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Developmental Biology

स्टेप-विशिष्ट माउस spermatids की छंटनी फ्लो द्वारा

Published: December 31, 2015 doi: 10.3791/53379
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke, 2Department of Medicine, Université de Sherbrooke
* These authors contributed equally

Abstract

माउस spermatids के भेदभाव एक अक्षुण्ण जीनोम के साथ एक कार्यात्मक नर युग्मक के उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया अगली पीढ़ी के लिए प्रेषित किया जा रहा है। अब तक, इस रूपात्मक संक्रमण की आणविक पढ़ाई के बाद के विश्लेषण के लिए spermatid भेदभाव के इन महत्वपूर्ण कदम के पर्याप्त जुदाई अनुमति के लिए एक विधि की कमी आड़े आती कर दिया गया है। फ्लो का उपयोग कर इन कोशिकाओं के समुचित gating पर पहले प्रयास क्योंकि क्रोमेटिन पुनर्गठन के दौर से गुजर spermatids में डीएनए प्रतिदीप्ति में एक अजीब वृद्धि की वजह से मुश्किल हो सकता है। इस अवलोकन के आधार पर हम इथेनॉल के साथ तय माउस spermatids के चार आबादी की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य शुद्धि की इजाजत दी, योजना cytometry के एक सरल प्रवाह का ब्यौरा उपलब्ध कराने, प्रत्येक परमाणु remodeling प्रक्रिया में एक अलग राज्य का प्रतिनिधित्व। जनसंख्या संवर्धन कदम-विशिष्ट मार्करों और रूपात्मक criterions का उपयोग कर पुष्टि की है। शुद्ध spermatids जीनोमिक और proteom के लिए इस्तेमाल किया जा सकताआईसी विश्लेषण करती है।

Protocol

जानवरों की देखभाल विश्वविद्यालयों डे शरब्रूक जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार था।

1. ट्यूब तैयारी

  1. सेल छँटाई से पहले दिन, 5 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूबों के लिए गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 1-2 मिलीलीटर जोड़ने, और 15 मिलीग्राम और 50 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूबों के लिए।
    महत्वपूर्ण कदम: प्रोटोकॉल में इस्तेमाल हर ट्यूब लेपित है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: एफबीएस कोटिंग ट्यूब दीवारों पर चिपके हुए से रोगाणु कोशिकाओं को रोकता है।
  2. धीरे धीरे नलियों समान रूप से एक रोटेटर का उपयोग कर कोट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उलटा द्वारा हे / एन मिश्रण।
  3. अगले दिन, decanting से लेपित ट्यूब से एफबीएस हटा दें।
    1. * महत्वपूर्ण कदम: 5 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब और सेल तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है 15 और 50 मिलीलीटर ट्यूब (प्रोटोकॉल 2.1-2.11 कदम) पूरी तरह से फैनिंग (पक्ष धाराओं के यानी, imprecise विचलन) को रोकने के लिए FBS की खाली कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। एफबीएस दूर करने के लिए एक P200 pipet का प्रयोग करें।
    2. दौर 5 मिलीलीटर polypropylene शुद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया नीचे ट्यूबों में एफबीएस (लगभग 100-200 μl) के एक छोटे से अवशिष्ट मात्रा छोड़ दें।

2. सेल तैयार

  1. हे सीओ 2 asphyxiation द्वारा पीछा 2 / isoflurane (तब 2% पर बनाए रखा 5% पर प्रेरण) का उपयोग संज्ञाहरण के तहत एक पुरुष माउस बलिदान।
  2. आबकारी एवं decapsulate दोनों वृषण और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में बफर छँटाई के 500 μl में छोटी कैंची से कीमा।
  3. एक अक्षुण्ण 100-1,000 μl टिप के साथ तो वीर्योत्पादक पहले एक छोटा 100-1,000 μl टिप के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोमल ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नलिकाओं, और से फ्लश जनन कोशिकाओं।
  4. एक 40 माइक्रोन सेल झरनी का उपयोग कर एक निस्पंदन कदम से मलबे और झुरमुटों निकालें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पिछला में छानना इकट्ठाiously चरण 1 में FBS के साथ लेपित।
  5. पहले चरण 1 में लिपटे 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कुल 3 मिलीग्राम की मात्रा और हस्तांतरण छानना अप करने के लिए बफर छँटाई के साथ एक बार फिल्टर धो लें।
  6. 0.8 मिमी EDTA के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में 50 मिमी EDTA सेल निलंबन की मिली लीटर प्रति पीएच 8 (3 मिलीग्राम के लिए 48 μl) के 16 μl जोड़ें।
  7. रोगाणु कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, धीरे धीरे एक दूधिया निलंबन का उत्पादन होगा, जो कोमल आंदोलन के साथ एक 10 मिलीलीटर pipet (कम गति पर भंवर) का उपयोग कर ठंडा 100% इथेनॉल के 3 खंडों को जोड़ने।
    महत्वपूर्ण कदम: धीरे धीरे इथेनॉल जोड़ने सेल तैयारी की अखंडता की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है और महत्वपूर्ण है। हम इथेनॉल का तेजी अलावा दक्षता छँटाई का एक प्रमुख कमी के परिणामस्वरूप सेल का कारण बनता है कि उल्लेख किया। एक 3 मिलीलीटर सेल निलंबन के लिए, इथेनॉल के 9 मिलीलीटर लगभग 1 मिनट में जोड़ा जाना चाहिए।
  8. उलटा द्वारा कभी कभी मिश्रण के साथ 15 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  9. अपकेंद्रित्र सेल 5 मिनट के लिए 800 XG पर निलंबन और स्पष्ट हटानेसतह पर तैरनेवाला।
  10. धीरे बफर छँटाई के 2 मिलीलीटर में तय जनन कोशिकाओं resuspend।
  11. SYTO16 डीएनए डाई (DMSO में 1 मिमी समाधान) के 4 μl जोड़ें और (प्रकाश से सुरक्षित) में कम से कम 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: बेस्ट छँटाई परिणाम यह आसानी से spermatids की अत्यधिक जमा नाभिक में शामिल किया जाता है कि एक पारगम्य डीएनए डाई है के बाद से SYTO16 का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं।

3. सेल सॉर्टर सेट अप

नोट: यहाँ, एक 4-लेजर (405 एनएम - बैंगनी, 488 एनएम - नीले, 561 एनएम - पीले, हरे, 633 एनएम - लाल) 20 पैरामीटर BDFACSAria तृतीय सेल सॉर्टर प्रयोग किया जाता है। बी.डी. FACSDiva 6.1.3 सॉफ्टवेयर डेटा कल्पना और विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सेटिंग्स का उपयोग किया सॉर्टर के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकती है।

  1. Fluidics शटडाउन प्रक्रिया (सॉफ्टवेयर में "कोशिकामापी" मेनू) छँटाई करने के लिए पूर्व दौरान म्यान तरल पदार्थ के रूप में 70% इथेनॉल चलाकर FACS सॉर्टर जीवाणुरहित। सॉफ्टवेयर की टूलबार में "कोशिकामापी" का चयन करें और "Fluidic श चुनें। "utdown प्रक्रियाओं द्वारा वर्णित चरणों का पालन करें।
  2. तैयार है और किसी भी क्रिस्टल और दूषित पदार्थों को समाप्त करने के लिए इतनी के रूप में 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ 1x पीबीएस फिल्टर। टैंक के अंदर पर ऊपरी वेल्ड लाइन के लिए म्यान टैंक भरें।
  3. सॉफ्टवेयर शुरू और लॉग इन करें। से पहले छँटाई करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए लेज़रों गर्म करने के लिए FACS सॉर्टर शुरू करो। Fluidics इथेनॉल से बाहर निकलवाने के लिए दो fluidic स्टार्टअप प्रक्रियाओं को चलाने के। सॉफ्टवेयर की टूलबार में "कोशिकामापी" का चयन करें और "Fluidic स्टार्टअप" चुनें। प्रक्रियाओं द्वारा वर्णित चरणों का पालन करें।
    नोट: यह सामान्य म्यान तरल पदार्थ (1x पीबीएस) के साथ fluidics पुनर्स्थापित करता है।
  4. छँटाई ब्लॉक और आसुत जल से नीचे को झुकाव प्लेट साफ और उन्हें अच्छी तरह से सूखे। एक sonication स्नान में 2 मिनट के लिए आसुत पानी की एक ट्यूब में रखा एक 100 माइक्रोन नोक Sonicate। अच्छी तरह से नोक साफ कर लें।
  5. प्रवाह सेल में 100 माइक्रोन नोक डालें और 12 से नोक-लॉक लीवर दक्षिणावर्त बारीघंटा स्थिति। 20 साई को म्यान दबाव सेट करें।
  6. धारा पर मुड़ें और (30) के आसपास आवृत्ति के लिए लक्ष्य मूल्यों को प्राप्त करने के लिए आयाम को समायोजित, 1 (150) के आसपास ड्रॉप और (12) के आसपास गैप और एक स्थिर छोटी बूंद breakoff पैटर्न (कुछ उपग्रह बूँदें) स्थापित करने के लिए। क्षीणन बंद कर दें।
  7. धारा सीधे है और तरह ब्लॉक के कोण बदलते द्वारा कचरे खींचने की मशीन का केंद्र हिट कि सुनिश्चित करें। नोट: 10 साई पर एक 130 माइक्रोन नोक भी परीक्षण किया गया था और कोई स्पष्ट अंतर पाया गया था।
  8. पीले, हरे लेज़रों के लिए, नीले रंग बैंगनी के लिए लाल रंग के लिए -77.39, 37.33 और -39.85 के लिए 0 पर सेट लेजर देरी।
  9. पीले, हरे लेज़रों के लिए, नीले रंग बैंगनी के लिए लाल रंग के लिए 1.0, 0.75 और 0.96 के लिए 1.14 के लिए स्केलिंग सेट क्षेत्रों में।
  10. (सॉफ्टवेयर के 'साइड स्ट्रीम "विंडो में) एक टेस्ट प्रकार का उपयोग कर, उस तरफ धाराओं को हवा देने नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें। वे Middl मारा तो यह है कि "साइड स्ट्रीम" विंडो में, प्रत्येक पक्ष धारा की वोल्टेज स्लाइडर्स समायोजितपरीक्षण संग्रह ट्यूब के ई। केंद्र धारा तंग नहीं है, तो केंद्र धारा विवश करने के लिए 2 एन डी, 3, और 4 वें बूंद सेटिंग्स समायोजित करें।
  11. सॉफ्टवेयर ("कोशिकामापी" मेनू) में कोशिकामापी सेटअप और ट्रैकिंग (सीएस एंड टी) आवेदन शुरू करो।
  12. निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर कोशिकामापी प्रदर्शन के लक्षण वर्णन और ट्रैकिंग स्वचालित करने के लिए 350 μl प्रति 1 ड्रॉप में कोशिकामापी सेटअप और ट्रैकिंग मोती का प्रयोग करें।
  13. सीएस एंड टी आवेदन से बाहर निकलें। सीएस एंड टी सेटिंग लागू, धारा मापदंडों को अभी भी एक स्थिर छोटी बूंद breakoff पैटर्न अनुमति देते हैं सुनिश्चित करें, और ("Breakoff खिड़की" में) निर्माता के निर्देशों के रूप में वर्णित स्वीट स्पॉट बटन पर बारी।
  14. फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग कर ड्रॉप देरी मूल्य का अनुकूलन (सामग्री की तालिका देखें)।
    1. धारक में संग्रह ट्यूबों को स्थापित करें। क्रमबद्ध ब्लॉक दरवाजा खोलो। "साइड स्ट्रीम" विंडो में, "फिर चुनें वोल्टेज पर बारीटेस्ट तरह "और दराज खुला और संग्रह ट्यूबों के लिए उपयोग करने Aspirator दराज बटन पर क्लिक करें।
    2. वे ट्यूब के केंद्र में जाने की इतनी पक्ष धाराओं का अनुकूलन। जरूरत के रूप में मूल्यों और स्लाइडर्स समायोजित करें।
    3. क्रमबद्ध ब्लॉक दरवाजा बंद करने और केंद्र में प्रतिभाशाली मनका स्थान प्राप्त करने के लिए माइक्रोमीटर डायल समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें। चयन रद्द अपशिष्ट दराज, परीक्षण तरह और वोल्टेज। संग्रह ट्यूबों निकालें।
    4. 'निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार बूंद देरी का अनुकूलन।
      1. संक्षेप में, मनका शीशी सख्ती से हिला और पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर में मोतियों की एक बूंद पतला।
      2. 'निर्माताओं के निर्देशों का उपयोग करना, सॉफ्टवेयर में उपलब्ध ड्रॉप देरी प्रयोग टेम्पलेट का उपयोग कर ड्रॉप विलंब सेट करें। वैकल्पिक रूप से, ड्रॉप देरी सेट करने के लिए ऑटो ड्रॉप देरी सुविधा का उपयोग करें।
      3. फ्लोरोसेंट मोतियों की ट्यूब लोड और दहलीज दर है जब तक ~ 3,000 से 4,000 घटनाओं / दूसरे प्रवाह दर को समायोजित। क्रमबद्ध परिशुद्धता सेट करने के लिए "प्रारंभिक" और अंतिमLy "क्रमबद्ध लेआउट" विंडो में "ठीक धुन करने के लिए"। ऑप्टिकल फिल्टर का चयन करें और मोती तरह। 100% छोड़ दिया करने के लिए हल कर रहे हैं ~ जब तक ड्रॉप देरी समायोजित।
        नोट: यह कदम यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एक पक्ष धारा में ब्याज प्रकार की कोशिकाओं। माला और ऑप्टिकल फिल्टर एक 100% छोटी बूंद विचलन के करीब प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
  15. एफएससी डिटेक्टर ब्लॉक के बाएँ छोर पर एक एफएससी 1.5 एन डी (तटस्थ घनत्व) फिल्टर रखें। 2.00 μs के लिए खिड़की एक्सटेंशन और ("कोशिकामापी" विंडो में "लेजर" टैब में) 1.00 से एफएससी क्षेत्र स्केलिंग सेट करें।
  16. नमूना ट्यूब लोड करने से पहले, clumping से बचने के लिए नमूना पंक्ति के अंत में 50 माइक्रोन का एक नमूना फिल्टर लाइन जगह है। ऐसा करने के लिए, "कोशिकामापी" मेनू में "नमूना फिल्टर परिवर्तन" का चयन करें।
  17. पक्ष धारा के बीच हवा देने के बिना अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए और polypropyle के लिए चिपके से कोशिकाओं को रोकने के लिए नमूना तरल पदार्थ की संरचना का परीक्षणNE ट्यूबों।
    1. , नमूना ट्यूब लोड विक्षेपन प्लेटों पर बदल जाते हैं और दराज बंद के साथ "टेस्ट तरह" का चयन करें। जुदाई बहुत ज्यादा फैनिंग के बिना होता है, तो पक्ष धाराओं को देखो।
      नोट: फैनिंग कारण नमूना बफर में एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता की संभावना है।
  18. FACS के साधन में नमूना ट्यूब लोड करें। 300 आरपीएम का एक नमूना आंदोलन और 4 डिग्री सेल्सियस का एक नमूना तापमान का चयन करें। "अधिग्रहण डैशबोर्ड" में "डेटा प्राप्त" का चयन करें।
  19. यदि आवश्यक हो, (3.0 की एक अधिकतम प्रवाह दर पर) / सेकंड 5,000 घटनाओं की एक अधिकतम करने के लिए एक उचित घटना दर हासिल करने के लिए नमूना पतला। हल कोशिकाओं की पवित्रता बनाए रखने के लिए सख्ती से इन सीमाओं का सम्मान करते हैं।
  20. विश्लेषण और कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए, ब्याज की आबादी के साथ हस्तक्षेप किए बिना मलबे को खत्म करने के लिए एफएससी सीमा मूल्य का अनुकूलन। लघुगणकीय पैमाने में, बनाने के क्रम में 530/30 फिल्टर के साथ फोटो गुणक ट्यूब (पीएमटी) डिटेक्टर की वोल्टेज समायोजितयकीन है कि कुल जनसंख्या का प्रतिदीप्ति संकेत के पैमाने में फिट बैठता है, और कहा कि सकारात्मक आबादी पर फाटक (चित्रा 1, 1 गेट)।
  21. एक आगे तितर बितर-क्षेत्र (एफएससी-ए) / ओर तितर बितर-क्षेत्र SYTO16 सकारात्मक जनसंख्या का (एसएससी-ए) साजिश का उत्पादन और चारों ओर 110 वी रैखिक पैमाने में एफएससी-ए समायोजित, और लगभग 150 वी के लिए एसएससी-ए बहुत बड़े कोशिकाओं और सेल समुच्चय को छोड़कर जबकि लघुगणक पैमाने में सभी घटनाओं कल्पना करने के लिए।
  22. "क्रमबद्ध लेआउट" विंडो में, "क्रमबद्ध प्रेसिजन मोड" के सेट "4 तरह पवित्रता" के लिए (यील्ड मुखौटा: 0, पवित्रता मास्क: 32, चरण मास्क: 0)। निरंतर छँटाई के लिए "लक्ष्य घटनाक्रम" मेनू से "निरंतर" का चयन करें।
  23. ("क्रमबद्ध लेआउट" विंडो में) ट्यूबों के लिए इसी क्षेत्र में सॉर्ट करने की आबादी जोड़ें। उच्च बीच में आवृत्तियों और सिरों पर कम आवृत्तियों के साथ उन लोगों के साथ जगह आबादी। छँटाई के दौरान 2,500 वी करने के लिए वोल्टेज प्लेटों सेट नमूना संग्रह टी रखनाबर्फ पर ubes।

4. सेल छँटाई

  1. इसके तत्काल बाद सॉर्ट करने से पहले, गोल नीचे ट्यूब एक पहले से लिपटे 5 मिलीलीटर polypropylene में एक 50 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग फिल्टर कोशिकाओं।
  2. बफर छँटाई के 1-2 मिलीलीटर के साथ बड़े पैमाने पर फिल्टर धो लें।
  3. चित्रा 1 में विस्तृत gating योजना के बाद एक 488 एनएम लेजर सुसज्जित सेल सॉर्टर का उपयोग कर क्रमबद्ध निश्चित जनन कोशिकाओं। पहले बर्फ पर धारा 1 में लिपटे 5 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब में शुद्ध भिन्न लीजिए।
    1. FBS की 100-200 μl ट्यूब दीवार को हल कोशिकाओं की चिपके से बचने के लिए संग्रह ट्यूबों में रखा जाता है कि सुनिश्चित करें।
    2. SYTO16 की एकाग्रता छँटाई अवधि के दौरान प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव से बचने के लिए saturating है कि सुनिश्चित करें। छँटाई ग्राफिक्स के रूप में एलेक्सा स्त्राव 488 पैरामीटर (डीएनए धुंधला) में सेल धुंधला तीव्रता के आगे कोई भिन्नता है जब SYTO16 saturating है। यदि आवश्यक हो, के 1 μl जोड़नेछँटाई ट्यूब को SYTO16 संतृप्ति तक पहुँचने के लिए।
    3. एलेक्सा स्त्राव 488-ए बनाम घटनाओं की संख्या: निम्नलिखित मानकों को प्रदर्शित करने के लिए एक ग्राफिक पर कुल घटनाओं को प्रदर्शित करें।
    4. चित्रा 1 में दिखाया गया है, 1 गेट के साथ सकारात्मक डीएनए धुंधला कक्षों का चयन करें।
      1. मापदंडों के रूप में एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए का उपयोग कर एक ग्राफिक पर फाटक 1 से प्रदर्शित कोशिकाओं
        1. चित्र 1 में दिखाया, गेट 2 के साथ कोशिकाओं का चयन करें।
        2. मापदंडों के रूप में एलेक्सा स्त्राव 488-ए बनाम एफएससी-ए का उपयोग कर एक ग्राफिक पर गेट 2 से प्रदर्शित कोशिकाओं।
        3. चित्र 1 में दिखाया, गेट 2 ग्राफिक पर गेट 5 और गेट 6 के साथ कक्षों का चयन करें।
        4. मापदंडों के रूप में एलेक्सा स्त्राव 488-ए बनाम 488 डब्ल्यू एलेक्सा स्त्राव का उपयोग कर ग्राफिक्स पर अलग से गेट 5 और गेट 6 प्रदर्शित करें।
        5. चुनें spermiogenesis गेट 5 ग्राफिक पर 1-9 spermatids कदम और चित्र 1 में दिखाया spermiogenesis, गेट 6 ग्राफिक्स पर 10-12 spermatids कदम।
      2. प्रदर्शनमापदंडों के रूप में एलेक्सा स्त्राव 488-ए बनाम एफएससी-ए का उपयोग कर एक ग्राफिक पर फाटक 1 से कोशिकाओं
        1. चित्र 1 में दिखाया, गेट 3 और गेट के साथ 4 कक्षों का चयन करें।
        2. मापदंडों के रूप में एलेक्सा स्त्राव 488-ए बनाम 488 डब्ल्यू एलेक्सा स्त्राव का उपयोग कर ग्राफिक्स पर अलग से गेट 3 और गेट 4 प्रदर्शित करें।
        3. चुनें spermiogenesis गेट 3 ग्राफिक पर 13-14 spermatids कदम और चित्र 1 में दिखाया spermiogenesis, गेट 4 ग्राफिक पर 15-16 spermatids कदम।

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Representative Results

Gating रणनीति फ्लो के साथ प्रयोग किया

चित्रा 1 चार अत्यधिक शुद्ध spermatid आबादी से हल करने के फ्लो में इस्तेमाल gating रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप में, सकारात्मक डीएनए धुंधला के साथ कोशिकाओं (एलेक्सा स्त्राव 488-ए) के पहले आकार बनाम granulosity (एसएससी-ए) दिखा एक डॉट भूखंड पर spermiogenesis से 1. spermatids 1-12 चयन कर रहे हैं कदम गेट (गेट 2) के साथ चुना जाता (एफएससी गेट 1. से ए) फिर, spermiogenesis से spermatids 1-9 कदम और spermiogenesis 10-12 डीएनए धुंधला तीव्रता की भिन्नता के अनुसार एक दूसरे से अलग किया जा सकता कदम (गेट्स 5 और 6)। Spermiogenesis से spermatids 13-14 कदम और 15-16 सीधे डीएनए धुंधला (एलेक्सा स्त्राव 488-ए) बनाम एक डॉट साजिश दिखा आकार (एफएससी-ए) पर सकारात्मक दाग कोशिकाओं से चुने गए हैं (गेट्स 3 और 4)। सभी छाँटे गए आबादी एलेक्सा स्त्राव के साथ नए सिरे से परिभाषित कर रहे हैं 488-W एलेक्सा स्त्राव 488-ए डॉट blots बढ़ाने के लिए बनाम आईआर पवित्रता।

Epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा शुद्धिकरण योजना के मान्यकरण

चित्रा 2 फ्लो द्वारा spermatids की सॉर्ट आबादी के DAPI धुंधला प्रतिनिधित्व करता है। spermiogenesis 1-9 spermatids दौर spermatids और spermiogenesis चरण 9 spermatids की अंडाकार आकार नाभिक के विशिष्ट गोल आकार नाभिक प्रदर्शित कदम। spermiogenesis 10-12 spermatids एक बड़ी हुक के आकार elongating नाभिक दिखाने के कदम। Spermiogenesis 13-14 और 15-16 spermatids एक समान आकार नाभिक है, लेकिन उनके छँटाई अनुमति दी है जो डीएनए धुंधला तीव्रता में से थोड़ा भिन्न कदम। विभिन्न सॉर्ट आबादी के भेदभाव कदम और पवित्रता भी पिछले एक अध्ययन 9 में वर्णित विशिष्ट बायोमार्कर का उपयोग कर पता लगाया गया था। सॉर्ट spermatid आबादी की शुद्धता तालिका 1 में दिखाया गया है।

1 ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "तम्बू आकृति 1
1. विस्तृत gating रणनीति ultrapure spermatid आबादी से हल करने के चित्रा। Spermiogenesis तरह से इस्तेमाल gating रणनीति की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, 1-9 spermatids कदम 10-12 spermatids कदम, 13-14 spermatids कदम और एक 488 एनएम के साथ 14-16 spermatids एक साथ कदम लेजर से सुसज्जित सेल सॉर्टर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. epifluorescence के अनुसार क्रमबद्ध spermatids के दृश्य। छाँटे spermatids DAPI के साथ दाग, खुर्दबीन स्लाइड पर cytospined और DAPI के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कल्पना और एक सीसीडी सीए के साथ लैस कर रहे हैंमेरा। प्रकोष्ठों उल्टे ग्रे स्केल में दिखाए जाते हैं। बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल प्रकार बहुमत में मनाया पवित्रता कोशिकाओं की अनुमानित संख्या (8 घंटा छँटाई) Contaminants
जनसंख्या 1 1-9 spermatids कदम 99-100% 4000000 10 spermatids कदम
जनसंख्या 2 10-12 spermatids कदम 95-98% 1000000 Spermatocytes
पीopulation 3 13-14 spermatids कदम 99-100% 800,000 Spermatocytes, 1-9 spermatids कदम
जनसंख्या 4 15-16 spermatids कदम 98-100% 1500000 Spermatocytes

तालिका 1: हल से spermatid आबादी और उनके दूषित पदार्थों को।

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Discussion

Spermatogenic कोशिकाओं को हमेशा वीर्योत्पादक उपकला की जटिलता, साथ ही इन विट्रो संस्कृति की सीमित सफलता दिए गए अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहे हैं। इन वर्षों में, कई दृष्टिकोण विभिन्न प्रजातियों से जनन कोशिकाओं को विकसित किया गया शुद्ध करने के लिए। Percoll या गोजातीय सीरम albumin ढ़ाल के साथ गुरुत्वाकर्षण शुद्धि का उपयोग कर अवसादन तकनीक आमतौर पर बरकरार कीटाणु कोशिकाओं की एक अच्छी उपज प्रदान करते हैं, लेकिन इस तरह के अर्धसूत्रीविभाजनिक टेट्राप्लोइड कोशिकाओं और spermatids 10 के रूप में कुछ प्रकार की कोशिकाओं के बीच उचित परिभाषा की कमी है। इसके अलावा, इन तकनीकों की आवश्यकता बोझिल परीक्षण और त्रुटि के बिना पुन: पेश करने के लिए उन्हें कठिन बना देता है, जो कई प्रयोगशालाओं, के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है कि (अक्सर घर का बना) विशेष उपकरणों। तंत्र आमतौर पर सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, के रूप में इन तरीकों में भी समय लेने वाली है, कंपन करने के लिए बहुत संवेदनशील है और असुविधाजनक हैं। जब सफल, अवसादन तरीकों हालांकि कई लाख शुद्ध लाइव ग प्रदानजनसंख्या प्रति ELLs। हालांकि, प्राप्त किया जा सकता है कि सेल संवर्धन के निम्न स्तर यह शायद ही कभी अधिक से अधिक 80-90% शुद्धता पहुँचता के रूप में इन तकनीकों के मुख्य दोष है। आणविक विश्लेषण करने के लिए एक प्रमुख बाधा का प्रतिनिधित्व करता है जो डीएनए, आरएनए या प्रोटीन सामग्री, से मापा जाता है, जब कुछ मामलों में, अन्य प्रकार की कोशिकाओं से 10-20% की एक संदूषण मौजूद है।

सेल आबादी की शुद्धता में सुधार की मांग करते हैं, कुछ जांचकर्ताओं अन्य तरीकों की गुरुत्वाकर्षण अवसादन संयुक्त है। सबसे प्रभावी तरीकों में से एक बाद के चरणों का प्रतिनिधित्व करने के लिए अलग सेल आबादी की संख्या को सीमित करने के लिए अपरिपक्व चूहों का उपयोग करने के लिए है। एक शुक्राणुजनन की पहली लहर का लाभ उठाने और जन्म के बाद उनके अनुक्रमिक उपस्थिति के आधार पर एक दिया भेदभाव चरण के लिए ऊपर कीटाणु कोशिकाओं से युक्त एक सेल तैयार प्राप्त कर सकते हैं। हालांकि, इस संयुक्त दृष्टिकोण defin की कमी का समाधान नहीं होता अभी तक सामग्री शुरू की सीमित मात्रा के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए और अधिक जानवरों की आवश्यकता है औरअवसादन तरीकों की ition। इसके अलावा, इस तरह के एक दृष्टिकोण व्यावहारिक रूप से इस तरह के spermatids के रूप में बाद में कोशिकाओं प्रकार के लिए लागू नहीं किया जा सकता है, लेकिन spermatogonia और प्राथमिक spermatocyte के लिए मुख्य रूप से प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, शुक्राणुजनन की पहली लहर परिपक्व चूहों 11,12 की साइकिल उपकला की तुलना में थोड़ा अलग गुणों के साथ कोशिकाओं बंदरगाह हो सकता है कि कुछ सबूत नहीं है।

शुक्राणुजनन की विटामिन ए तुल्यकालन भी इस प्रक्रिया का एक इलाज जानवर के वृषण में मौजूद चरणों की संख्या नीचे संकरी रूप में कीटाणु सेल शुद्धि सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, इस प्रक्रिया में मुख्य रूप से चूहों 13,14 की रिपोर्ट में कुछ सफलता के साथ, चूहों में शुक्राणुजनन सिंक्रनाइज़ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हमारे अपने अनुभव से, चूहों में एक तुल्यकालन विटामिन समय लेने वाली है, शायद ही कभी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देता है और वीर्योत्पादक उपकला के सेलुलर अखंडता के बारे में चिंता की परवरिश के हानिकारक साइड इफेक्ट पैदा करता है।

Otheआर समूहों सफलतापूर्वक माउस 15-18 से रोगाणु कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए प्रवाह cytometry इस्तेमाल किया। हालांकि, उनमें से कोई भी गोल spermatids कदम अतीत spermatid आबादी की शुद्धि की सूचना दी। हमारे gating रणनीति आणविक के अध्ययन के लिए उत्तरदायी महत्वपूर्ण भेदभाव कदम का प्रतिनिधित्व चार उच्च शुद्ध अगुणित सेल आबादी को शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है। इस पत्र में वर्णित विधि की मुख्य बाधा हल कोशिकाओं के सीमित उपज हो सकती है। पवित्रता के उच्च स्तर पर कुछ हद तक हल कोशिकाओं की संख्या की कीमत पर प्राप्त की है। हालांकि, हम प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण सलाह जोड़ा, छँटाई शर्तों इष्टतम कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करना। इन सभी तकनीकी सलाह नंबर या छाँटे गए spermatids की शुद्धता या तो बढ़ाने के उद्देश्य। उदाहरण के लिए, बहुत से छंटाई के दौरान नलियों लेपित एफबीएस के उपयोग की नलियों से चिपके रहते हैं कि कोशिकाओं के नुकसान कम हो। इसके अलावा, SYTO16 का उपयोग करते हुए saturating एकाग्रता अधिक स्थिर populat में जिसके परिणामस्वरूप डीएनए धुंधला तीव्रता के रूपांतरों को कम करने में मदद करता हैआयनों FACS भूखंडों और एक 8 घंटा छँटाई अवधि में एक बेहतर उपज और हल spermatids की पवित्रता पर देखा। इसके अलावा, FACS सॉर्टर सेट-अप के लिए प्रदान की तकनीकी सलाह निश्चित रूप से नलियों इकट्ठा करने में सेल मोज़री या पार संक्रमण से बचने के द्वारा छँटाई के समग्र दक्षता बढ़ाने के लिए मदद करते हैं। वैकल्पिक रूप से, फाटकों अंततः कुछ अध्ययनों के लिए स्वीकार्य हो सकता है, जो आबादी पवित्रता में एक छोटी सी कमी, जिसके परिणामस्वरूप में हल कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इसके अलावा, SYTO16 के साथ दाग इथेनॉल तय जनन कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर बहुत स्थिर रहे हैं और सीमित gating के समायोजन और पर्यवेक्षण के साथ अधिक से अधिक 8 घंटे के लिए हल किया जा सकता है। अंत में, छँटाई के कई दिनों के लिए किसी भी आवेदन के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए जमा किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित के रूप में प्राप्त प्रवाह छाँटे गए spermatids प्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन कोशिकाओं से डीएनए आसानी से वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर निकाला और प्रदर्शन किया जा सकतापीसीआर 9 विश्लेषण करती है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (नहीं दिखाया डेटा) के लिए उचित गुणवत्ता का होना। यह भी प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हल से spermatids हम छाँटे गए spermatids के उच्च शुद्धता की पुष्टि करने के लिए मंच-विशिष्ट मार्करों के खिलाफ कई immunoblots प्रदर्शन किया, जहां 9 विश्लेषण करती है। हम सॉर्ट spermatids के सेलुलर अखंडता सत्यापित और सभी आबादी के नाभिक और कोशिका द्रव्य बरकरार रहेगा कि पाया। हालांकि, हम 13-14 spermatids कदम की एक अनुपात और उनके कशाभिका याद कर रहे हैं कदम है कि 15-16 spermatids के एक छोटे अनुपात पाया (डेटा) नहीं दिखाया। इसलिए, अत्यधिक शुद्ध रोगाणु सेल आबादी इस दृष्टिकोण प्रोटिओमिक और जीनोमिक विश्लेषण करती है, साथ ही अन्य अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं का उपयोग कर हल।

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Acknowledgments

लेखकों epifluorescence माइक्रोस्कोपी के बारे में उनकी तकनीकी सलाह के लिए डॉ लियोनिद Volkov और एरिक Bouchard का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

वित्तीय सहायता

जीबी के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान (अनुदान # एमओपी 93,781) की कनाडा संस्थान द्वारा वित्त पोषित

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane ABBOT 05260-05 For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum Wisent 90150 For tube coating
1x PBS
EDTA BioShop EDT For sorting buffer preparation
HEPES Sigma H For sorting buffer preparation
100% Ethanol Les alcools de commerce 092-09-11N For cell fixation
SYTO 16 Life Technologies S7578 DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes BD Falcon 352063 Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes PROgene 1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes PROgene 5000
TEC4 anaesthetic vaporizer Ohmeda 1160526 For mouse euthanasia
CO2 gas tank Praxair C799117902 For mouse euthanasia
O2 gas tank Praxair O254130501 For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer Corning Incorporated 352340
50 μm sample line filters BD Biosciences 649049
Vortex mixer Labnet international, inc. S0200 For cell fixation
Dynac centrifuge Clay Adams 101
Celltrics 50 µm filters Partec 04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter BD Biosciences FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads BD Biosciences 345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 106 शुक्राणुजनन spermiogenesis spermatid सेल छँटाई डीएनए क्रोमेटिन remodeling के प्रवाह cytometry
स्टेप-विशिष्ट माउस spermatids की छंटनी फ्लो द्वारा
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Simard, O., Leduc, F., Acteau, G.,… More

Simard, O., Leduc, F., Acteau, G., Arguin, M., Grégoire, M. C., Brazeau, M. A., Marois, I., Richter, M. V., Boissonneault, G. Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (106), e53379, doi:10.3791/53379 (2015).

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