vil holde vingene på kontakten på plass (figur 2G).

2. Montering av Whisker Stimulering System (figur 2B)

1. Skjær en 10-tann segment av kam fra en vanlig hår kam.
2. Skjær en spalte på 2-3 mm bred og ca 5 mm dype på den øverste delen av kammen for å ta imot en to-lags rektangulær bøying aktuator.
3. Lodd en ledning til hver enkelt overflate av den bøye aktuatoren. Bruk loddetinn og fluks gitt av produsenten. Dekk aktuatoren og loddetinn med elektriske tape for å beskytte mus og bruker fra den elektriske strømmen.
4. Slip aktuatoren strimmelen inn i slissen skjærer inn i kammen slik at bøye aktuatoren strimmelen ligger vinkelrett på planet av kammen. Vinkel kammen slik at den står slik at 45 ° og mer naturlig følger krumningen av mus ansikt.
5. Fest enden av aktuatoren strimmelen til toppen av kammen med hurtigsettende epoksy.
   Merk: tråder loddet til den bøye aktuatoren strimmelen skal være koblet til en reostat som leverer 40 volt til aktuatoren. Tidligere forsøk har vist at 40 volt er effektiv for kondisjonering, men ikke fremkalle noen skremme responser.
6. Plasser bøye aktuator og kammen på en bevegelig mount. En pipette holder festet til en magnetisk base som normalt anvendes for in vitro elektrofysiologiske rigger fungerer godt.

3. Montering av Connector som Monterer å Rods over Cylinder (figur 2C, 2E)

Merk: Kontakten er en 3-D utskrift 7-hull stripe modellert fra Amphenol 221 serien nylon bånd brukes til fortøyning av Weiss og Disterhoft og Galvez et al ^10,17.

1. Trykk det første hullet i stripe for en 0-80 x-en"Maskin skrue. Dette vil fungere som en låseskrue å feste hodestykket til kontakten. Fest en 0-80 mutter til hodet på låseskrue med cyanoakrylsyre lim for å lette dreie skruen for hånd.
2. La ett hull tom etter gjengehullet (for å gi plass til 0-80 maskin mutter) og skyv fem gullbelagte relia-tac stikkontakter gjennom de resterende fem hull.
3. Strip belegget av fem lange ledninger (ledninger hentet fra en Ethernet-kabel) og loddetinn på endene av stikkontakter.
   Merk: De to første ledningene vil bli brukt til å registrere elektromyografisk (EMG) signaler som vil oppdage en eyeblink respons etter signal filtrering og forsterkning fra en forsterker. Den andre to vil levere sjokk signal fra en stimulus isolator. Den siste ledningen vil fungere som en jordforbindelse. Disse ledningene vil bli koblet til systemene for tidsbestemt CS-amerikanske levering.
4. Sørg for elektrisk tilkobling mellom ledninger og stikkontakter med en multimeter. Sett multimeter på kontinuitet innstilling og hold en av sondene til pinnen og den andre sonde til avisolerte endene av ledningen. Pinnene og ledningene er elektrisk tilkoblet når motstanden er lav og multimeter avgir en tone.
   1. Alternativt, dersom multimeter ikke har en kontinuitet innstilling, måle motstanden mellom pinnene og trådene. Det er elektrisk kontinuitet dersom det er meget liten motstand målt.
5. Forbered vingene av kontakten fra to til-220 stil transistorer. Skjær av emitter, base, Samler leder av transistoren og nivå overflaten slik at den kan festes til kontakten.
6. Skjær kanten av monteringsfanen for å bryte hullet slik fanen kan skli under skruehodet.
7. Epoxy transistorer til kontakten. Hullet i monterings fliken vil bli brukt for å sikre kontakten med stavene ovennevnte sylinderen.
8. Anvende epoksy til bunnen av trådene protruding fra stikkontakter og la epoxy tørke. Epoxy vil isolere og beskytte tilkoblingene.

4. Klargjøring av headpiece (figur 2D, 2E)

Merk: headpiece stripen er et 3-D utskrift 7-hull stripe modellert fra Amphenol 221 serien nylon bånd brukes til hovedstillingen ved Weiss og Disterhoft og Galvez et al ^10,17.. Dette stykket er ikke lenger produseres kommersielt. Skriveren filen kan lastes ned fra denne tidsskriftets hjemmeside.

1. Trykk det første hullet i stripe for en 0-80 x 1 "maskin skrue og la ett hull tom etter det første hullet.
2. Push fem gullbelagte pinner gjennom bunnen av de gjenværende fem hull (gjennom de smalere ender). Bruk en skrustikke for å lette presse pinnene i strip jevnt.
3. Ved hjelp av en termisk stripper, fjerne ca. 0,5 cm av polyimid belegg av enden av en rustfri ståltråd (0,005 i. Diameter), lodde den avisolerte enden av wire til åpningen av en av pinnene, og kutte ledningen til 0,6-0,7 cm.
4. Fjern ca. 0,2 cm fra enden av ledningen for å tillate strøm å passere til dyret.
5. Gjenta trinn 4,3-4,4 for de resterende tre ledninger.
   Merk: De to første ledningene vil ta EMG responser mens de andre to vil tjene til å levere et sjokk for dyret.
6. Som den siste (femte) ledning vil tjene som en jordledning, skåret ca. 5 cm av ubelagt rustfritt stål wire (0,005 i. Diameter), og loddetinn til den gjenværende pin.
7. Sikre kontinuitet mellom trådene og pinnene med et multimeter. (I tilfelle av jordledningen, som er ubelagt, kan multimeter sonde kan plasseres hvor som helst langs tråden.)

5. Kirurgisk Forberedelse (figur 2F)

1. Steriliser alle kirurgiske verktøy, inkludert headpiece. Steriliser stillingen ved å dyppe den i alkohol og deretter skylle med sterilt saltvann.
2. Bedøve musen i en induksjons kammer med 3-4% vaporized isofluran blandet med en strømningshastighet på 1-2 liter oksygen pr minutt.
3. Konstatere at dyret er fullt bedøvet med en tå klype. Musen er fullt bedøvet når den ikke reagerer refleksivt til tå klype.
4. Når dyret er fullt bedøvet, injisere en dose av buprenorfin hydroklorid som et analgetikum (0,05 til 2 mg / kg, sc), barbere toppen av dyrets hode, legg det på en overbygd oppvarming pad på bunnen av stereotaxic ramme konstatere at dyret er fullt bedøvet, og fest hodet til rammen. Opprettholde strømmen av fordampet isofluran til dyret, bytte til 2% ved en strømningshastighet på 1-2 liter oksygen pr minutt. Påfør en liten mengde oftalmisk salve til hornhinner.
5. Desinfiser hodebunnen med povidon-jod og alkohol tre ganger hver, alternerende mellom de to.
6. Med et antall 10 eller 15 skalpellblad, gjør et snitt langs midtlinjen av hodebunnen, eksponere skallen fra forsiden av than øynene for forbi interparietal bein (~ 1,5-2 cm).
7. Hold tilbake klaffene i huden med mikro klipp. Plasser en klippet over øyet, en langs midten av rostrokaudale akse, og en på baksiden av hodeskallen bilateralt (det vil si bruker seks klemmene i det hele tatt). For å hindre at hodestykket avulsion, utsettes så mye av skallen som mulig, inkludert sidene og baksiden. Dette vil øke overflatearealet for påføring av klebemidlet semente sement.
8. Ved hjelp av skalpell, skrape langs toppen av skallen for å fjerne periosteum og sikre en ren og tørr arbeidsflate. Rens toppen av skallen med 3% -ig hydrogenperoksyd tre ganger.
9. Bor to hull i skallen med en størrelse 34 omvendt kjegle Burr eller en 1,6 mm gravering cutter bor til å akseptere 00-90 skruer (0,0625 i. Lang). Skruene vil gi den elektriske jordforbindelse. Plasser en hull foran Bregma, og den andre foran Lambda, til venstre for midtlinjen når kondisjonering av høt øyet. Plasser en skrue i hvert hull. Senk skruen 0,28 mm inn i skallen for hver full sving; to fulle omdreininger er tilstrekkelig.
10. Skape flere små tribuner på omtrent 0,75 mm i diameter på skallen for å øke overflatearealet og gripestyrke for sementen.
11. Ta den ferdige headpiece og vind jordledningen i en åttetallsform rundt de to skruene. Tillat litt slakk (~ 1,5 cm mellom headpiece og skruen) i jordledningen slik at headpiece kan plasseres riktig senere.
    Merk: åttetall vanligvis sikrer en god elektrisk forbindelse mellom ledningen og bakken skruene. Ledningen kan også bli loddet til skruen for å sikre en elektrisk tilkobling.
12. Påfør lim semente sement. Følg produsentens instruksjoner for å blande limet semente sement eller bland 4 kuler av L-Powder mix, 8 dråper basen og 2 dråper av katalysator i en kald keramisk blanding tallerken (sikre at temperaturen stripen on blande fatet er helt svart). Den kalde temperaturen forlenger arbeidstiden til sementen.
    1. Coat skallen og skruene liberally med semente sement og la sementen tørke. Dette tar bare noen få minutter.
13. Etter at sementen har tørket, plasser headpiece vertikalt, med pinnene står opp, over skallen. Hold hodestykket på plass med en holder i likhet med kontakten
    Merk: Se "3. Montering av Connector" -Den holder behøver bare å være en fem-hull stripe med gullbelagte kontaktene for å få pluggene til hovedstillingen. Holderen er festet til en arm på stereotaxic rammen. Bruken av holderen og armen letter posisjoneringen av hodestykket og ledningene.
14. Etter at hovedstillingen er plassert, skrelle tilbake huden rundt omkring øyet området og plasser de to sjokk ledninger slik at de 0,2 cm strippet slutt å hvile under huden og ca 2-4 mm direkte kaudalt for eye. Ikke la endene av de to ledninger for å berøre hverandre. Plasser de to EMG ledninger på muskularis orbicularis oculi ovenfor øyehulen.
    1. Om nødvendig, kutt av endene av ledningene hvis de er for lange og ser ut som om de kan direkte lage riper i bane og føre til infeksjon. Hvis kutte av endene av wire, sikre at det er nok bare wire utsatt. Alternativt, hvis ledningene synes altfor lenge, bøye ledningen tilbake på basen, der de strekker seg ut av hovedstillingen.
    2. Sement bunnen av trådene (dvs. den ende nær hodestykket) på plass på skallen med en liten spredning av klebemidlet semente sement og la den tørke (bruk halvdel av delen som er beskrevet tidligere).
15. Fjern mikro klipp og forsiktig fold klaffene i huden tilbake over sement. La huden for å avgjøre naturlig å hindre spenning på en hvilken som helst del av huden for å unngå forvrengning av øyelokket, hindring av eyeblink respons,og nød til dyret.
16. Tett eksponert område med dental sement, som dekker alt fra radert huden til kanten av toppen av hodestykket med sement. Vær ekstra nøye med å unngå drypping sement på øynene eller pinnene i hovedstillingen. Delvis herdet sement kan glattes og manipulert med en bomullspinne som er fuktet med dental sement løsemiddel. La sement tørke helt før du fjerner headpiece holderen.
17. La dyret å gjenopprette fra anestesi på en oppvarmet flate før du setter dyret tilbake i buret sitt. Administrer Metacam (1 mg / kg, SQ) og deretter plassere dyret tilbake i buret sitt.
18. La dyret 5-7 dagers restitusjon før testing eller trening. Opprettholde standard postoperativ behandling for dyret i henhold til institusjonens retningslinjer. Dyret bør sjekkes minst en gang per dag etter at den har kommet seg fra kirurgi. Se etter tegn på dårlig mat og / eller drikke og sløv atferd. Hvis smerteneer mistenkt, tilveie Metacam hver 24 time (samme dose som ved slutten av post-kirurgi) inntil lindres. Lidokain kan lokalt brukes på sår hvis dyret er skrape eller viser tegn til ubehag.

6. plassere musen på sylinderen og opplæring (figur 2G)

1. Å plassere musen mot sylinderen, holde musen med en hånd kort ved å holde den i halen med en hånd og deretter ta tak i musen bak skuldrene med pekefinger og tommel med den andre. Pakk de resterende fingre rundt musens magen og overkroppen.
2. Med hånden ikke bremset musen, koble kontakten til hodestykket på musen hode og skru låseskruen.
3. Plasser musen forsiktig på sylinder og holde den på plass mens du fester kontakten til rammen. Bruk de to skruene for å feste kontakten til barer over sylinderen.
4. Når kontakten er blitt festet til sylinderrammen, release hold på musen. Gi musa en dag av to økter av tilvenning til sylinderen. La hver tilvenning sesjon samme varighet som hver conditioning økt.
   1. Post blink spontan hastighet i løpet av tilvenning og pre-utsette musene til whisker vibrasjon CS for å minimere forekomsten av skremme responser. Påfør CS som under en faktisk condition sesjon, men uten elektrisk sjokk USA.
   2. Påfør whisker stimulering CS ved å plassere Piezo system tett (ca 0,5 cm) til den betingede side (høyre side) av musen, mens slipping tennene på kammen enn individuelle værhår. Sørg for at de samme værhår blir stimulert dag til dag ved å plassere Piezo system i samme stilling fra dag til dag.
5. Begynn å trene musen på klassisk betinging. Lever to økter med trening per dag i fem dager. La ca to timer mellom hver treningsøkt.
   1. Til den betingede gruppen, deliver tretti studier per sesjon av en 250 msek lang whisker vibrasjon CS (60 Hz) sammen med en 100 msek lang elektrisk puls USA (0,3 mA - 3 mA, levert fra en WPI A385R stimulans isolator). Skill CS og USA med en 250 msek lang stimulus-fri spor intervall for å gjøre oppgaven avhengig av hippocampus (figur 1) ^23.
   2. Justere intensiteten av den elektriske støt for hvert dyr, slik at en blinking er fremkalt. Separate studier med en tilfeldig intertrial intervall på 30-60 sek (gjennomsnitt på 45 sek, total varighet på 30 minutter per økt.)
   3. Lever tretti uparet CS alene og oss alene forsøk hver (for totalt seksti forsøk) til pseudoconditioned gruppe, med de samme tiltaks parametre som angitt for den betingede gruppen. Kontroller at CS alene og oss alene forsøkene er pseudorandomized slik at ingen stimulus presenteres mer enn to ganger på rad. Separer hvert forsøk med en gjennomsnittlig intertrial intervall på 22,5 sek.
6. delever bakgrunnsstøy på 65 dB gjennom tilvenning og trening for å maskere støy av vibrasjonen som genereres av whisker stimulator.

Representative Results

8-10 ukers gamle mannlige C57BL6 / J-mus ble trent på spor eyeblink condition på hodet fast sylindrisk tredemølle apparat. 8 mus ble trent med sammenkoblede CS-amerikanske presentasjoner (aircondition-gruppen) og 9 mus ble trent med uparede CS og amerikanske presentasjoner (pseudoconditioned gruppe).

Eksempel EMG opptak av en betinget respons fra et kondisjonert mus er vist i figurene 3 og 4. EMG-opptak for hvert forsøk ble utbedret og integrert med en 10 ms tidskonstant. Figur 5 viser likerettet og integrert EMG-respons traser fordelt over alle forsøkene for hver av 10 sesjoner for både et kondisjonert (A) og en pseudoconditioned (B) mus. Utviklingen av betingede reaksjoner kan sees i figur 5A, med responser blir større nærmere utbruddet av USA. Denne utviklingen er ikke sett in pseudoconditioned responser i figur 5B.

Utviklingen av godt timet, og dermed godt lært betingede reaksjoner kan også sees på figur 6. Figur 6 viser histogrammer av den tid til toppen av responsen følgende CS utbruddet. Det er en første topp i grafen mellom 0 - 150 ms etter CS utbruddet. Denne første topp kan sees så tidlig som i økt 1. Med flere kurs, foregår det en utvikling av en andre topp i diagrammet mellom 400-500 msek blant de behandlede dyr, noe som indikerer utvikling av bedre timede betingede reaksjoner.

Figur 7A viser gjennomsnitts prosent adaptive betinget respons er tatt opp fra betingede og pseudoconditioned mus. Adaptive conditioned svar er vurdert å ha sterk aktivitet som er til stede i minst 20 msek befmalm amerikanske debut (dvs. minst 4 SD større enn den gjennomsnittlige aktiviteten nåværende 250 ms før CS utbruddet). I løpet av de treningene, klimaanlegg mus viste gradvis læring av condition paradigmet ved å vise mer betingede tilpasninger med hver treningsøkt, slik at betinget mus viste signifikant flere adaptive betinget svar enn pseudoconditioned mus (grupper, F _(1,15) = 20,62, p <.0005, økter, F _(1,9) = 9,987, p <0,0001, grupper * økter, F _(1,9) = 5,977, p <0,0001). Merk at pseudoconditioned gruppen vanligvis utstilt pseudo CR på mindre enn 20% av forsøkene.

Figur 7B viser gjennomsnitt betinget reaksjon området (området under kurven for den likerettede og integrert EMG respons) for både klimaanlegg og pseudoconditioned mus i løpet av de ti treningsøktene. Planlagte sammenligninger med gjentatt tiltak ANOVA over last fire sesjoner (dvs. sesjoner 7-10, når den kondisjonerte gruppen hadde nådd en lærings kriterium på 60% CR) viser en signifikant hovedeffekt av gruppen, noe som indikerer at CR området var større i den kondisjonerte gruppen enn i pseudoconditioned gruppe post læring Kriterium (grupper, F _(1,14) = 5,733, p <0,05; økta, F _(1,3) = 0,486, ns, grupper * økta, F _(1,3) = 0,432, ns).

Figur 7C viser gjennomsnittlig prosent alfa (skremme) responser er tatt opp fra de betingede og pseudoconditioned mus. Alpha svar er aktivitet innenfor 50 ms av CS utbruddet som var minst 4SD over gjennomsnittlig utgangspunkt for aktivitet. I løpet av de treningene, klimaanlegg og pseudoconditioned mus vanligvis utstilt alfa svar på mindre enn 25% av forsøkene, med ingen signifikante forskjeller mellom betinget og pseudoconditioned mus (grupper, F _(1,15) = 2,502, ns). the gjentatte tiltak ANOVA gjorde imidlertid avsløre en betydelig interaksjon mellom grupper og økter på grunn av nedgangen i pseudoconditioned svar og vedlikehold av alfa svar på ca 25% for betinget mus (grupper * økter, F _(1,9) = 2,074, p <0,05). Økningen i alpha svar i løpet av økten 10 er trolig på grunn av den korte utbruddet latency på velutviklet CR.

Figur 7D viser den gjennomsnittlige prosent kort ventetid respons registreres fra begge grupper av mus. Kort ventetid svar reflektert aktivitet mellom 50-70 ms følgende CS utbruddet som var 4SD over gjennomsnittlig utgangspunkt for aktivitet. En gjentatt tiltak ANOVA viste at betingede dyr utstilt flere korte ventetid svar enn pseudoconditioned dyr i løpet av de ti treningsøkter (grupper, F _(1,15) = 5,377, p <0,05; økta, F _(1,9) = 3,920, p <.0005, grupper * økta, F _(1,9) = 3,158, p <0,005). Thans kan gjenspeile en tidligere start tid av CR, som den betingede gruppen utstilt større CR med hver treningsøkt.

Figur 1:. The Trace eyeblink Conditioning Paradigm I spor eyeblink condition, er en ufarlige betinget stimulus (CS) paret med en mildt skadelig ubetinget stimulus (US) ment å indusere en eyeblink respons. CS og USA er atskilt med en stimulus-free temporale gap, slik at paradigmet hippocampus-avhengig ^23. I paradigmet er beskrevet her, er en 250 msek lang whisker vibrasjon CS sammen med en 100 msek lang periorbital sjokkere oss. CS og USA er atskilt med en 250 msek lang tidsmessig gap. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2:. The Head-fast Forberedelse A, Leder-fast oppsett for eyeblink condition med sylinderen, værhår stimulator, og kontakten indikert B, The whisker stimulator med to-lags bøying aktuator og kam indikert.. C, kontakten med de enkelte delene angis: låseskruen, den 7-hull stripe, ledningene loddet til stikkontakter og epoxy å bevare ledningene, vingene konvertert fra en TO-220 stil transistor D, The headpiece med den enkelte. deler indikert: den 7-hull stripe, pinnene, og ledningene loddet inn pinnene, inkludert ubestrøket rustfritt stål jordledning, og den enkelte sjokk og EMG rustfritt stål ledninger, med 0,2 cm av polyamid belegg strippet av enden E. , den konfigurasjon for hvert hull i 7-hull strimmel for både kontakten og denheadpiece. F, En mus med en implantert stillingen. G, A musen er plassert på sylinderen, klar til å bli trent. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3:. Eksempel EMG opptak De blå linjene avgrense CS presentasjon (250 msek lang). De røde linjene avgrense den amerikanske presentasjonen, som viser gjenstand som kommer fra elektrisk støt (100 ms). CS og US er atskilt med en 250 msek stimulus fritt intervall. Innenfor denne stimulans fritt intervall er høyere amplitude EMG aktivitet (i forhold til baseline) som markerer en CR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ A>

Figur 4:. Eksempel EMG og tilsvarende optiske infrarøde refleksjon opptak EMG opptak er like nøyaktig som den optiske infrarøde refleksjon sensor i å oppdage betinget reaksjon debut (blå linje), ventetid til respons topp (rød linje), og ubetingede eyeblink respons debut ( rosa linje). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5:. Gjennomsnittet eyeblink Traces gjennomsnitt utbedret og integrerte spor av eyeblink respons for en betinget mus (A) og en pseudoconditioned mus (B). Hver trase representerer den gjennomsnittligerespons på musen for alle prøvelser i løpet av en enkelt økt. Den blå delen representerer responsen under whisker vibrasjon CS presentasjon. Den røde delen representerer responsen under stimulus-frie spor intervall. I A, sjokket amerikanske indusert en gjenstand som er til stede under den mørke grå området etter spor intervallet. B viser svarene på whisker vibrasjon CS bare. Presentasjon av CS alene og oss alene forsøk ble pseudorandomized i pseudoconditioning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Figur 6: Histogram av Respons Peak Times Histograms av tiden til responsen topp for alle aircondition (n = 8; blå søyler) og 8 pseudoconditioned (røde søyler) dyr for all trIALS i alle økter (data fra en pseudoconditioned mus ble ekskludert for å tillate en direkte sammenligning av antall svar mellom grupper). Lilla barer indikere hvor de betingede og pseudoconditioned dyr lapper. Response rushtiden regnes som tidspunktet for den største toppen av utbedret og integrert EMG opptak mellom CS og amerikanske utbruddet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: responskurver av betinget Dyr (n = 8; blå kurver) og pseudoconditioned dyr (n = 9; røde kurver). A, Prosent Gjennomsnittet Adaptive betingede reaksjoner (± SEM) for betinget og pseudoconditioned dyr over 10 treningsøkter. B, Gjennomsnittet av området (± SEM) av CR for betingetog pseudoconditioned dyr over 10 treningsøkter. C, Percent Gjennomsnittet Alpha Response (± SEM) for betinget og pseudoconditioned dyr over 10 treningsøkter. D, Prosent Gjennomsnittet Kort ventetid Responses (± SEM) for betinget og pseudoconditioned over 10 økter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Classical eyeblink condition er en form for assosiativ læring som er et nyttig verktøy for å forstå nevrale underlag underliggende læring og hukommelse. Tidligere metoder som benyttes for eyeblink kondisjonering på gnagere som mus involvert et kammer som er tillatt for dyret å bevege seg fritt. Et hode-fast preparat for eyeblink kondisjonering på mus, ved bruk av apparatet beskrevet av Chettih et al. Og Heiney et al., Og mest nylig brukt i lys-fremkalt spor eyeblink ring på Siegel et al., Gir flere fordeler, for eksempel at for enkelte prosedyrer og eksperimenter som skal utføres i løpet av eyeblink condition som ikke hadde vært mulig eller hadde vært begrenset i det siste (for eksempel in vivo to-foton kalsium bildebehandling) ^14-16. Denne type preparat letter også bruken av andre teknikker så som in vivo elektro med tetrode matriser. Som mus ser ut til å bli Distressed fra tilbakeholdenhet, var dette hode fast forberedelse utviklet for å holde hodet sikkert og samtidig redusere mengden av tilbakeholdenhet nødvendig. Selv om dette preparatet kan mus til ambulate på en sylindrisk tredemølle, andre har også lykkes samlet atferdsdata fra hodefiksert mus på en stabil plattform ^24.

Det er imidlertid visse problemer som oppstår ved bruk av hode-faste sylinder system. En bekymring er at når man først setter en utrent mus på sylinderen, kan det trenger litt tid til å lære å ro, gå, eller kjøre på det nye apparat. De fleste mus lære raskt til ro, gå, eller kjøre på sylinderen komfortabelt. To tilvenning økter bidra til å venne musene til sylinderen og ved midten av den andre økten, de fleste mus er komfortable på sylinderen. En annen bekymring som oppstår er hovedstillingen avulsion. Det har vært noe problem med dette i det siste løpet med flere dagers trening, men bruk av limet Luting cement har bedres problemer med headpiece avulsion. Bruken av klebesemente sementen har resultert i 0% headpiece avulsions fra mer enn 50 operasjoner siden ved hjelp av denne teknikken. Med riktig bruk og tilstrekkelig spredning av sement på kraniet, bør forskere støter ingen problem med hovedstillingen avulsion. Til slutt, ved å presentere CS under tilvenning økter, kan det være noen bekymring latent hemning. Det er imidlertid klart, at musene ble kondisjonert med hell (se figur 7). Legg merke til at intensiteten av whisker vibrasjon kan modifiseres ved å endre mengden av spenning som blir passert av reostaten. Hvis mus er ute av stand til å lære, kan spenningen økes for å støtte vellykket kondisjone samtidig minimere skremme responser. Forskere kan også endre typen elektrisk støt USA som er levert til dyret. Den elektriske støt USA kan være en enkelt elektrisk puls som varer 100 ms som rapporteres her. Alternativt, som the stimulans isolator benyttes i denne protokollen er i stand til å overføre bifasisk pulser, kan forskerne også ansette 120 Hz 6 bifasisk puls par på 1 ms per puls for en effektiv elektrisk støt USA også.

Boele et al. Indikerte sannsynligheten for at visse "betinget svar" kan oppstå fra skremme (alfa) reaksjoner på CS eller kort ventetid svar (SLR) ^25. Alpha svar er ansett for å være raske øyelokk nedleggelser innen en 50 ms latency etter CS utbruddet. Mus ofte holde øynene lukket for varigheten av rettssaken, etter denne alpha respons. Speilreflekskameraer, derimot, har en ventetid på 50-70 ms fra CS utbruddet og vanligvis oppstår etter bare et par CS-amerikanske motstandere. Den korte ventetid til utbruddet av både alfa og speilreflekskameraer, og det faktum at speilreflekskameraer kan oppstå etter bare et par CS-amerikanske motstandere tyder på at de sannsynligvis ikke drevet av hippocampus-cerebellar kretser. Disse observasjonene anmeldt av Boele et al. Therefore beg spørsmålet om CRS registrert her er lært svar. Som figur 7C og 7D show, verken alfa svar eller speilreflekskameraer står for et flertall av CRS registrert, noe som tyder på at de adaptive CR formidles av brain og lillehjernen. Histogrammene i figur 6 som viser ventetid til toppen av eyeblink responsen etter CS utbruddet viser også at mens enkelte studier kan omfatte en tidlig debut alfa eller kort ventetid respons, med flere treningsforsøk, toppen av eyeblink responsen faktisk skjer senere og nærmere utbruddet av den amerikanske, noe som indikerer utvikling av godt timet betingede responser. Som nevnt tidligere, ble whisker stimulering og sjokk intensitet dempes til et nivå som ikke var oppsiktsvekkende eller altfor motvilje, men forble effektive i å produsere tilpass conditioned svar. Til slutt, som figur 7B viser, størrelsen av CR (målt som arealet underkurve i utbedret og integrert respons, som i figur 5) er større i den betingede gruppen enn i pseudoconditioned gruppen når den betingede gruppen nådde en lærings kriterium på 60%, som betyr at disse svarene krever flere økter for å lære, i motsetning til speilreflekskameraer og alfa responser.

Boele et al. Påpekte også at EMG målingene, mens en nøyaktig metode for å blinke gjenkjenning i større dyr som kaniner, er ikke like praktisk i små gnagere som mus ^25. De anbefaler bruk av den magnetiske avstandsmålingsteknikk (MDMT) for å unngå påvisning av falske positive signaler som EMG registrering kan tyde på. Den MDMT teknikk, mens imponerende i sin følsomhet og kvaliteten på blinke gjenkjenning, presenterer også den ulempen av å måtte bedøve dyret hver dag med trening for å feste brikken ^26. Dette i seg selv kan forvirre læring priser. Vi finner at EMG-signalerføres til de prosedyrer som er beskrevet her, kan lett oppnås med høy tidsoppløsning, pålitelig og forholdsvis lett å måle og analysere.

Figur 4 viser en representativ EMG signal å detektere blinker med et tilsvarende signal fra en infrarød reflekterende optisk sensor plassert nær musens øyet under trening. Det er en klar sammenheng i blinke gjenkjenning mellom EMG-signalet og den optiske sensoren, betegner nøyaktigheten av blinke gjenkjenning ved bruk av EMG-innspillinger. En fordel med EMG-opptakene er at det gjør det mulig for den største tidsmessig oppløsning. Selv om oppløsningen er degradert ved å integrere over en 10 ms tidskonstant, kan man også analysere de rå EMG dataene for å detektere øye blink aktivitet. Spike teller er en parameter som kan brukes til å oppdage CR ^18. En ulempe med EMG opptak er at signalene vil utvilsomt bli forurenset av det elektriske gjenstanden kommer fra elektrisk støt USA (se reaksjoner, dvs. de som oppstår før utbruddet av den amerikanske. En annen ulempe ved å bruke EMG opptak er at med dagens kriterium for CR deteksjon, kan en støyende baseline skjule hva ellers er blitt gjenkjent som en CR.

Hodet-fikserte preparat som beskrives her er lik den som er presentert av Heiney et al. ¹⁵ Det er imidlertid visse bemerkelsesverdige forskjeller fra deres elegant system. For eksempel, metoden beskrevet her for opptak av eyeblink responser er trådene som er lagt inn subdermalt over øyet å registrere EMG-aktivitet. Denne teknikken gjør det mulig for pålitelige og stabile opptak av øyelokk aktivitet og dermed av eyeblink respons. Riktig plassering og fiksering av disse ledningene sikrer kvalitet opptak som varer i minst to uker, varigheten av forsøket. En fordel ved å bruke EMG tråder i stedet for en høy-speed kamera som brukes av Heiney et al., er at EMG-opptak har ekstremt høy tidsoppløsning, og krever ikke at den daglige posisjonering og kalibrering som et kamera krever ^15. Kameraet gjør imidlertid tilby direkte visuell bestemmelse av øyelokket nedleggelse.

En annen forskjell mellom de to systemene er metoden for CS levering. Dette bestemte hodet fast mus forberedelse benytter whisker stimulering som betinget stimulus. Resultatene viser at mus kan være betinget effektivt med whisker stimulering som CS, like oppsikts fast kaniner kan være betinget med værhår vibrasjon ^27. Heiney et al., Demonstrerte stimulering av whisker puten som en effektiv CS ved å rette en svakt drag av luft til puten ¹⁵ whisker. Selv om begge teknikkene vise en effektiv kondisjonering, å plassere en kam i utvalgte whiskers og vibrering av kammen gjør det mulig for evnen til å stimulere individuell whisker rader eller enkelt værhår. Denne teknikken har blitt brukt i tidligere studier for å gi rom for dyr å tjene som sin egen kontroll (dvs., ble stimulert whisker rad i forhold til en rad av ustimulerte whiskers) ^20.

Oppsummert en head-fast forberedelse for whisker-signalisert eyeblink conditioning åpner for en sikret kranie plattform for å utføre avanserte teknikker og eksperimentering som hadde vært tidligere umulig eller vanskelig å utføre. Mild whisker stimulering ble anvendt som betinget stimulus og et mildt elektrisk sjokk ble anvendt som ubetinget stimulus. Eyeblink svarene ble registrert med ledninger er lagt subdermalt bak øyelokket. Pålitelig læring ble demonstrert i mus med direkte stimulering av utvalgte værhår som CS og periorbital elektrisk støt som USA, og ingen læring var tydelig i mus som ble gitt tilfeldige presentasjoner av CS og USA. EMG opptak gitt en pålitelig og relatively enkel metode for opptak eyeblink svar og observere hvordan svarene endres over treningsøktene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6"	Amazon	B002ONUM0E	For cylinder
Plexiglas			Custom-made; 1 cm thick
Metal Rods (12.7 mm diameter)			Custom-made
4-40 machine screw (.25 in. long)	Amazon Supply	B00F33Q8QO	For cylinder
Classic Design Hair Comb	Conair	93505WG-320	For whisker stimulation
2-Layer Rectangular Bending Actuator	Piezo Systems	T220-A4-303X	For whisker stimulation
Solder and Flux Kit	Piezo Systems	MSF-003-NI	For whisker stimulation
Magnetic Base	Thor Labs	MB175	For whisker stimulation
Threaded rod for magnetic base			Custom-made
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp.			Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008
TO-220 Style Transistor	Amazon Supply	B0002ZPZYO	For connector; for the wings
Relia-Tac Sockets	Electronic Connector Corp.	220-S02	For connector
Relia-Tac Pins	Electronic Connector Corp.	220-P02	For headpiece
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long)	Amazon Supply	B000FN68EE	Locking Screw
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick)	Amazon Supply	B000N2TK7Y	Locking Screw Head
Loctite Super Glue-Liquid	Loctite	1365896	Cyanoacrylic glue; for the locking screw
Quick Setting Epoxy	Ace Hardware	18613	For connector and whisker stimulation system
Ethernet Cable Wires			Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter)	PlasticsOne	005sw/2.0 37365 S-S	For headpiece, EMG and shock wires
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter)	AM Systems	792800	For headpiece, ground wires
Tenma Variable Autotransformer	Tenma	72-110	For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator
Amplifier	A-M Systems	1700	Amplifier for filtering and amplifying EMG signals
WPI A385R stimulus isolator	World Precision Instruments	31405	For the electrical shock
Isothesia (Isoflurane)	Henry Schein: Animal Health	50031	For surgery; anesthesia
Buprenex Injectable CIII	Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc	NDC 12496-0757-1	For surgery; analgesic
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	NDC 17478-062-35	Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia
Povidine-Iodine Prep Pads	PDI	NDC 10819-3883-1	For surgery; antiseptic
Alcohol Prep Pads			May be purchased from any standard pharmacy
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3)	Integra Miltex	4-7.	For surgery
Stainless steel surgical scalpel blades	Integra Miltex	4-310 or 4-315	For surgery; number 10 or 15 scalpel blade
3% Hydrogen Peroxide			May be purchased from any standard pharmacy
Micro Clip	Roboz	RS-5459	For surgery, to hold back skin
00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long)	Amazon Supply	B002SG89X4	For surgery, to wrap ground wire around
Professional Rotary Tool	Walnut Hollow	29637	Hand drill for surgery, to drill holes in skull
Inverted Cone Burr	Roboz	RS-6282C-34	Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull
Engraving Cutter Drill Bit	Dremel	106	Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base	Parkell	S398	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder	Parkell	S399	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml	Parkell	S371	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip	Parkell	S387	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
Swiss Tweezers, style #5	World Precision Instruments	504506	For surgery
Puritan Cotton-Tipped Applicators	VWR International	10806-005	For surgery
Dental Caulk Grip Cement Kit	Dentsply	675570	For surgery; dental cement